胃肠道平滑肌肿瘤nm23表达与细胞增殖活性关系的研究
作者：王强 孙威 赵毅 王明德 秦晔 傅义刚
单位：110003 沈阳，中国医科大学第二临床学院外科(王强、孙威、赵毅、王明德)；辽宁省中医学院外科(秦晔)；营口市中心医院外科(傅义刚)
关键词：胃肠肿瘤；平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；基因表达；细胞增殖活性
中华外科杂志/980715 【摘要】 目的 探讨nm23表达与胃肠道平滑肌肿瘤(GISMT)良恶性、恶性程度、转移、预后及细胞增殖活性的关系。 方法 采用免疫组化法检测86例GISMT患者nm23的表达情况，采用胶银染色法及免疫组化法检测核仁组成区嗜银蛋白(AgNORs)、增殖细胞核抗原(PCNA)来反映细胞的增殖活性。 结果 nm23的表达按平滑肌瘤、低度恶性平滑肌肉瘤、高度恶性平滑肌肉瘤的顺序依次明显下降(P<0.01)。nm23表达与肿瘤的良恶性生长方式、大小、中心有无坏死亦有明显的关系(P<0.01或P<0.05)。nm23阳性表达组的5年生存率明显高于阴性表达组(P<0.05)。nm23阴性组的AgNORs和PCNA表达明显高于nm23阳性表达组(P<0.01)。 结论 nm23是反映GISMT生物学特性的良好标志物，与AgNORs、PCNA可互补作为判断GISMT良恶性、恶性程度、转移及预后的客观指标。
, 百拇医药
Expression of nm23 in gastrointestinal smooth muscle tumors and its relation to cell proliferative activity Wang Qiang,Sun Wei,Zhao Yi,et al. Department of Surgery,Second Affiliated Hospital，China Medical University, Shengyang 110003.
【Abstract】 Objective To determine the relationship between nm23 expression and benign or malignant degree, metastasis, prognosis and cell proliferative activity of gastrointestinal smooth muscle tumors(GISMT). Method 86 cases of GISMT were studied, and nm23 was detected by the immunohistochemical staining S-P method. The cell proliferative activity was evaluated by the silver colloid method for argyrophilic nucleolar organizer regions proteins(AgNORs) and by the immunohistochemical staining S-P method for proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Result The expression of nm23 declined significantly according to the following order:leiomyomas,low malignant leiomyosarcomas,high malignant leiomyosarcomas(P<0.01). The expression of nm23 was associated with the tumors with or without contiguous organ invasion or distant metastasis, the size of tumors, the tumors with or without center necrosis(P<0.01 or P<0.05). The five-year survival rate was significantly higher in patients with nm23 positive expression than that with nm23 negative expression(P<0.05). The expression of AgNORs and PCNA with nm23 negative cases was obviously higher than that with nm23 positive cases (P<0.01). Conclusion nm23 is a valuable indicator for the biological characteristics of GISMT. nm23 expression and cell proliferative activity can supply a deficiency each other in distingushing malignant from benign tumors, judging the malignant degree, and predicting the prognosis of the patients with GISMT.
, 百拇医药
【Key words】 Gastrointestinal neoplasms Leiomyoma Leiomyosarcoma Gene expression Cell proliferative activity
我们应用免疫组织化学链菌素亲生物素-过氧化物酶(S-P)法检测了86例患者胃肠道平滑肌肿瘤(gastrointestinal smooth muscle tumors,GISMT)中nm23的表达情况，并结合临床病理、预后指标及反映细胞增殖活性的指标核仁组成区嗜银蛋白(AgNORs)、增殖细胞核抗原(PCNA)进行综合分析，以探讨其临床病理及预后价值。
资料与方法
1.临床资料：从我院1977年～1996年行手术切除的GISMT患者中选择诊断明确、病历完整者86例。其中男性49例，女性37例。年龄1～77岁,平均48.6岁。肿瘤发生于食管11例、胃30例、小肠27例、结直肠18例。平滑肌瘤(LM)与平滑肌肉瘤(LS)的区分以及LS组织学分级参考Evans[1]的标准。其中LM 25例,低度恶性LS(LMLS)46例,高度恶性LS(HMLS)15例。按蔡建辉等[2]的方法进行大体病理分组，其中恶性生长方式40例，良性生长方式46例。肿瘤直径在0.3～5.9 cm之间者38例,6.0～10.0 cm之间者25例，大于10.0 cm者23例。肿瘤中心有坏死者41例，无坏死者45例。本组86例GISMT患者中，除3例因其它原因死亡外,其余83例随访资料完整，随访时间为12个月～242个月,平均58个月。将所有患者的肿瘤标本经10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，常规连续切片，切片厚度4 μm，分别做免疫组化、胶银染色。
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2.试剂：抗人nm23单克隆抗体、抗人PCNA单克隆抗体PC10、生物素标记二抗(北京中山生物技术有限公司提供)，S-P试剂盒(ZYMED公司产品)。
3.染色方法：nm23、PCNA染色采用免疫组化S-P法。AgNORs染色采用胶银染色法。
4.结果判断：nm23染色判断标准：(1)按切片中细胞显色有无及深浅记分：0分,细胞无显色；1分，细胞显色为浅黄色；2分，细胞显色为棕黄色；3分,细胞显色为棕褐色。(2)按切片中显色细胞的比例记分：1分，1/3以下肿瘤细胞显色；2分，1/3～2/3肿瘤细胞显色；3分，2/3以上肿瘤细胞显色。每例肿瘤积分＝A×B,按积分高低分为:“阴性”(-)，积分为0分；“弱阳性”(+),积分1～4分；“强阳性”()，积分>4分。AgNORs染色判断标准：在油镜下每例标本随机计数100个细胞核内的AgNORs颗粒，包括主核仁内的单个银染颗粒和散在的卫星颗粒，同时描述颗粒的形状、大小以及在核内的分布情况。染色结果以每个细胞核内AgNORs颗粒均数来表示。PCNA染色判断标准:以细胞核呈棕红色或细胞核、细胞浆同时呈棕红色为阳性，单纯细胞浆着色而细胞核无着色、或细胞核、细胞浆均无着色为阴性。选择PCNA标记良好的区域在400倍显微镜下任选5个高倍视野，计数1000个细胞。PCNA标记值(PCNA-LI)＝阳性细胞数/1000×100%。
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5.统计学处理：本组资料数据采用χ2检验、t检验。患者生存率分析采用Kaplan-Meire寿命表法及Long-rank检验。
结果
1.nm23表达与GISMT临床病理特征的关系:
从LM、LMLS到HMLS，其nm23阳性表达率依次递减，各组间比较差异有极显著性意义(P<0.01)。此外,nm23阳性表达率与肿瘤生长方式、肿瘤大小、肿瘤中心有无坏死，亦有明显的关系，各组间比较差异均有显著性意义(P<0.01或P<0.05)，见附表。
附表 nm23表达与GISMT临床病理特征的关系 临床病理特征
例数
nm23表达
, 百拇医药
P值
-
+
++
阳性率(%)
分类分级
LM
25
0
16
9
100.00
LMLS
, http://www.100md.com 46
19
23
4
58.70
<0.01
HMLS
15
14
1
0
6.67
生长方式
良性
, 百拇医药
46
4
29
13
91.30
恶性
40
29
11
0
27.50
<0.01
肿瘤直经(cm)
, 百拇医药
0.3～5.9
38
4
25
9
89.47
6.0～10.0
25
10
11
4
60.00
<0.05
, http://www.100md.com
>10.0
23
19
4
0
17.39
肿瘤中心坏死
无
45
8
25
12
82.22
, 百拇医药 有
41
25
15
1
39.02
<0.01
2.nm23表达与GISMT患者预后的关系:nm23阴性组的5年累积生存率为46.31%,而nm23阳性表达者的5年累积生存率为81.53%,两组患者生存率差异有显著性意义(P<0.05)。
3.nm23表达与AgNORs、PCNA表达之间的关系(±s):nm23阴性组的AgNORs颗粒均数为6.02±1.78/核,阳性表达组的AgNORs颗粒均数为3.52±1.79/核，两组间差异有极显著性意义(P<0.01)。 nm23阴性组的PCNA-LI为21.93±8.57,阳性表达组的PCNA-LI为10.65±6.13,两组间差异有极显著性意义(P<0.01)。
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讨论
大量实验表明nm23基因参与抑制肿瘤的形成和转移，支持nm23基因是肿瘤转移抑制基因的论点。对人体肿瘤研究发现，在乳腺癌、恶性黑色素瘤、肝癌等肿瘤中nm23的低表达与高转移潜能和预后不良有关[3]。但也有人发现nm23的低表达与乳腺癌的转移无任何关系[4]。在肺癌、大肠癌、甲状腺癌中，不论转移潜能高低nm23表达均有增强，推测这可能是由于nm23基因突变所致[5～7]。
本研究结果显示：nm23基因产物在LM中阳性表达率为100%，在LS中阳性表达率为45.9%，两者间差异有极显著性意义(P<0.01);随着LS恶性程度的增高,nm23的阳性表达率逐渐下降;肿瘤侵袭周围脏器或有腹腔种植及远处转移，肿瘤体积较大或肿瘤中心有坏死时，nm23的阳性表达率也均有明显的降低。说明nm23基因在GISMT的发生、发展、良性向恶性转变、恶性程度增高、复发及转移过程中起着非常重要的作用。因此,可将其作为判断GISMT良恶性、恶性程度、复发及转移的一项参考指标。我们根据完整的随访资料发现,GISMT患者术后长期生存率与原发灶中nm23的表达水平呈正相关,说明亦可将其作为判断GISMT患者预后的参考指标。
, 百拇医药
AgNORs、PCNA均为反映细胞增殖活性的指标。有研究表明：AgNORs、PCNA表达与GISMT的良恶性、恶性程度、转移及预后有一定的相关性[8]。本研究结果显示：nm23阴性的GISMT患者其AgNORs、PCNA表达均明显高于阳性者，说明nm23具有对细胞增殖的负性调控作用，但其具体机制有待于进一步研究。nm23一旦发生缺失,将有可能导致细胞的恶性增殖,在机能代谢和分化程度上表现为由量变到质变的发展。因此，可以认为nm23阴性而AgNORs、PCNA高表达的GISMT恶性程度高、预后差。
参考文献
1Evans HL. Smooth muscle tumors of the gastrointestinal tract: a study of 56 cases followed for a minimum of 10 years.Cancer,1985,56:2242-2250.
, http://www.100md.com
2蔡建辉,蒋贻康,张玉印,等. 胃肠道平滑肌肿瘤DNA含量与临床病理的关系.中华病理学杂志,1995,24:378-380.
3刘宝瑞,张学庸.转移抑制基因nm23研究进展.国外医学生理、病理科学与临床分册,1994,14:65-66.
4Royds JA,Stephenson TJ,Rees RC,et al.nm23 protein in ductal in situ and invasive human breast cancer. J Natl Cancer Inst,1993,85:727-731.
5Higashiyama M, Doi O, Yokouchi H, et al. Immunohistochemical analysis of nm23 gene product/NDP kinase expression in pulmonary adenocarcinoma:lack of prognostic value.Br J Cancer,1992,66:533-536.
, 百拇医药
6Haut M,Steeg PS,Wilison JKV,et al. Induction of nm23 gene expression in human colonic neoplasms and equal expression in colon tumors of high and low metastatic potential.J Natl Cancer Inst,1991,83:712-716.
7Zou M,Shi Y,Al-Sedairy S,et al.High levels of nm23 gene expression in advanced stage of thyroid carcinomas.Br J Cancer,1993,68:385-388.
8Yu CC,Fletcher CD,Newman PL,et al. A comparison of proliferative cell nuclear antigen (PCNA) immunostaining,nucleolar organizer region (AgNOR) staining,and histological grading in gastrointestinal stromal tumours. J Pathol,1992,166:147-152., http://www.100md.com
单位：110003 沈阳，中国医科大学第二临床学院外科(王强、孙威、赵毅、王明德)；辽宁省中医学院外科(秦晔)；营口市中心医院外科(傅义刚)
关键词：胃肠肿瘤；平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；基因表达；细胞增殖活性
中华外科杂志/980715 【摘要】 目的 探讨nm23表达与胃肠道平滑肌肿瘤(GISMT)良恶性、恶性程度、转移、预后及细胞增殖活性的关系。 方法 采用免疫组化法检测86例GISMT患者nm23的表达情况，采用胶银染色法及免疫组化法检测核仁组成区嗜银蛋白(AgNORs)、增殖细胞核抗原(PCNA)来反映细胞的增殖活性。 结果 nm23的表达按平滑肌瘤、低度恶性平滑肌肉瘤、高度恶性平滑肌肉瘤的顺序依次明显下降(P<0.01)。nm23表达与肿瘤的良恶性生长方式、大小、中心有无坏死亦有明显的关系(P<0.01或P<0.05)。nm23阳性表达组的5年生存率明显高于阴性表达组(P<0.05)。nm23阴性组的AgNORs和PCNA表达明显高于nm23阳性表达组(P<0.01)。 结论 nm23是反映GISMT生物学特性的良好标志物，与AgNORs、PCNA可互补作为判断GISMT良恶性、恶性程度、转移及预后的客观指标。
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Expression of nm23 in gastrointestinal smooth muscle tumors and its relation to cell proliferative activity Wang Qiang,Sun Wei,Zhao Yi,et al. Department of Surgery,Second Affiliated Hospital，China Medical University, Shengyang 110003.
【Abstract】 Objective To determine the relationship between nm23 expression and benign or malignant degree, metastasis, prognosis and cell proliferative activity of gastrointestinal smooth muscle tumors(GISMT). Method 86 cases of GISMT were studied, and nm23 was detected by the immunohistochemical staining S-P method. The cell proliferative activity was evaluated by the silver colloid method for argyrophilic nucleolar organizer regions proteins(AgNORs) and by the immunohistochemical staining S-P method for proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Result The expression of nm23 declined significantly according to the following order:leiomyomas,low malignant leiomyosarcomas,high malignant leiomyosarcomas(P<0.01). The expression of nm23 was associated with the tumors with or without contiguous organ invasion or distant metastasis, the size of tumors, the tumors with or without center necrosis(P<0.01 or P<0.05). The five-year survival rate was significantly higher in patients with nm23 positive expression than that with nm23 negative expression(P<0.05). The expression of AgNORs and PCNA with nm23 negative cases was obviously higher than that with nm23 positive cases (P<0.01). Conclusion nm23 is a valuable indicator for the biological characteristics of GISMT. nm23 expression and cell proliferative activity can supply a deficiency each other in distingushing malignant from benign tumors, judging the malignant degree, and predicting the prognosis of the patients with GISMT.
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【Key words】 Gastrointestinal neoplasms Leiomyoma Leiomyosarcoma Gene expression Cell proliferative activity
我们应用免疫组织化学链菌素亲生物素-过氧化物酶(S-P)法检测了86例患者胃肠道平滑肌肿瘤(gastrointestinal smooth muscle tumors,GISMT)中nm23的表达情况，并结合临床病理、预后指标及反映细胞增殖活性的指标核仁组成区嗜银蛋白(AgNORs)、增殖细胞核抗原(PCNA)进行综合分析，以探讨其临床病理及预后价值。
资料与方法
1.临床资料：从我院1977年～1996年行手术切除的GISMT患者中选择诊断明确、病历完整者86例。其中男性49例，女性37例。年龄1～77岁,平均48.6岁。肿瘤发生于食管11例、胃30例、小肠27例、结直肠18例。平滑肌瘤(LM)与平滑肌肉瘤(LS)的区分以及LS组织学分级参考Evans[1]的标准。其中LM 25例,低度恶性LS(LMLS)46例,高度恶性LS(HMLS)15例。按蔡建辉等[2]的方法进行大体病理分组，其中恶性生长方式40例，良性生长方式46例。肿瘤直径在0.3～5.9 cm之间者38例,6.0～10.0 cm之间者25例，大于10.0 cm者23例。肿瘤中心有坏死者41例，无坏死者45例。本组86例GISMT患者中，除3例因其它原因死亡外,其余83例随访资料完整，随访时间为12个月～242个月,平均58个月。将所有患者的肿瘤标本经10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，常规连续切片，切片厚度4 μm，分别做免疫组化、胶银染色。
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2.试剂：抗人nm23单克隆抗体、抗人PCNA单克隆抗体PC10、生物素标记二抗(北京中山生物技术有限公司提供)，S-P试剂盒(ZYMED公司产品)。
3.染色方法：nm23、PCNA染色采用免疫组化S-P法。AgNORs染色采用胶银染色法。
4.结果判断：nm23染色判断标准：(1)按切片中细胞显色有无及深浅记分：0分,细胞无显色；1分，细胞显色为浅黄色；2分，细胞显色为棕黄色；3分,细胞显色为棕褐色。(2)按切片中显色细胞的比例记分：1分，1/3以下肿瘤细胞显色；2分，1/3～2/3肿瘤细胞显色；3分，2/3以上肿瘤细胞显色。每例肿瘤积分＝A×B,按积分高低分为:“阴性”(-)，积分为0分；“弱阳性”(+),积分1～4分；“强阳性”()，积分>4分。AgNORs染色判断标准：在油镜下每例标本随机计数100个细胞核内的AgNORs颗粒，包括主核仁内的单个银染颗粒和散在的卫星颗粒，同时描述颗粒的形状、大小以及在核内的分布情况。染色结果以每个细胞核内AgNORs颗粒均数来表示。PCNA染色判断标准:以细胞核呈棕红色或细胞核、细胞浆同时呈棕红色为阳性，单纯细胞浆着色而细胞核无着色、或细胞核、细胞浆均无着色为阴性。选择PCNA标记良好的区域在400倍显微镜下任选5个高倍视野，计数1000个细胞。PCNA标记值(PCNA-LI)＝阳性细胞数/1000×100%。
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5.统计学处理：本组资料数据采用χ2检验、t检验。患者生存率分析采用Kaplan-Meire寿命表法及Long-rank检验。
结果
1.nm23表达与GISMT临床病理特征的关系:
从LM、LMLS到HMLS，其nm23阳性表达率依次递减，各组间比较差异有极显著性意义(P<0.01)。此外,nm23阳性表达率与肿瘤生长方式、肿瘤大小、肿瘤中心有无坏死，亦有明显的关系，各组间比较差异均有显著性意义(P<0.01或P<0.05)，见附表。
附表 nm23表达与GISMT临床病理特征的关系 临床病理特征
例数
nm23表达
, 百拇医药
P值
-
+
++
阳性率(%)
分类分级
LM
25
0
16
9
100.00
LMLS
, http://www.100md.com 46
19
23
4
58.70
<0.01
HMLS
15
14
1
0
6.67
生长方式
良性
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46
4
29
13
91.30
恶性
40
29
11
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27.50
<0.01
肿瘤直经(cm)
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0.3～5.9
38
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6.0～10.0
25
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<0.05
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23
19
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0
17.39
肿瘤中心坏死
无
45
8
25
12
82.22
, 百拇医药 有
41
25
15
1
39.02
<0.01
2.nm23表达与GISMT患者预后的关系:nm23阴性组的5年累积生存率为46.31%,而nm23阳性表达者的5年累积生存率为81.53%,两组患者生存率差异有显著性意义(P<0.05)。
3.nm23表达与AgNORs、PCNA表达之间的关系(±s):nm23阴性组的AgNORs颗粒均数为6.02±1.78/核,阳性表达组的AgNORs颗粒均数为3.52±1.79/核，两组间差异有极显著性意义(P<0.01)。 nm23阴性组的PCNA-LI为21.93±8.57,阳性表达组的PCNA-LI为10.65±6.13,两组间差异有极显著性意义(P<0.01)。
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讨论
大量实验表明nm23基因参与抑制肿瘤的形成和转移，支持nm23基因是肿瘤转移抑制基因的论点。对人体肿瘤研究发现，在乳腺癌、恶性黑色素瘤、肝癌等肿瘤中nm23的低表达与高转移潜能和预后不良有关[3]。但也有人发现nm23的低表达与乳腺癌的转移无任何关系[4]。在肺癌、大肠癌、甲状腺癌中，不论转移潜能高低nm23表达均有增强，推测这可能是由于nm23基因突变所致[5～7]。
本研究结果显示：nm23基因产物在LM中阳性表达率为100%，在LS中阳性表达率为45.9%，两者间差异有极显著性意义(P<0.01);随着LS恶性程度的增高,nm23的阳性表达率逐渐下降;肿瘤侵袭周围脏器或有腹腔种植及远处转移，肿瘤体积较大或肿瘤中心有坏死时，nm23的阳性表达率也均有明显的降低。说明nm23基因在GISMT的发生、发展、良性向恶性转变、恶性程度增高、复发及转移过程中起着非常重要的作用。因此,可将其作为判断GISMT良恶性、恶性程度、复发及转移的一项参考指标。我们根据完整的随访资料发现,GISMT患者术后长期生存率与原发灶中nm23的表达水平呈正相关,说明亦可将其作为判断GISMT患者预后的参考指标。
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AgNORs、PCNA均为反映细胞增殖活性的指标。有研究表明：AgNORs、PCNA表达与GISMT的良恶性、恶性程度、转移及预后有一定的相关性[8]。本研究结果显示：nm23阴性的GISMT患者其AgNORs、PCNA表达均明显高于阳性者，说明nm23具有对细胞增殖的负性调控作用，但其具体机制有待于进一步研究。nm23一旦发生缺失,将有可能导致细胞的恶性增殖,在机能代谢和分化程度上表现为由量变到质变的发展。因此，可以认为nm23阴性而AgNORs、PCNA高表达的GISMT恶性程度高、预后差。
参考文献
1Evans HL. Smooth muscle tumors of the gastrointestinal tract: a study of 56 cases followed for a minimum of 10 years.Cancer,1985,56:2242-2250.
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2蔡建辉,蒋贻康,张玉印,等. 胃肠道平滑肌肿瘤DNA含量与临床病理的关系.中华病理学杂志,1995,24:378-380.
3刘宝瑞,张学庸.转移抑制基因nm23研究进展.国外医学生理、病理科学与临床分册,1994,14:65-66.
4Royds JA,Stephenson TJ,Rees RC,et al.nm23 protein in ductal in situ and invasive human breast cancer. J Natl Cancer Inst,1993,85:727-731.
5Higashiyama M, Doi O, Yokouchi H, et al. Immunohistochemical analysis of nm23 gene product/NDP kinase expression in pulmonary adenocarcinoma:lack of prognostic value.Br J Cancer,1992,66:533-536.
, 百拇医药
6Haut M,Steeg PS,Wilison JKV,et al. Induction of nm23 gene expression in human colonic neoplasms and equal expression in colon tumors of high and low metastatic potential.J Natl Cancer Inst,1991,83:712-716.
7Zou M,Shi Y,Al-Sedairy S,et al.High levels of nm23 gene expression in advanced stage of thyroid carcinomas.Br J Cancer,1993,68:385-388.
8Yu CC,Fletcher CD,Newman PL,et al. A comparison of proliferative cell nuclear antigen (PCNA) immunostaining,nucleolar organizer region (AgNOR) staining,and histological grading in gastrointestinal stromal tumours. J Pathol,1992,166:147-152., http://www.100md.com