抗戊型肝炎病毒开放读码框架及IgM和IgG抗体的消长规律及临床意义
作者：阮冰 庄辉 马亦林 李奎 焦扬文 申碧荷 田雪丽
单位：310003 杭州，浙江医科大学附属第一医院传染病科(阮冰、马亦林、焦扬文)；北京医科大学微生物学系(庄辉、李奎)；杭州铁路中心医院(申碧荷、田雪丽)
关键词：肝炎病毒，戊型；肝炎抗体；酶联免疫吸附测定
中华医学杂志980706 【摘要】 目的 研究戊型肝炎病人抗戊型肝炎病毒(HEV)开放读码框架2(ORF2)和3(ORF3)及IgM和IgG抗体的消长规律及其临床意义。方法 采用HEV ORF2、ORF3合成多肽单独和联合酶联免疫法，动态检测52例病人血清抗HEV。结果 起病初期ORF2抗体和ORF3抗体水平均较高，随病程的延长两者均下降，ORF3抗体尤为明显。联合检测ORF2和ORF3抗体可提高试验的敏感性。血清抗HEV IgM和抗HEV IgG阳性率于起病半个月内分别为71.1%(32/45)和97.8%(44/45)，随病程的延长抗HEV IgM较早阴转。结论 HEV抗体诊断试剂盒至少应含有ORF2和ORF3两种抗原。抗HEV IgM的特异性好而抗HEV IgG的灵敏度高。
, http://www.100md.com
Dynamics of anti-HEV ORF2, ORF3, IgM and IgG in serial sera of patients with hepatitis E and their clinical significance Ruan Bing, Zhuang Hui, Ma Yilin, et al. Department of Infectious Diseases, First Hospital of Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003
【Abstract】 Objective To study the dynamics of anti-HEV ORF2, ORF3, IgM and IgG in serial sera of patients with hepatitis E. Methods Anti-HEV was detected in serial sera of 52 patients, by an enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) based on two synthetic peptides separated or combined from open reading frame (ORF) 2 and 3 of HEV genome. Results Both anti -ORF2 and anti-ORF3 in serum were at the highest levels in early acute phase of the disease, and declined gradually with the course,especially anti-ORF3. The sensitivity of the EIA using both ORF2 and ORF3 peptides was higher than that of either alone. The positive rates of anti-HEV IgM and anti-HEV IgG were separately 71.1% (32/45) and 97.8% (44/45) within 15 days after onset, then decreased more dramatically in IgM than in IgG with the course. Conclusion Both ORF2 and ORF3 proteins should be used for the development of anti-HEV EIA kit. It seems to be more specific in anti-HEV IgM and more sensitive in anti-HEV IgG as a diagnostic marker of hepatitis E.
, 百拇医药
【Key words】 hepatitis E virus Hepatitis antibodies Enzyme-linked immunosorbent assay
(Natl Med J China, 1998, 78：498-500)
戊型肝炎的血清学诊断还存在不少问题，对抗戊型肝炎病毒(HEV)的消长规律及其诊断价值看法不一[1]。本研究采用人工合成的HEV基因组开放读码框架2(ORF2)和3(ORF3)主要抗原决定簇的两段多肽，分别建立抗HEV ORF2、ORF3单独及联合酶联免疫试验(EIA)，检测52例急性戊型肝炎病人不同病期血清375份，以了解抗HEV ORF2、ORF3及IgM和IgG抗体的消长规律及其临床意义。现将结果报道如下。
对象与方法
一、对象
, 百拇医药
急性散发性戊型肝炎52例，男44例，女8例，年龄18～70岁，平均34.7±13.9岁。所有病人临床上均表现为急性肝炎，血清抗HEV IgM和/或IgG阳性(单项IgG阳性者抗体滴度在1∶40以上)，其他肝炎病毒急性感染血清标记物均为阴性(包括抗HAV IgM、HBsAg、抗HBc IgM、HBV DNA、抗HCV、HCV RNA、HDAg、抗HD IgM、抗CMV IgM和抗EBV IgM)。
二、方法
1.标本收集：收集52例病人不同病期血清标本375份，以病人出现发热和/或消化道症状作为病程的开始日，分别于起病半个月内、每月(1～6个月)及9、12、24、36个月各取血1次，分离血清置-20℃备检。
2.抗HEV ORF2和ORF3单独EIA检测：采用北京医科大学微生物学系研制的HEV ORF2和ORF3多肽，分别包被微量反应板，建立EIA法，检测血清ORF2抗体和ORF3抗体。操作过程及结果判断详见文献[2]，酶标仪为美国Bio-Rad公司产品(UV-3550型)。
, 百拇医药
3.抗HEV ORF2、ORF3联合EIA检测：采用上述ORF2和ORF3多肽，联合包被微量反应板，检测血清ORF2、3抗体(抗ORF2、3)，包括IgM和IgG。单项IgG阳性病人的首份血清加作抗体滴度测定。
4.统计学处理：计量资料采用t检验，计数资料采用卡方检验，部分资料根据需要采用确切概率法求出P值。
结 果
一、抗HEV ORF2、ORF3单独及联合检测
52例病人375份血清ORF2抗体总阳性率为67.7%，ORF3抗体总阳性率为52.5%(P<0.05)。起病初期ORF2抗体和ORF3抗体的阳性率均为最高，两者比较差异无显著意义(P>0.05)，以后两者均下降，ORF3抗体尤为明显，从起病3个月开始，其阳性率均低于同期ORF2抗体(P<0.05)。进一步分析发现，ORF2抗体阴性的2例病人中，有1例ORF3抗体阳性，而ORF3抗体阴性的5例病人中，有4例ORF2抗体阳性。联合检测ORF2、ORF3抗体总阳性率为74.7%，高于单一ORF2抗体或ORF3抗体，其A值也明显提高(附表)。
, 百拇医药
附表 52例戊型肝炎病人不同病期375份血清抗HEV检测结果 时间
(月)
血清
份数
抗HEV IgG阳性(%)
抗HEV
IgM阳性(%)
(ORF2+
ORF3抗体)
ORF2抗体
ORF3抗体
ORF2+
, 百拇医药
ORF3抗体
<0.5
45
44(97.8)
44(97.8)
44(97.8)
32(71.1)
1
52
50(96.2)
47(90.4)
51(98.1)
, http://www.100md.com 24(46.2)
2
45
40(88.9)
38(84.4)
44(97.8)
7(15.6)
3
45
38(84.4)
30(66.7)
40(88.9)
3( 6.7)
, http://www.100md.com
4
35
26(74.3)
16(45.7)
30(85.7)
2( 5.7)
5
33
21(63.6)
10(30.3)
25(75.8)
1( 3.0)
, 百拇医药 6
35
16(45.7)
6(17.1)
20(57.1)
1( 2.9)
9
34
11(32.4)
4(11.8)
14(41.2)
1( 2.9)
12
, http://www.100md.com
32
7(21.9)
2( 6.3)
9(28.1)
0( 0 )
24
13
1( 7.7)
0( 0)
2(15.4)
0( 0 )
36
6
, 百拇医药
0( 0)
0( 0)
1(16.7)
0( 0 )
合计
375
254(67.7)
197(52.5)
280(74.7)
71(18.9)
二、各种血清抗HEV的动态变化
选择30例起病1年内取样完整的病人进行全程观察(附图)。起病半个月内，ORF2抗体和ORF3抗体均处峰值水平，其后均随时间下降，其中ORF3抗体水平的下降快于ORF2抗体，病后6个月两者阳性率分别为16.7%(5/30)和56.7%(17/30)，12个月时分别为0.0%和30.0%(9/30)。抗ORF2、ORF3 IgG水平高，持续阳性时间也较长；抗ORF2、ORF3 IgM阳性率下降快，从起病半个月内的76.7%(23/30)降至病后3个月的6.7%(2/30)，仅1例持续阳性9个月。对抗ORF2、ORF3 IgM始终阴性的7例(23.3%)病人的首份血清作抗-ORF2、3 IgG滴度测定，结果均高于1∶80。比较上述30例病人血清抗ORF2、ORF3 IgG水平的消长曲线，可见3种类型。第一类为持续阳性，2例；其首份血清的抗体滴度均为1∶160，后续系列血清的抗体水平无明显升降；第二类为短暂升高后下降6例；第三类为一开始即处峰值，然后随时间下降22例。三类病人临床上均表现为急性过程。未见抗ORF2、ORF3 IgG持续高水平或在发病3个月后继续升高者。
, 百拇医药
附图 30例戊型肝炎病人血清抗HEV水平的动态变化
讨 论
以往报道的戊型肝炎病人血清抗HEV阳性率存在较大的差异[3～5]，除了试剂盒及发病地区各不相同外，还缺少系列血清的全程随访资料。本研究结果表明，起病初期血清抗HEV ORF2抗体和ORF3抗体水平均较高，随着病程的延长，两者均下降，ORF3抗体尤为明显。有报道用ORF2和ORF3重组表达抗原建立的Western blot法检测实验感染HEV猕猴[6，7]及戊型肝炎病人血清[8]也获得类似的结果。提示，HEV结构基因ORF2和ORF3区编码的蛋白含有不同的抗原表位，可引起宿主不同的免疫应答。实验结果还显示，同时用该两种抗原作EIA，抗HEV的检出率高于用单一抗原，抗体水平也明显提高。因此，在制备抗HEV EIA试剂盒时，应联合应用ORF2和ORF3多肽，以提高其灵敏度和特异性。
, 百拇医药
比较血清抗HEV IgM和抗HEV IgG的检测结果，发现两者的出现均较早，其中抗HEV IgM的阳性率下降快，对诊断急性戊型肝炎特异性较好，而抗HEV IgG的阳性率高，是诊断急性戊型肝炎更为灵敏的指标。因此，对疑诊戊型肝炎的急性期病人，最好是在排除其他肝炎病毒急性感染的基础上，平行检测血清抗HEV IgM和抗HEV IgG，动态观察其消长情况，如出现IgM或IgG抗体阳转，或其效价从高值进行性下降或由低值上升，均有助于戊型肝炎的诊断。单项IgG抗体阳性更有必要进行动态观察并作滴度测定，特别是在戊型肝炎地方性流行区。曾有学者调查了我国新疆流行区和印度克什米尔流行区病人抗HEV IgG阳性率[4，5]，病后9年和14年分别为66.6%和47%，而埃及散发区患儿病后半年即全部阴转[3]。推测在流行区，HEV多次感染的机会并不少见，导致血清抗HEV IgG反复出现。因此，诊断时应结合临床表现并强调抗体水平的动态检测。
参考文献
, 百拇医药
1 田庚善.关于戊型病毒性肝炎的血清学诊断问题.中华医学杂志，1996,76：7-8.
2 庄辉，李凡，朱永红，等.戊型肝炎病人和实验感染戊型肝炎病毒的猕猴血清抗-HEV ORF2和ORF3的动态变化.中华实验和临床病毒学杂志，1995，9：299-302.
3 Goldsmith R, Yarbough PO, Reye GR, et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of acute sporadic hepatitis E in Egyptian children. Lancet, 1992, 339：328-331.
4 韩砚义，李玉萍，沙地克，等.戊型肝炎患者血清抗戊型肝炎病毒IgG的动态改变.中华实验和临床病毒学杂志，1993, 7：427.
, 百拇医药
5 Khuroo MS, Kamili S, Dar MY, et al. Hepatitis E and long term antibody status. Lancet, 1993, 341：1335.
6 Li F, Zhuang H, Kolivas S, et al. Persistent and transient antibody responses to hepatitis E virus detected by western immunoblot using open reading frame 2 and 3 and glutathione S-transferase fusion proteins. J Clin Microbiol,1994,32:2060-2066.
7 李奎，朱万孚，庄辉，等.免疫吸印法检测实验感染戊型肝炎病毒的猕猴血清抗-HEV ORF2和ORF3的动态变化.中华肝脏病杂志，1996，4：233-234.
, 百拇医药
8 Panda SK, Nanda SK, Zafrullah M,et al.An Indian strain of hepatitis E virus (HEV): cloning,sequence and expression of structural region and antibody responses in sera from individuals from an area of high-level HEV endemicity. J Clin Microbiol,1995,33:2653-2659.
本课题为浙江省自然科学基金，浙江省教委及浙江省卫生厅资助项目
(收稿：1997-05-29 修回：1998-04-15), 百拇医药
单位：310003 杭州，浙江医科大学附属第一医院传染病科(阮冰、马亦林、焦扬文)；北京医科大学微生物学系(庄辉、李奎)；杭州铁路中心医院(申碧荷、田雪丽)
关键词：肝炎病毒，戊型；肝炎抗体；酶联免疫吸附测定
中华医学杂志980706 【摘要】 目的 研究戊型肝炎病人抗戊型肝炎病毒(HEV)开放读码框架2(ORF2)和3(ORF3)及IgM和IgG抗体的消长规律及其临床意义。方法 采用HEV ORF2、ORF3合成多肽单独和联合酶联免疫法，动态检测52例病人血清抗HEV。结果 起病初期ORF2抗体和ORF3抗体水平均较高，随病程的延长两者均下降，ORF3抗体尤为明显。联合检测ORF2和ORF3抗体可提高试验的敏感性。血清抗HEV IgM和抗HEV IgG阳性率于起病半个月内分别为71.1%(32/45)和97.8%(44/45)，随病程的延长抗HEV IgM较早阴转。结论 HEV抗体诊断试剂盒至少应含有ORF2和ORF3两种抗原。抗HEV IgM的特异性好而抗HEV IgG的灵敏度高。
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Dynamics of anti-HEV ORF2, ORF3, IgM and IgG in serial sera of patients with hepatitis E and their clinical significance Ruan Bing, Zhuang Hui, Ma Yilin, et al. Department of Infectious Diseases, First Hospital of Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003
【Abstract】 Objective To study the dynamics of anti-HEV ORF2, ORF3, IgM and IgG in serial sera of patients with hepatitis E. Methods Anti-HEV was detected in serial sera of 52 patients, by an enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) based on two synthetic peptides separated or combined from open reading frame (ORF) 2 and 3 of HEV genome. Results Both anti -ORF2 and anti-ORF3 in serum were at the highest levels in early acute phase of the disease, and declined gradually with the course,especially anti-ORF3. The sensitivity of the EIA using both ORF2 and ORF3 peptides was higher than that of either alone. The positive rates of anti-HEV IgM and anti-HEV IgG were separately 71.1% (32/45) and 97.8% (44/45) within 15 days after onset, then decreased more dramatically in IgM than in IgG with the course. Conclusion Both ORF2 and ORF3 proteins should be used for the development of anti-HEV EIA kit. It seems to be more specific in anti-HEV IgM and more sensitive in anti-HEV IgG as a diagnostic marker of hepatitis E.
, 百拇医药
【Key words】 hepatitis E virus Hepatitis antibodies Enzyme-linked immunosorbent assay
(Natl Med J China, 1998, 78：498-500)
戊型肝炎的血清学诊断还存在不少问题，对抗戊型肝炎病毒(HEV)的消长规律及其诊断价值看法不一[1]。本研究采用人工合成的HEV基因组开放读码框架2(ORF2)和3(ORF3)主要抗原决定簇的两段多肽，分别建立抗HEV ORF2、ORF3单独及联合酶联免疫试验(EIA)，检测52例急性戊型肝炎病人不同病期血清375份，以了解抗HEV ORF2、ORF3及IgM和IgG抗体的消长规律及其临床意义。现将结果报道如下。
对象与方法
一、对象
, 百拇医药
急性散发性戊型肝炎52例，男44例，女8例，年龄18～70岁，平均34.7±13.9岁。所有病人临床上均表现为急性肝炎，血清抗HEV IgM和/或IgG阳性(单项IgG阳性者抗体滴度在1∶40以上)，其他肝炎病毒急性感染血清标记物均为阴性(包括抗HAV IgM、HBsAg、抗HBc IgM、HBV DNA、抗HCV、HCV RNA、HDAg、抗HD IgM、抗CMV IgM和抗EBV IgM)。
二、方法
1.标本收集：收集52例病人不同病期血清标本375份，以病人出现发热和/或消化道症状作为病程的开始日，分别于起病半个月内、每月(1～6个月)及9、12、24、36个月各取血1次，分离血清置-20℃备检。
2.抗HEV ORF2和ORF3单独EIA检测：采用北京医科大学微生物学系研制的HEV ORF2和ORF3多肽，分别包被微量反应板，建立EIA法，检测血清ORF2抗体和ORF3抗体。操作过程及结果判断详见文献[2]，酶标仪为美国Bio-Rad公司产品(UV-3550型)。
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3.抗HEV ORF2、ORF3联合EIA检测：采用上述ORF2和ORF3多肽，联合包被微量反应板，检测血清ORF2、3抗体(抗ORF2、3)，包括IgM和IgG。单项IgG阳性病人的首份血清加作抗体滴度测定。
4.统计学处理：计量资料采用t检验，计数资料采用卡方检验，部分资料根据需要采用确切概率法求出P值。
结 果
一、抗HEV ORF2、ORF3单独及联合检测
52例病人375份血清ORF2抗体总阳性率为67.7%，ORF3抗体总阳性率为52.5%(P<0.05)。起病初期ORF2抗体和ORF3抗体的阳性率均为最高，两者比较差异无显著意义(P>0.05)，以后两者均下降，ORF3抗体尤为明显，从起病3个月开始，其阳性率均低于同期ORF2抗体(P<0.05)。进一步分析发现，ORF2抗体阴性的2例病人中，有1例ORF3抗体阳性，而ORF3抗体阴性的5例病人中，有4例ORF2抗体阳性。联合检测ORF2、ORF3抗体总阳性率为74.7%，高于单一ORF2抗体或ORF3抗体，其A值也明显提高(附表)。
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附表 52例戊型肝炎病人不同病期375份血清抗HEV检测结果 时间
(月)
血清
份数
抗HEV IgG阳性(%)
抗HEV
IgM阳性(%)
(ORF2+
ORF3抗体)
ORF2抗体
ORF3抗体
ORF2+
, 百拇医药
ORF3抗体
<0.5
45
44(97.8)
44(97.8)
44(97.8)
32(71.1)
1
52
50(96.2)
47(90.4)
51(98.1)
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2
45
40(88.9)
38(84.4)
44(97.8)
7(15.6)
3
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38(84.4)
30(66.7)
40(88.9)
3( 6.7)
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26(74.3)
16(45.7)
30(85.7)
2( 5.7)
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10(30.3)
25(75.8)
1( 3.0)
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6(17.1)
20(57.1)
1( 2.9)
9
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11(32.4)
4(11.8)
14(41.2)
1( 2.9)
12
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32
7(21.9)
2( 6.3)
9(28.1)
0( 0 )
24
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1( 7.7)
0( 0)
2(15.4)
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1(16.7)
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合计
375
254(67.7)
197(52.5)
280(74.7)
71(18.9)
二、各种血清抗HEV的动态变化
选择30例起病1年内取样完整的病人进行全程观察(附图)。起病半个月内，ORF2抗体和ORF3抗体均处峰值水平，其后均随时间下降，其中ORF3抗体水平的下降快于ORF2抗体，病后6个月两者阳性率分别为16.7%(5/30)和56.7%(17/30)，12个月时分别为0.0%和30.0%(9/30)。抗ORF2、ORF3 IgG水平高，持续阳性时间也较长；抗ORF2、ORF3 IgM阳性率下降快，从起病半个月内的76.7%(23/30)降至病后3个月的6.7%(2/30)，仅1例持续阳性9个月。对抗ORF2、ORF3 IgM始终阴性的7例(23.3%)病人的首份血清作抗-ORF2、3 IgG滴度测定，结果均高于1∶80。比较上述30例病人血清抗ORF2、ORF3 IgG水平的消长曲线，可见3种类型。第一类为持续阳性，2例；其首份血清的抗体滴度均为1∶160，后续系列血清的抗体水平无明显升降；第二类为短暂升高后下降6例；第三类为一开始即处峰值，然后随时间下降22例。三类病人临床上均表现为急性过程。未见抗ORF2、ORF3 IgG持续高水平或在发病3个月后继续升高者。
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附图 30例戊型肝炎病人血清抗HEV水平的动态变化
讨 论
以往报道的戊型肝炎病人血清抗HEV阳性率存在较大的差异[3～5]，除了试剂盒及发病地区各不相同外，还缺少系列血清的全程随访资料。本研究结果表明，起病初期血清抗HEV ORF2抗体和ORF3抗体水平均较高，随着病程的延长，两者均下降，ORF3抗体尤为明显。有报道用ORF2和ORF3重组表达抗原建立的Western blot法检测实验感染HEV猕猴[6，7]及戊型肝炎病人血清[8]也获得类似的结果。提示，HEV结构基因ORF2和ORF3区编码的蛋白含有不同的抗原表位，可引起宿主不同的免疫应答。实验结果还显示，同时用该两种抗原作EIA，抗HEV的检出率高于用单一抗原，抗体水平也明显提高。因此，在制备抗HEV EIA试剂盒时，应联合应用ORF2和ORF3多肽，以提高其灵敏度和特异性。
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比较血清抗HEV IgM和抗HEV IgG的检测结果，发现两者的出现均较早，其中抗HEV IgM的阳性率下降快，对诊断急性戊型肝炎特异性较好，而抗HEV IgG的阳性率高，是诊断急性戊型肝炎更为灵敏的指标。因此，对疑诊戊型肝炎的急性期病人，最好是在排除其他肝炎病毒急性感染的基础上，平行检测血清抗HEV IgM和抗HEV IgG，动态观察其消长情况，如出现IgM或IgG抗体阳转，或其效价从高值进行性下降或由低值上升，均有助于戊型肝炎的诊断。单项IgG抗体阳性更有必要进行动态观察并作滴度测定，特别是在戊型肝炎地方性流行区。曾有学者调查了我国新疆流行区和印度克什米尔流行区病人抗HEV IgG阳性率[4，5]，病后9年和14年分别为66.6%和47%，而埃及散发区患儿病后半年即全部阴转[3]。推测在流行区，HEV多次感染的机会并不少见，导致血清抗HEV IgG反复出现。因此，诊断时应结合临床表现并强调抗体水平的动态检测。
参考文献
, 百拇医药
1 田庚善.关于戊型病毒性肝炎的血清学诊断问题.中华医学杂志，1996,76：7-8.
2 庄辉，李凡，朱永红，等.戊型肝炎病人和实验感染戊型肝炎病毒的猕猴血清抗-HEV ORF2和ORF3的动态变化.中华实验和临床病毒学杂志，1995，9：299-302.
3 Goldsmith R, Yarbough PO, Reye GR, et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of acute sporadic hepatitis E in Egyptian children. Lancet, 1992, 339：328-331.
4 韩砚义，李玉萍，沙地克，等.戊型肝炎患者血清抗戊型肝炎病毒IgG的动态改变.中华实验和临床病毒学杂志，1993, 7：427.
, 百拇医药
5 Khuroo MS, Kamili S, Dar MY, et al. Hepatitis E and long term antibody status. Lancet, 1993, 341：1335.
6 Li F, Zhuang H, Kolivas S, et al. Persistent and transient antibody responses to hepatitis E virus detected by western immunoblot using open reading frame 2 and 3 and glutathione S-transferase fusion proteins. J Clin Microbiol,1994,32:2060-2066.
7 李奎，朱万孚，庄辉，等.免疫吸印法检测实验感染戊型肝炎病毒的猕猴血清抗-HEV ORF2和ORF3的动态变化.中华肝脏病杂志，1996，4：233-234.
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8 Panda SK, Nanda SK, Zafrullah M,et al.An Indian strain of hepatitis E virus (HEV): cloning,sequence and expression of structural region and antibody responses in sera from individuals from an area of high-level HEV endemicity. J Clin Microbiol,1995,33:2653-2659.
本课题为浙江省自然科学基金，浙江省教委及浙江省卫生厅资助项目
(收稿：1997-05-29 修回：1998-04-15), 百拇医药