幽门螺杆菌感染后胃粘液细胞膜及其基底膜阴离子分布的变化*
作者：周琳瑛1 陈朝元2 梁 平1 陈丽英3 钟秀容1 陈莲云1
单位：
关键词：螺杆菌感染/病理学；胃粘膜/微生物学；阴离子；活组织检查
华人消化杂志/980707 中国图书资料分类号 R57
摘 要
目的 探讨幽门螺杆菌(Hp)感染后胃粘液细胞游离面及粘液上皮基底膜中阴离子分布的变化.
方法 利用PEI作为阳离子探针，对10例Hp感染者的活检胃粘膜进行观察.
结果 胃粘液细胞游离面常有排列紧密的PEI标记物，而细胞间隙中PEI标记常阴性或仅有少量. Hp感染后，部分胃粘液细胞膜上PEI标记减少或缺失，细胞间隙中PEI标记明显增多，有时某些细胞器上亦有PEI标记. 基底膜中PEI标记为15nm～20nm致密颗粒以35nm～80nm的间距有序排列，炎症细胞浸润破坏基底膜时，其PEI标记稀疏或中断.
, http://www.100md.com
结论 细胞膜上阴离子分布的改变在Hp致病中可能起一定的作用.
0 引言
细胞表面及基底膜阴离子分布的变化在疾病发生、发展中所起的作用已开始受到重视. 现有的研究表明，细胞表面及基底膜中的阴离子是电荷屏障，对带有不同电荷的物质有选择性通透作用，并对上皮细胞粘附于基底膜上防止其脱落亦起重要作用[1，2]. 我们探讨幽门螺杆菌(Hp)感染后胃粘液细胞膜的通透性，粘液细胞间紧密连接等胃粘膜屏障改变后的同时，应用多聚乙烯亚胺(PEI)对胃粘液细胞游离面及基底膜中阴离子分布的变化进行探讨，旨在更全面了解胃粘膜屏障在Hp致病机制中的作用，有关资料，国内外尚未见报道.
1 材料和方法
1.1 材料 Hp感染(快速尿素酶试验阳性)的消化不良或消化性溃疡患者10例，年龄27岁～63岁，其中男5例，女5例，均未经过系统的抗Hp治疗，取胃窦部(非溃疡处)粘膜标本.
, 百拇医药
1.2 方法 胃粘膜活检组织迅速放入装有生理盐水(0℃)的青霉素小瓶中，并剪成约1mm 3小块，漂洗后，根据文献[3]报道的方法，浸入双蒸水配制的5g/L～10g/L PEI(Mr 5000，Sigma公司)中(0℃)，30min后用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液，pH=7.4，4℃(CBS)漂洗3次，置1g/L戊二醛-20g/L磷钨酸中(pH=7.4，4℃)1h，0.1mol/L CBS漂洗3次后，再次浸入5g/L～10g/L PEI中(4℃)30min，0.1mol/L CBS充分漂洗后，10g/L OsO4后固定1h(4℃)，逐级乙醇-丙酮脱水，Epon 618浸透、包埋、超薄切片经枸橼酸铅和醋酸铀各染1min使背景的电子密度有所增高. Hu-12A透射电镜观察.
2 结果
Hp位于胃粘液层中或粘附于胃粘液细胞的表面，其分布不均匀，常聚集在细胞间连接附近或粘膜小凹处. 绝大多数粘液细胞的细胞核，细胞浆内线粒体、粗面内质网、高尔基体、粘液颗粒等结构均保存良好，阳性的PEI标记物电子密度明显高于背景.
, 百拇医药
多数粘液细胞表面质膜PEI标记阳性，标记物为细小的颗粒状，紧密排列，间距极小甚至难以区分而表现为连续的线性分布(图1). 胃粘液层中Hp表面PEI标记物亦呈细颗粒状紧密排列，其颗粒的大小、间距与粘液细胞膜上PEI标记物相似(图2，3). 在Hp与胃粘液细胞接触时，接触面上PEI标记有不同程度的减少或局部缺失(图2)，有时粘液细胞表面无Hp粘附处也可见PEI标记稀疏或局部缺失(图3). 大部分粘液细胞胞质内细胞器未见PEI标记，仅个别细胞粗面内质网、线粒体、高尔基体、粘液颗粒界膜及核膜上有PEI标记呈连续的线性分布，致胞质的电子密度明显增高(图4).
粘液细胞之间的细胞膜PEI标记常为阴性，或仅有少量电子致密颗粒散在分布(图5)，Hp感染处常可见PEI标记物进入细胞间隙，致该处PEI标记物明显增多，有时聚成大小不等的团块状(图6). 胃粘液细胞基底膜中PEI标记物为直径15nm～25nm的小颗粒，沿基底膜的内疏松层有序排列，颗粒间距为35nm～80nm(图5). 白细胞穿过基底膜处，基底膜受损断裂，PEI标记不规则或缺失(图7)，白细胞进入上皮细胞间后，基底膜PEI标记颗粒的大小、间距亦恢复正常(图8).
, 百拇医药
3 讨论
多数哺乳动物细胞表面有大量阴离子分布，过去常用辽红、胶体钍、氧化铁等加以标记，但这些传统的阳离子探针与阴离子结合时，不能形成小颗粒，故难以精确定位[3]. 1977年Schurer et al首次介绍一种人工合成的多聚阳离子胶体-PEI用来定位阴离子，它能与锇酸、磷钨酸螯合成高电子密度颗粒. 与传统的阳离子探针相比，具有体积小，颗粒形状，非特异性结合少，定位精确等优点[3]，故近年来常被应用. 但有关其在胃粘膜上皮组织中的标记，目前国内、外未见报道. 本文利用PEI作为阳离子探针观察Hp感染后粘液细胞游离面及基底膜中阴离子分布的变化，并对其意义进行探讨.
本实验发现通常胃粘液细胞游离面有较密集的阴离子分布，其主要成分为唾液酸，具有静电屏障的功能，能维持细胞内、外离子浓度，保持一个相对稳定的内环境，而神经氨酸酶、某些致变性因子(如尿素、胍)及蛋白水解酶(如胰蛋白酶)等均可使这种唾液酸成分丢失[4]. 因此，Hp感染后胃粘液细胞游离面阴离子分布的缺失可能是由于Hp释放的蛋白酶所致，此时Hp使胃粘液细胞的电荷屏障功能减弱. Hp表面也有均匀连续的PEI标记物，说明该菌表面也有连续分布的阴离子. 一些学者在研究大肠杆菌、霍乱弧菌时也发现类似现象，并认为细菌与细胞间的粘附除与受体、凝集素等有关外，二者间的电荷分布及细胞表面疏水性等间接因素亦起重要作用[5]. 因此，我们考虑由于胃粘液细胞表面阴离子的丢失，减少了细菌与粘液细胞间的排斥力，可能有利于Hp粘附于胃粘液细胞的表面.
, 百拇医药
某些粘液细胞内线粒体、高尔基体、粗面内质网、粘液颗粒界膜及细胞核表面亦出现PEI阳性标记，可能是由于细胞膜的屏障功能减弱致PEI分子进入细胞所致. 我们曾用电镜细胞化学技术证实Hp感染后胃粘液细胞膜对大分子物质的通透性增大[6]，而PEI标记则提示细胞膜对电荷的屏障功能亦减弱，说明Hp感染后胃粘液细胞膜对大分子物质和电荷的通透性均增大. 其机制可能涉及Hp直接作用，Hp产生的毒素、酶或Hp诱导机体炎症细胞聚集所产生的自由基等. 由于细胞膜通透性增大又可促使毒性物质进一步进入细胞，引起细胞变性、坏死或影响其核酸的正常复制、转录等. Hp感染后PEI标记物进入细胞间隙，可能与粘液细胞间紧密连接的破坏有关.
现有研究还表明细胞膜上唾液酸成分在细胞和基底膜的粘附上发挥重要作用[4]，而Hp感染后胃粘液细胞膜上唾液酸成分的减少是否也使粘液细胞较易从基底膜上脱落以致糜烂形成尚有待于进一步探讨. 胃粘膜上皮基底膜上PEI标记物大小和间距与其他学者在肾小球毛细血管基底膜及心肌细胞基膜上所见的PEI标记相似[1，4，7]，现已证实其化学成分不同于细胞膜上的阴离子，而是一种糖胺多糖成分[3]，亦有电荷屏障的功能. 我们的观察提示胃粘液细胞基底膜上阴离子分布的变化与Hp感染似乎无关，而仅与其本身的结构完整性有关.
, 百拇医药
图1 粘液细胞表面质膜PEI标记阳性，为紧密而连续的线性分布.×7000
图2 游离的Hp表面有连续的PEI标记，Hp与粘液细胞接触时，二者的接触面上PEI标记有不同程度的缺失(↑). ×21000
图3 游离的Hp表面有连续的PEI标记，粘液细胞表面PEI标记稀疏. ×18000
图4 粘液细胞胞质电子密度增高. ×7000
图5 粘液细胞间隙仅少量细颗粒状PEI分布，基底膜的PEI标记为细颗粒状，以一定的间距有序排列. ×18000
图6 粘液细胞间隙PEI标记明显增多，呈团块状分布(↑). ×7000
图7 炎症细胞浸润而破坏基底膜时，PEI标记缺失(↑). ×15000
, 百拇医药
图8 基底膜恢复正常时，PEI标记亦恢复正常. ×90004
参考文献
1 Robert LV, David JK, Susan PS, Jhon DM, Theodore RO, David MB. Heparan sulfate-rich anionic sites in the human glomerular basement membrane. N Engl J Med, 1983;309(17):1001-1009
2 Rosenzweig LJ, Kanwar YS. Removed of sulfated (heparan sulfate) or non-sulfated (hyaluronic acid) glycosaminoglycans results in increased permeability of the glomerular basement membrane to 125I bovine serum albumin. Lab Invest, 1982;47(2):177-178
, 百拇医药
3 Schurer JW, Hoedemaeker J, Molenaar I. Polyethyleneimine as tracer particle for (immuno) electron microscopy. J Histochemcytochem, 1977;255(5):384
4 Kanwar YW, Farpuhar MG. Detachment of endothelium and epithelium from the glomerular basement membrane produced by perfusion with neuraminidase. Lab Invest, 1980;42(3):375-384
5 Kabir S, Ali S, Characterization of surface properties of vibrio cholerae. Infect Immun, 1983;39(3):1048-1058
6 周琳瑛，梁平，陈丽英，陈莲云，钟秀容. 幽门螺杆菌感染后胃粘膜屏障改变的形态学研究(系列1)：胃粘液细胞膜通透性的改变. 中华医学杂志，待发
7 Lee YS. Appraisal of polyethyleneimine used as a trace for anionic sites in human cardiac tissues with a brife reference to anionic molecular organization in altered basement membranes. J Mol Cardiol, 1986;18(5):529-539, http://www.100md.com(周琳瑛1 陈朝元2 梁 平1 陈丽英3 钟秀容1 陈莲云1)
单位：
关键词：螺杆菌感染/病理学；胃粘膜/微生物学；阴离子；活组织检查
华人消化杂志/980707 中国图书资料分类号 R57
摘 要
目的 探讨幽门螺杆菌(Hp)感染后胃粘液细胞游离面及粘液上皮基底膜中阴离子分布的变化.
方法 利用PEI作为阳离子探针，对10例Hp感染者的活检胃粘膜进行观察.
结果 胃粘液细胞游离面常有排列紧密的PEI标记物，而细胞间隙中PEI标记常阴性或仅有少量. Hp感染后，部分胃粘液细胞膜上PEI标记减少或缺失，细胞间隙中PEI标记明显增多，有时某些细胞器上亦有PEI标记. 基底膜中PEI标记为15nm～20nm致密颗粒以35nm～80nm的间距有序排列，炎症细胞浸润破坏基底膜时，其PEI标记稀疏或中断.
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结论 细胞膜上阴离子分布的改变在Hp致病中可能起一定的作用.
0 引言
细胞表面及基底膜阴离子分布的变化在疾病发生、发展中所起的作用已开始受到重视. 现有的研究表明，细胞表面及基底膜中的阴离子是电荷屏障，对带有不同电荷的物质有选择性通透作用，并对上皮细胞粘附于基底膜上防止其脱落亦起重要作用[1，2]. 我们探讨幽门螺杆菌(Hp)感染后胃粘液细胞膜的通透性，粘液细胞间紧密连接等胃粘膜屏障改变后的同时，应用多聚乙烯亚胺(PEI)对胃粘液细胞游离面及基底膜中阴离子分布的变化进行探讨，旨在更全面了解胃粘膜屏障在Hp致病机制中的作用，有关资料，国内外尚未见报道.
1 材料和方法
1.1 材料 Hp感染(快速尿素酶试验阳性)的消化不良或消化性溃疡患者10例，年龄27岁～63岁，其中男5例，女5例，均未经过系统的抗Hp治疗，取胃窦部(非溃疡处)粘膜标本.
, 百拇医药
1.2 方法 胃粘膜活检组织迅速放入装有生理盐水(0℃)的青霉素小瓶中，并剪成约1mm 3小块，漂洗后，根据文献[3]报道的方法，浸入双蒸水配制的5g/L～10g/L PEI(Mr 5000，Sigma公司)中(0℃)，30min后用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液，pH=7.4，4℃(CBS)漂洗3次，置1g/L戊二醛-20g/L磷钨酸中(pH=7.4，4℃)1h，0.1mol/L CBS漂洗3次后，再次浸入5g/L～10g/L PEI中(4℃)30min，0.1mol/L CBS充分漂洗后，10g/L OsO4后固定1h(4℃)，逐级乙醇-丙酮脱水，Epon 618浸透、包埋、超薄切片经枸橼酸铅和醋酸铀各染1min使背景的电子密度有所增高. Hu-12A透射电镜观察.
2 结果
Hp位于胃粘液层中或粘附于胃粘液细胞的表面，其分布不均匀，常聚集在细胞间连接附近或粘膜小凹处. 绝大多数粘液细胞的细胞核，细胞浆内线粒体、粗面内质网、高尔基体、粘液颗粒等结构均保存良好，阳性的PEI标记物电子密度明显高于背景.
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多数粘液细胞表面质膜PEI标记阳性，标记物为细小的颗粒状，紧密排列，间距极小甚至难以区分而表现为连续的线性分布(图1). 胃粘液层中Hp表面PEI标记物亦呈细颗粒状紧密排列，其颗粒的大小、间距与粘液细胞膜上PEI标记物相似(图2，3). 在Hp与胃粘液细胞接触时，接触面上PEI标记有不同程度的减少或局部缺失(图2)，有时粘液细胞表面无Hp粘附处也可见PEI标记稀疏或局部缺失(图3). 大部分粘液细胞胞质内细胞器未见PEI标记，仅个别细胞粗面内质网、线粒体、高尔基体、粘液颗粒界膜及核膜上有PEI标记呈连续的线性分布，致胞质的电子密度明显增高(图4).
粘液细胞之间的细胞膜PEI标记常为阴性，或仅有少量电子致密颗粒散在分布(图5)，Hp感染处常可见PEI标记物进入细胞间隙，致该处PEI标记物明显增多，有时聚成大小不等的团块状(图6). 胃粘液细胞基底膜中PEI标记物为直径15nm～25nm的小颗粒，沿基底膜的内疏松层有序排列，颗粒间距为35nm～80nm(图5). 白细胞穿过基底膜处，基底膜受损断裂，PEI标记不规则或缺失(图7)，白细胞进入上皮细胞间后，基底膜PEI标记颗粒的大小、间距亦恢复正常(图8).
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3 讨论
多数哺乳动物细胞表面有大量阴离子分布，过去常用辽红、胶体钍、氧化铁等加以标记，但这些传统的阳离子探针与阴离子结合时，不能形成小颗粒，故难以精确定位[3]. 1977年Schurer et al首次介绍一种人工合成的多聚阳离子胶体-PEI用来定位阴离子，它能与锇酸、磷钨酸螯合成高电子密度颗粒. 与传统的阳离子探针相比，具有体积小，颗粒形状，非特异性结合少，定位精确等优点[3]，故近年来常被应用. 但有关其在胃粘膜上皮组织中的标记，目前国内、外未见报道. 本文利用PEI作为阳离子探针观察Hp感染后粘液细胞游离面及基底膜中阴离子分布的变化，并对其意义进行探讨.
本实验发现通常胃粘液细胞游离面有较密集的阴离子分布，其主要成分为唾液酸，具有静电屏障的功能，能维持细胞内、外离子浓度，保持一个相对稳定的内环境，而神经氨酸酶、某些致变性因子(如尿素、胍)及蛋白水解酶(如胰蛋白酶)等均可使这种唾液酸成分丢失[4]. 因此，Hp感染后胃粘液细胞游离面阴离子分布的缺失可能是由于Hp释放的蛋白酶所致，此时Hp使胃粘液细胞的电荷屏障功能减弱. Hp表面也有均匀连续的PEI标记物，说明该菌表面也有连续分布的阴离子. 一些学者在研究大肠杆菌、霍乱弧菌时也发现类似现象，并认为细菌与细胞间的粘附除与受体、凝集素等有关外，二者间的电荷分布及细胞表面疏水性等间接因素亦起重要作用[5]. 因此，我们考虑由于胃粘液细胞表面阴离子的丢失，减少了细菌与粘液细胞间的排斥力，可能有利于Hp粘附于胃粘液细胞的表面.
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某些粘液细胞内线粒体、高尔基体、粗面内质网、粘液颗粒界膜及细胞核表面亦出现PEI阳性标记，可能是由于细胞膜的屏障功能减弱致PEI分子进入细胞所致. 我们曾用电镜细胞化学技术证实Hp感染后胃粘液细胞膜对大分子物质的通透性增大[6]，而PEI标记则提示细胞膜对电荷的屏障功能亦减弱，说明Hp感染后胃粘液细胞膜对大分子物质和电荷的通透性均增大. 其机制可能涉及Hp直接作用，Hp产生的毒素、酶或Hp诱导机体炎症细胞聚集所产生的自由基等. 由于细胞膜通透性增大又可促使毒性物质进一步进入细胞，引起细胞变性、坏死或影响其核酸的正常复制、转录等. Hp感染后PEI标记物进入细胞间隙，可能与粘液细胞间紧密连接的破坏有关.
现有研究还表明细胞膜上唾液酸成分在细胞和基底膜的粘附上发挥重要作用[4]，而Hp感染后胃粘液细胞膜上唾液酸成分的减少是否也使粘液细胞较易从基底膜上脱落以致糜烂形成尚有待于进一步探讨. 胃粘膜上皮基底膜上PEI标记物大小和间距与其他学者在肾小球毛细血管基底膜及心肌细胞基膜上所见的PEI标记相似[1，4，7]，现已证实其化学成分不同于细胞膜上的阴离子，而是一种糖胺多糖成分[3]，亦有电荷屏障的功能. 我们的观察提示胃粘液细胞基底膜上阴离子分布的变化与Hp感染似乎无关，而仅与其本身的结构完整性有关.
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图1 粘液细胞表面质膜PEI标记阳性，为紧密而连续的线性分布.×7000
图2 游离的Hp表面有连续的PEI标记，Hp与粘液细胞接触时，二者的接触面上PEI标记有不同程度的缺失(↑). ×21000
图3 游离的Hp表面有连续的PEI标记，粘液细胞表面PEI标记稀疏. ×18000
图4 粘液细胞胞质电子密度增高. ×7000
图5 粘液细胞间隙仅少量细颗粒状PEI分布，基底膜的PEI标记为细颗粒状，以一定的间距有序排列. ×18000
图6 粘液细胞间隙PEI标记明显增多，呈团块状分布(↑). ×7000
图7 炎症细胞浸润而破坏基底膜时，PEI标记缺失(↑). ×15000
, 百拇医药
图8 基底膜恢复正常时，PEI标记亦恢复正常. ×90004
参考文献
1 Robert LV, David JK, Susan PS, Jhon DM, Theodore RO, David MB. Heparan sulfate-rich anionic sites in the human glomerular basement membrane. N Engl J Med, 1983;309(17):1001-1009
2 Rosenzweig LJ, Kanwar YS. Removed of sulfated (heparan sulfate) or non-sulfated (hyaluronic acid) glycosaminoglycans results in increased permeability of the glomerular basement membrane to 125I bovine serum albumin. Lab Invest, 1982;47(2):177-178
, 百拇医药
3 Schurer JW, Hoedemaeker J, Molenaar I. Polyethyleneimine as tracer particle for (immuno) electron microscopy. J Histochemcytochem, 1977;255(5):384
4 Kanwar YW, Farpuhar MG. Detachment of endothelium and epithelium from the glomerular basement membrane produced by perfusion with neuraminidase. Lab Invest, 1980;42(3):375-384
5 Kabir S, Ali S, Characterization of surface properties of vibrio cholerae. Infect Immun, 1983;39(3):1048-1058
6 周琳瑛，梁平，陈丽英，陈莲云，钟秀容. 幽门螺杆菌感染后胃粘膜屏障改变的形态学研究(系列1)：胃粘液细胞膜通透性的改变. 中华医学杂志，待发
7 Lee YS. Appraisal of polyethyleneimine used as a trace for anionic sites in human cardiac tissues with a brife reference to anionic molecular organization in altered basement membranes. J Mol Cardiol, 1986;18(5):529-539, http://www.100md.com(周琳瑛1 陈朝元2 梁 平1 陈丽英3 钟秀容1 陈莲云1)