三氧化二砷诱导胰腺癌细胞周期阻滞与凋亡作用
作者：陈其奎 袁世珍 黄志清
单位：510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院消化内科
关键词：
中华医学杂志980805 应用三氧化二砷(As2O3)体外、体内诱导胰腺癌细胞，初步观察其对细胞生长、周期分布和凋亡的影响，探讨As2O3治疗胰腺癌的可行性，为胰腺癌防治探索新途径。
一、材料与方法
1.材料：人胰腺癌细胞株SW1990由美国加州大学引进，Balb/c纯系裸小鼠(SPF级)由中山医科大学实验动物中心提供。As2O3注射液和细胞凋亡检测试剂盒分别由哈尔滨医科大学附属医院和德国Boehringer Mannheim公司提供。
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2.细胞生长抑制作用的检测采用MTT法：每组设5个重复孔，计算细胞活力。IC50表示抑制50%细胞生长的药物浓度。
3.细胞周期动力学和细胞凋亡的检测分别采用碘化丙啶染色法和FITC-TUNEL标记法[1]：2.5 μg/ml As2O3体外诱导SW1990细胞，每组重复3次，流式细胞仪检测， MUTICYCLE软件(Phoenix公司)分析细胞周期分布。增殖指数(PI)和凋亡指数(AI)分别为S、G2+M期细胞和凋亡细胞占测定细胞总数的百分率，AI/PI为凋亡与增殖细胞的比例。
4.肾包膜下(SRC)移植瘤抑制实验：雄性Balb/c裸小鼠8只，每只体重20～30 g，随机分为2组，每组4只，双肾包膜下植入胰腺癌移植瘤块。于接种48小时后每天按5 mg/kg As2O3，连续7天腹腔注射给药，对照组给等量生理盐水。分别于接种时和停药48小时后称重，解剖显微镜测量肿瘤长短径。计算肿瘤的体积改变(ΔTs)和裸鼠体重改变(ΔBw)。透射电镜观察SRC移植瘤的超微结构改变。
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5.统计学方法：采用F检验及均数t检验，应用POMS及SPSS统计软件进行统计学分析。
二、结果
1.MTT法检测As2O3对胰腺癌细胞生长的抑制作用：As2O3能有效抑制体外培养的SW1990细胞生长，该抑制作用具有时间与浓度依赖性(图1)。
图1 As2O3对SW1900细胞活力的影响0
2.As2O3对胰腺癌细胞周期及AI的影响：As2O3处理1天、3天和6天组SW1990细胞的G0/G1期细胞比例上升，3天和6天组S期细胞比例下降，PI从1天到6 天逐渐降低。As2O3能诱导1天、3天和6天组SW1990细胞凋亡，因而AI/PI比率增高，分别比对照组上升2～4倍(附表)。
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3.As2O3对裸鼠SRC胰腺癌移植瘤的抑制作用：As2O3能显著抑制SRC胰腺癌移植瘤的生长，对照组和治疗组△Ts分别为0.70±0.30 mm3和0.27±0.23 mm3(P<0.01)，但对荷瘤裸鼠体重变化无影响。
4.As2O3对胰腺癌移植瘤细胞超微结构的影响：As2O3组出现较多的具有凋亡特征细胞，表现为细胞质与细胞核固缩，核裂解，核间隙增宽，细胞出芽和凋亡小体形成(图2)。
图2 5 mg/kg As2O3处理裸鼠7天后，SRC移植瘤的凋亡胰腺癌细胞 ×8000
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附表 As2O3对SW1990细胞周期、PI和AI的影响(%，
±s) 组别
鼠数
G0/G1
S
PI
AI
AI/PI
对照组
3
45.5±1.1
33.5±1.7
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54.4±1.2
4.1±0.8
0.06±0.01
1天组
3
48.5±1.6*
32.2±2.3
51.2±1.4△
11.1±3.1*
0.22±0.06*
3天组
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3
52.2±0.4△
24.9±1.6△
48.6±0.9△
18.6±5.2△
0.39±0.11△
6天组
3
55.8±1.4△
29.1±0.8*
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44.1±0.7△
14.9±2.6△
0.34±0.06△
F检验，* 与对照组相比，P<0.05；△ 与对照组相比，P<0.001
三、讨论
本研究发现，As2O3对体外培养的胰腺癌细胞有抑制作用，体外6天组的IC50接近0.625 μg/ml，裸鼠体内能抑制胰腺癌SRC移植瘤生长，表明胰腺癌SW1990细胞株对As2O3具有较好的敏感性。进一步研究表明，As2O3能诱导SW1990细胞株的细胞周期阻滞和细胞凋亡。
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As2O3诱导胰腺癌细胞周期阻滞和凋亡的机制不明。在ALP的研究中，发现As2O3诱导的细胞凋亡过程可能与降低PML/PML—RARα融合基因/蛋白和bcl-2基因的表达有关[2]，推测As2O3诱导的凋亡与凋亡相关基因和有关酶类改变有一定的关系。As2O3诱导胰腺癌或其他实体癌肿细胞凋亡机制是否与上述相同，抑或有新的机理存在，有待进一步研究。
参考文献
1 Gorczyca W, Gong JP, Darzynkiewcz Z. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick transtation assays, Cancer Res, 1993, 53：1945-1951.
2 Chen GQ, Zhu J, Shi XG, et al. As2O3 induces NB4 cell apoptosis with down-regulation of bcl-2 gene and modulation of PML-RARα proteins. Blood, 1996, 88：1052-1061.
(收稿：1997-12-10 修回：1998-04-03), 百拇医药
单位：510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院消化内科
关键词：
中华医学杂志980805 应用三氧化二砷(As2O3)体外、体内诱导胰腺癌细胞，初步观察其对细胞生长、周期分布和凋亡的影响，探讨As2O3治疗胰腺癌的可行性，为胰腺癌防治探索新途径。
一、材料与方法
1.材料：人胰腺癌细胞株SW1990由美国加州大学引进，Balb/c纯系裸小鼠(SPF级)由中山医科大学实验动物中心提供。As2O3注射液和细胞凋亡检测试剂盒分别由哈尔滨医科大学附属医院和德国Boehringer Mannheim公司提供。
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2.细胞生长抑制作用的检测采用MTT法：每组设5个重复孔，计算细胞活力。IC50表示抑制50%细胞生长的药物浓度。
3.细胞周期动力学和细胞凋亡的检测分别采用碘化丙啶染色法和FITC-TUNEL标记法[1]：2.5 μg/ml As2O3体外诱导SW1990细胞，每组重复3次，流式细胞仪检测， MUTICYCLE软件(Phoenix公司)分析细胞周期分布。增殖指数(PI)和凋亡指数(AI)分别为S、G2+M期细胞和凋亡细胞占测定细胞总数的百分率，AI/PI为凋亡与增殖细胞的比例。
4.肾包膜下(SRC)移植瘤抑制实验：雄性Balb/c裸小鼠8只，每只体重20～30 g，随机分为2组，每组4只，双肾包膜下植入胰腺癌移植瘤块。于接种48小时后每天按5 mg/kg As2O3，连续7天腹腔注射给药，对照组给等量生理盐水。分别于接种时和停药48小时后称重，解剖显微镜测量肿瘤长短径。计算肿瘤的体积改变(ΔTs)和裸鼠体重改变(ΔBw)。透射电镜观察SRC移植瘤的超微结构改变。
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5.统计学方法：采用F检验及均数t检验，应用POMS及SPSS统计软件进行统计学分析。
二、结果
1.MTT法检测As2O3对胰腺癌细胞生长的抑制作用：As2O3能有效抑制体外培养的SW1990细胞生长，该抑制作用具有时间与浓度依赖性(图1)。
图1 As2O3对SW1900细胞活力的影响0
2.As2O3对胰腺癌细胞周期及AI的影响：As2O3处理1天、3天和6天组SW1990细胞的G0/G1期细胞比例上升，3天和6天组S期细胞比例下降，PI从1天到6 天逐渐降低。As2O3能诱导1天、3天和6天组SW1990细胞凋亡，因而AI/PI比率增高，分别比对照组上升2～4倍(附表)。
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3.As2O3对裸鼠SRC胰腺癌移植瘤的抑制作用：As2O3能显著抑制SRC胰腺癌移植瘤的生长，对照组和治疗组△Ts分别为0.70±0.30 mm3和0.27±0.23 mm3(P<0.01)，但对荷瘤裸鼠体重变化无影响。
4.As2O3对胰腺癌移植瘤细胞超微结构的影响：As2O3组出现较多的具有凋亡特征细胞，表现为细胞质与细胞核固缩，核裂解，核间隙增宽，细胞出芽和凋亡小体形成(图2)。
图2 5 mg/kg As2O3处理裸鼠7天后，SRC移植瘤的凋亡胰腺癌细胞 ×8000
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附表 As2O3对SW1990细胞周期、PI和AI的影响(%，
±s) 组别鼠数
G0/G1
S
PI
AI
AI/PI
对照组
3
45.5±1.1
33.5±1.7
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54.4±1.2
4.1±0.8
0.06±0.01
1天组
3
48.5±1.6*
32.2±2.3
51.2±1.4△
11.1±3.1*
0.22±0.06*
3天组
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3
52.2±0.4△
24.9±1.6△
48.6±0.9△
18.6±5.2△
0.39±0.11△
6天组
3
55.8±1.4△
29.1±0.8*
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44.1±0.7△
14.9±2.6△
0.34±0.06△
F检验，* 与对照组相比，P<0.05；△ 与对照组相比，P<0.001
三、讨论
本研究发现，As2O3对体外培养的胰腺癌细胞有抑制作用，体外6天组的IC50接近0.625 μg/ml，裸鼠体内能抑制胰腺癌SRC移植瘤生长，表明胰腺癌SW1990细胞株对As2O3具有较好的敏感性。进一步研究表明，As2O3能诱导SW1990细胞株的细胞周期阻滞和细胞凋亡。
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As2O3诱导胰腺癌细胞周期阻滞和凋亡的机制不明。在ALP的研究中，发现As2O3诱导的细胞凋亡过程可能与降低PML/PML—RARα融合基因/蛋白和bcl-2基因的表达有关[2]，推测As2O3诱导的凋亡与凋亡相关基因和有关酶类改变有一定的关系。As2O3诱导胰腺癌或其他实体癌肿细胞凋亡机制是否与上述相同，抑或有新的机理存在，有待进一步研究。
参考文献
1 Gorczyca W, Gong JP, Darzynkiewcz Z. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick transtation assays, Cancer Res, 1993, 53：1945-1951.
2 Chen GQ, Zhu J, Shi XG, et al. As2O3 induces NB4 cell apoptosis with down-regulation of bcl-2 gene and modulation of PML-RARα proteins. Blood, 1996, 88：1052-1061.
(收稿：1997-12-10 修回：1998-04-03), 百拇医药