大鼠肠缺血-再灌注早期多个器官内细胞凋亡的研究
作者：程尉新 金丽娟
单位：程尉新 金丽娟 510515 广州,第一军医大学病理生理教研室
关键词：小肠；缺血-再灌注损伤；细胞凋亡；多器官功能障碍综合征
中华创伤杂志980614 【摘要】 目的 探讨细胞凋亡在多器官功能障碍综合征发病中的作用。方法 夹闭和放松大鼠肠系膜上动脉复制肠缺血-再灌注模型;显微镜检测分别用HE、吖啶橙-溴化乙锭、Gomori银-HE染色的肠、肝、肾组织的连续切片,观察3个器官组织内细胞凋亡的分布及变化;分离缺血-再灌注不同时间组的肝细胞、流式细胞仪检测肝细胞凋亡百分率。结果 (1)大鼠肠缺血-再灌注早期(术后3小时内),肝、肠、肾内凋亡的实质细胞都呈多部位局灶性分布的特点。(2)肝细胞凋亡百分率随缺血-再灌注时间延长而升高(P<0.001),且显著高于假手术组(P<0.001)。结论 肠缺血-再灌注早期多个器官组织内细胞凋亡相当广泛,在多器官功能障碍发病中可能具有重要意义。
, 百拇医药
Study of Apoptosis in Multiple Organs in Rats at Early Stage of Intestinal Ischemia-Reperfusion CHENG Wei-xin, JIN Li-juan. Dept. of Pathophysiology, First Military Medical University, Guangzhou 510515
【Abstract】 Aim To elucidate the probable roles of apoptosis in the pathogenesis of multiple organ dysfunction syndrome. Methods A rat ischemia-reperfusion model reproduced by clipping and releasing the superior mesenteric artery. Microscoping sequential tissue slices of small intestine, liver and kidney were stained with HE, acridine orange and ethidium bromide, or Gormori's silver-HE, respectively. And the percentage of apoptosis in hepatocytes isolated from different ischemia-reperfusion time points using flow cytometry was detected. Results (1) In the early phase of intestinal ischemia-reperfusion (3 hours after operation), apoptotic parenchymal cells in the small intestine, liver and kidney were distributed multifocally. (2) Apoptotic percentages of hepatocytes increased with the time of ischemia-reperfusion (P<0.001), and statistically higher than that of the sham operation groups. Conclusion At the early stage of intestinal ischemia-reperfusion, apoptotic cells in the tissues of multi-organs are very common. And this kind of cell death may play an important role in the pathogenesis of multiple organ dysfunction syndrome.
, 百拇医药
【Key words】 Small intestine Ischemia-reperfusion injury Apoptosis Multiple organ dysfunction syndrome
肠缺血-再灌注是机体遭受严重创伤、烧伤、大手术等刺激后发生较早的病理过程之一。肠系膜上动脉夹闭2小时后再灌注复制大鼠肠缺血-再灌注(RIIR)模型,可引起肝、肠、肾等多个器官的损伤,12小时死亡率达100%[1]。但该模型中器官损伤的机制尚不清楚,各器官组织内细胞凋亡发生的规律及其在器官损伤中的作用也无系统研究。多器官功能障碍综合征(MODS)是严重创伤的常见并发症,为外科ICU的首位死亡原因。有关MODS的大量研究虽然深化了我们对感染、炎症、休克等多种病理生理过程的认识,但至今仍没有找到防治MODS的有效方法,这可能也与研究中忽视了一处新近才被重视的重要生命现象细胞凋亡有关。为此,我们使用RIIR模型,初步观察了肠、肝、肾等器官内细胞凋亡的分布及变化,并在各时间点分离肝细胞,定量分析其中凋亡细胞所占的百分数,试图为研究细胞凋亡在MODS中的作用提供线索。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、动物模型及分组
选用清洁级雄性Wistar大鼠(320～350g,本校实验动物中心提供),肌注盐酸氯胺酮(100mg/kg)麻醉,剑突下腹部中线切口开腹,分离肠系膜上动脉,用无创微血管夹将其夹闭使肠缺血。按设计一定时间后再次麻醉(肌注50mg/kg盐酸氯胺酮)后移除血管夹再灌注。分别于缺血60,120,180分钟及缺血120分钟再灌注15,30,60分钟活杀动物,立即取适量肝、肾、小肠组织固定于10%缓冲甲醛液内,并取肝左外叶置前灌注液中待分离肝细胞。按时间配对的假手术组麻醉、开腹但不夹闭肠系膜上动脉。实验组及假手术组各时间点的动物数均为3只。
二、肝细胞分离
参照王宇明等[2]建立的方法,略加改动:前灌注液中加12.5mmol/L EGTA以阻断分离过程Ca2+、Mg2+可能诱导的细胞死亡,将肝灌注至灰白色,再用含Ca2+、Mg2+的胶原酶浓度为0.02%的灌注液消化2分钟,用10%聚乙烯吡咯烷酮终止消化及防止肝细胞聚集,50g×2分钟离心3次(纯度可达95%以上),80%冷乙醇固定,4℃冰箱保存。
, 百拇医药
三、细胞凋亡检测方法
1.组织切片原位检测:根据本室建立的方法,将常规甲醛固定、石蜡包埋的组织用手摇切片机连续切3张4μm厚的切片,分别用HE、吖啶橙-溴化乙锭荧光染液(含吖啶橙、溴化乙锭各20μg/ml)及Gomori银-HE染色,观察各组大鼠3个器官内凋亡细胞分布及变化。组织切片上凋亡细胞的判定标准:三种染色方法中有一种发现细胞具有细胞体积缩小、细胞质浓缩及嗜酸性增强、细胞核皱缩及染色质浓染、细胞核内染色质呈半月状聚集、细胞质或核出芽等特征中的一项即判定为凋亡细胞。
2.肝细胞流式细胞仪检测
参照Nicoletti等[3]介绍的方法,取约2×106/ml肝细胞1ml,50g×2分钟离心,PBS洗2次,重悬在0.5mlRNA酶(1mg/ml PBS容液)中,混匀,再加1ml PI(100μg/ml的PBS溶液),室温下置暗处15分钟,在4℃冰箱保存至检测。细胞以160个/s的速度通过检测器,每次至少分析5 000个细胞,检测时适当提高前散域以排除细胞碎片对分析的影响。所有实验均按同一设置进行测量,用Coulter公司专门软件分析,PMT4检测到的肝细胞内荧光强度小于259±1定为凋亡细胞。
, 百拇医药
四、统计学处理
所有数据均以
±s表示,根据设计在Windows95下用SPSS软件包的General factorial程序进行方差分析,方差分析后的多重比较用Scheffe检验进行,P<0.05定为显著标准。
结 果
一、肝、肾及小肠组织的显微镜观察
正常组大鼠肝、肠、肾内就可观察到一定量的凋亡细胞,RIIR早期3个器官内检测到的凋亡细胞进行性增多,各组大鼠3个器官内凋亡细胞的分布具有共同特征:凋亡的肝细胞主要分布在肝小叶中央静脉周围(图1);肾小管上皮细胞凋亡主要发生在肾脏皮质与髓质交界处的外髓带、皮质乳头内的肾小管(图2);小肠对肠系膜缘肠壁内粘膜上皮细胞凋亡百分率明显高于肠系膜缘肠壁(图3)。
, http://www.100md.com
图1 肠缺血120分钟组大鼠肝小叶(Gomori银-HE ×200) △:凋亡细胞
图2 肠缺血120分钟/再灌注60分钟组大鼠肾组织
(吖啶橙-溴化乙锭荧光染色 ×200) 左侧为外髓带,△:凋亡细胞
图3 肠缺血120分钟组大鼠小肠,上侧示对肠系膜缘肠壁,下侧示肠系膜缘肠壁,注意对比两者肠粘膜上皮细胞损伤程度
二、肝细胞凋亡百分率的变化
方差分析表明,实验组肝细胞凋亡百分率显著高于假手术组(P<0.001);肝细胞凋亡百分率在不同时间点间比较也有显著差异(P<0.001);两组间与时间点间有交互作用(这说明实验组肝细胞凋亡百分率增加速率显著高于假手术组,P<0.001)。组内各时间点间比较见图4。
, 百拇医药
图4 流式细胞仪检测细胞凋亡百分率的变化
SHAM:假手术组,ISCH:单纯缺血组,IIAR:缺血120分钟后再灌注组。a,b,c,d,e,分别表示与组内0/0,60/0,120/0,120/15,120/30比较,P<0.05
讨 论
细胞凋亡是Kerr[4]根据大鼠门静脉结扎实验首先提出的,由于它是一种生理及病理情况下普遍存在的现象,在生物学研究的各个领域都受到重视,细胞凋亡在MODS发生中的作用的种种假说也相继提出[5，6]。通过夹闭或放松肠系膜上动脉诱导MODS,不但简单确实,而且可以模拟创伤,休克、感染等临床情况,已被用来研究内毒素血症、中性粒细胞、TNF等在MODS发生中的作用,但研究该模型各器官内细胞凋亡的报道较少。笔者采用多种检测方法表明,大鼠肠缺血2小时再灌注1小时内,肝、肠、肾等器官内的细胞凋亡的发生就相当广泛,在肝脏中所占比例最高可达40%以上(图4),提示组织器官内实质细胞的凋亡在MODS发生中可能具有重要作用。组织切片用HE、吖啶橙-溴化乙锭荧光染液、Gomori银染色后显微镜检测均提示,RIIR早期,各器官内细胞凋亡的分布具有明确特征:肝小叶中央静脉周围、肠系膜缘肠壁上的小肠粘膜、肾脏外髓内的肾小管等容易受缺氧损伤或血供相对较差的区域,凋亡细胞分布较密集(图1～3)。所以,RIIR早期的凋亡细胞增多可能与多部位局灶性缺血缺氧有关。本实验显示,肝细胞凋亡百分率随肠缺血-再灌注损伤程度加重而升高,显著高于假手术组(P<0.001,图4),提示肠缺血-再灌注损伤是多个器官内细胞凋亡的引发因素。肠缺血再灌注后很快即可观察到多个器官内局灶性细胞凋亡的增多,而且所占比例相当高。因此可以推想,选择性地诱导部分区域内的细胞凋亡可能是机体在长期适应中形成的对应激刺激的一种反应。刺激过强引起凋亡细胞过多或增加过快,可能在引发SIRS/MODS中具有重要作用。
, 百拇医药
本课题受全军“九五”医药卫生指令性研究课题基金资助
参考文献
[1]Oldham KT, Guice KS, Turnage RH, et al. The systemic consequences of intestinal ischemia/reperfusion injury. J Vasc Surg, 1993, 18∶136-137.
[2]王宇明,陈国致,董家鸿,等.分离肝细胞的一种体外灌流法.中华消化杂志, 1994, 14∶175-176.
[3]Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, et al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Meth, 1991, 139∶271-279.
, http://www.100md.com
[4]Kerr JFA. Shrinkage necrosis: A distinct mode of cellular death. J Path, 1971, 105∶13-20.
[5]Goris RJA. MODS/SIRS: Result of an overwhelming inflammatory response World J Surg, 1996, 20∶418-421.
[6]Bone RC, Isaac N. Sepsis, SIRS and CARS. Crit Care Med, 1996, 24∶1125-1129.
(收稿:1997-08-07 修回:1998-06-10), 百拇医药
单位：程尉新 金丽娟 510515 广州,第一军医大学病理生理教研室
关键词：小肠；缺血-再灌注损伤；细胞凋亡；多器官功能障碍综合征
中华创伤杂志980614 【摘要】 目的 探讨细胞凋亡在多器官功能障碍综合征发病中的作用。方法 夹闭和放松大鼠肠系膜上动脉复制肠缺血-再灌注模型;显微镜检测分别用HE、吖啶橙-溴化乙锭、Gomori银-HE染色的肠、肝、肾组织的连续切片,观察3个器官组织内细胞凋亡的分布及变化;分离缺血-再灌注不同时间组的肝细胞、流式细胞仪检测肝细胞凋亡百分率。结果 (1)大鼠肠缺血-再灌注早期(术后3小时内),肝、肠、肾内凋亡的实质细胞都呈多部位局灶性分布的特点。(2)肝细胞凋亡百分率随缺血-再灌注时间延长而升高(P<0.001),且显著高于假手术组(P<0.001)。结论 肠缺血-再灌注早期多个器官组织内细胞凋亡相当广泛,在多器官功能障碍发病中可能具有重要意义。
, 百拇医药
Study of Apoptosis in Multiple Organs in Rats at Early Stage of Intestinal Ischemia-Reperfusion CHENG Wei-xin, JIN Li-juan. Dept. of Pathophysiology, First Military Medical University, Guangzhou 510515
【Abstract】 Aim To elucidate the probable roles of apoptosis in the pathogenesis of multiple organ dysfunction syndrome. Methods A rat ischemia-reperfusion model reproduced by clipping and releasing the superior mesenteric artery. Microscoping sequential tissue slices of small intestine, liver and kidney were stained with HE, acridine orange and ethidium bromide, or Gormori's silver-HE, respectively. And the percentage of apoptosis in hepatocytes isolated from different ischemia-reperfusion time points using flow cytometry was detected. Results (1) In the early phase of intestinal ischemia-reperfusion (3 hours after operation), apoptotic parenchymal cells in the small intestine, liver and kidney were distributed multifocally. (2) Apoptotic percentages of hepatocytes increased with the time of ischemia-reperfusion (P<0.001), and statistically higher than that of the sham operation groups. Conclusion At the early stage of intestinal ischemia-reperfusion, apoptotic cells in the tissues of multi-organs are very common. And this kind of cell death may play an important role in the pathogenesis of multiple organ dysfunction syndrome.
, 百拇医药
【Key words】 Small intestine Ischemia-reperfusion injury Apoptosis Multiple organ dysfunction syndrome
肠缺血-再灌注是机体遭受严重创伤、烧伤、大手术等刺激后发生较早的病理过程之一。肠系膜上动脉夹闭2小时后再灌注复制大鼠肠缺血-再灌注(RIIR)模型,可引起肝、肠、肾等多个器官的损伤,12小时死亡率达100%[1]。但该模型中器官损伤的机制尚不清楚,各器官组织内细胞凋亡发生的规律及其在器官损伤中的作用也无系统研究。多器官功能障碍综合征(MODS)是严重创伤的常见并发症,为外科ICU的首位死亡原因。有关MODS的大量研究虽然深化了我们对感染、炎症、休克等多种病理生理过程的认识,但至今仍没有找到防治MODS的有效方法,这可能也与研究中忽视了一处新近才被重视的重要生命现象细胞凋亡有关。为此,我们使用RIIR模型,初步观察了肠、肝、肾等器官内细胞凋亡的分布及变化,并在各时间点分离肝细胞,定量分析其中凋亡细胞所占的百分数,试图为研究细胞凋亡在MODS中的作用提供线索。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、动物模型及分组
选用清洁级雄性Wistar大鼠(320～350g,本校实验动物中心提供),肌注盐酸氯胺酮(100mg/kg)麻醉,剑突下腹部中线切口开腹,分离肠系膜上动脉,用无创微血管夹将其夹闭使肠缺血。按设计一定时间后再次麻醉(肌注50mg/kg盐酸氯胺酮)后移除血管夹再灌注。分别于缺血60,120,180分钟及缺血120分钟再灌注15,30,60分钟活杀动物,立即取适量肝、肾、小肠组织固定于10%缓冲甲醛液内,并取肝左外叶置前灌注液中待分离肝细胞。按时间配对的假手术组麻醉、开腹但不夹闭肠系膜上动脉。实验组及假手术组各时间点的动物数均为3只。
二、肝细胞分离
参照王宇明等[2]建立的方法,略加改动:前灌注液中加12.5mmol/L EGTA以阻断分离过程Ca2+、Mg2+可能诱导的细胞死亡,将肝灌注至灰白色,再用含Ca2+、Mg2+的胶原酶浓度为0.02%的灌注液消化2分钟,用10%聚乙烯吡咯烷酮终止消化及防止肝细胞聚集,50g×2分钟离心3次(纯度可达95%以上),80%冷乙醇固定,4℃冰箱保存。
, 百拇医药
三、细胞凋亡检测方法
1.组织切片原位检测:根据本室建立的方法,将常规甲醛固定、石蜡包埋的组织用手摇切片机连续切3张4μm厚的切片,分别用HE、吖啶橙-溴化乙锭荧光染液(含吖啶橙、溴化乙锭各20μg/ml)及Gomori银-HE染色,观察各组大鼠3个器官内凋亡细胞分布及变化。组织切片上凋亡细胞的判定标准:三种染色方法中有一种发现细胞具有细胞体积缩小、细胞质浓缩及嗜酸性增强、细胞核皱缩及染色质浓染、细胞核内染色质呈半月状聚集、细胞质或核出芽等特征中的一项即判定为凋亡细胞。
2.肝细胞流式细胞仪检测
参照Nicoletti等[3]介绍的方法,取约2×106/ml肝细胞1ml,50g×2分钟离心,PBS洗2次,重悬在0.5mlRNA酶(1mg/ml PBS容液)中,混匀,再加1ml PI(100μg/ml的PBS溶液),室温下置暗处15分钟,在4℃冰箱保存至检测。细胞以160个/s的速度通过检测器,每次至少分析5 000个细胞,检测时适当提高前散域以排除细胞碎片对分析的影响。所有实验均按同一设置进行测量,用Coulter公司专门软件分析,PMT4检测到的肝细胞内荧光强度小于259±1定为凋亡细胞。
, 百拇医药
四、统计学处理
所有数据均以
±s表示,根据设计在Windows95下用SPSS软件包的General factorial程序进行方差分析,方差分析后的多重比较用Scheffe检验进行,P<0.05定为显著标准。结 果
一、肝、肾及小肠组织的显微镜观察
正常组大鼠肝、肠、肾内就可观察到一定量的凋亡细胞,RIIR早期3个器官内检测到的凋亡细胞进行性增多,各组大鼠3个器官内凋亡细胞的分布具有共同特征:凋亡的肝细胞主要分布在肝小叶中央静脉周围(图1);肾小管上皮细胞凋亡主要发生在肾脏皮质与髓质交界处的外髓带、皮质乳头内的肾小管(图2);小肠对肠系膜缘肠壁内粘膜上皮细胞凋亡百分率明显高于肠系膜缘肠壁(图3)。
, http://www.100md.com
图1 肠缺血120分钟组大鼠肝小叶(Gomori银-HE ×200) △:凋亡细胞
图2 肠缺血120分钟/再灌注60分钟组大鼠肾组织
(吖啶橙-溴化乙锭荧光染色 ×200) 左侧为外髓带,△:凋亡细胞
图3 肠缺血120分钟组大鼠小肠,上侧示对肠系膜缘肠壁,下侧示肠系膜缘肠壁,注意对比两者肠粘膜上皮细胞损伤程度
二、肝细胞凋亡百分率的变化
方差分析表明,实验组肝细胞凋亡百分率显著高于假手术组(P<0.001);肝细胞凋亡百分率在不同时间点间比较也有显著差异(P<0.001);两组间与时间点间有交互作用(这说明实验组肝细胞凋亡百分率增加速率显著高于假手术组,P<0.001)。组内各时间点间比较见图4。
, 百拇医药
图4 流式细胞仪检测细胞凋亡百分率的变化
SHAM:假手术组,ISCH:单纯缺血组,IIAR:缺血120分钟后再灌注组。a,b,c,d,e,分别表示与组内0/0,60/0,120/0,120/15,120/30比较,P<0.05
讨 论
细胞凋亡是Kerr[4]根据大鼠门静脉结扎实验首先提出的,由于它是一种生理及病理情况下普遍存在的现象,在生物学研究的各个领域都受到重视,细胞凋亡在MODS发生中的作用的种种假说也相继提出[5，6]。通过夹闭或放松肠系膜上动脉诱导MODS,不但简单确实,而且可以模拟创伤,休克、感染等临床情况,已被用来研究内毒素血症、中性粒细胞、TNF等在MODS发生中的作用,但研究该模型各器官内细胞凋亡的报道较少。笔者采用多种检测方法表明,大鼠肠缺血2小时再灌注1小时内,肝、肠、肾等器官内的细胞凋亡的发生就相当广泛,在肝脏中所占比例最高可达40%以上(图4),提示组织器官内实质细胞的凋亡在MODS发生中可能具有重要作用。组织切片用HE、吖啶橙-溴化乙锭荧光染液、Gomori银染色后显微镜检测均提示,RIIR早期,各器官内细胞凋亡的分布具有明确特征:肝小叶中央静脉周围、肠系膜缘肠壁上的小肠粘膜、肾脏外髓内的肾小管等容易受缺氧损伤或血供相对较差的区域,凋亡细胞分布较密集(图1～3)。所以,RIIR早期的凋亡细胞增多可能与多部位局灶性缺血缺氧有关。本实验显示,肝细胞凋亡百分率随肠缺血-再灌注损伤程度加重而升高,显著高于假手术组(P<0.001,图4),提示肠缺血-再灌注损伤是多个器官内细胞凋亡的引发因素。肠缺血再灌注后很快即可观察到多个器官内局灶性细胞凋亡的增多,而且所占比例相当高。因此可以推想,选择性地诱导部分区域内的细胞凋亡可能是机体在长期适应中形成的对应激刺激的一种反应。刺激过强引起凋亡细胞过多或增加过快,可能在引发SIRS/MODS中具有重要作用。
, 百拇医药
本课题受全军“九五”医药卫生指令性研究课题基金资助
参考文献
[1]Oldham KT, Guice KS, Turnage RH, et al. The systemic consequences of intestinal ischemia/reperfusion injury. J Vasc Surg, 1993, 18∶136-137.
[2]王宇明,陈国致,董家鸿,等.分离肝细胞的一种体外灌流法.中华消化杂志, 1994, 14∶175-176.
[3]Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, et al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Meth, 1991, 139∶271-279.
, http://www.100md.com
[4]Kerr JFA. Shrinkage necrosis: A distinct mode of cellular death. J Path, 1971, 105∶13-20.
[5]Goris RJA. MODS/SIRS: Result of an overwhelming inflammatory response World J Surg, 1996, 20∶418-421.
[6]Bone RC, Isaac N. Sepsis, SIRS and CARS. Crit Care Med, 1996, 24∶1125-1129.
(收稿:1997-08-07 修回:1998-06-10), 百拇医药