肝脏和肺脏醛固酮合成酶基因CYP11B2 mRNA的表达
作者：吴平生 戴云 刘宏 郭志刚 张远慧 刘伊丽 梁欣伟 张榕华 赖文岩
单位：510515 广州，第一军医大学附属南方医院心内科
关键词：
中华医学杂志980837 曾有组织存在肾素—血管紧张素系统的报道，而没有组织存在醛固酮的证明。现将我们对肾上腺外组织—肺脏及肝脏合成醛固酮研究报道如下。
一、材料和方法
1.提取 总RNA：SD大鼠200～250 g，乙醚麻醉，留取肺、肝脏及肾上腺，液氮中速冻，用6 mmol/L异硫氰酸胍(德国SERVA产品)溶液提取总RNA，于紫外分光光度计260 nm处测量总RNA含量。
2.RT-PCR扩增醛固酮合成酶基因(P450aldo，又名CYP11B2)：取1 μg总RNA行RT-PCR扩增，RT试剂盒购自宝灵曼公司，为AMV逆转录酶，反应温度25 ℃，10分钟，42 ℃ 60分钟。CYP11B2 PCR引物序列分别为：5′-ACCATGGATGTCCAGCAA-3′和5′-GAGAGCTGCCGAGTCTGA-3′；扩增该基因第657-954位硷基，引物由上海细胞所合成。Taq酶为Promega产品，PCR反应温度分别为变性94℃ 1分钟，退火56℃ 1分钟，延伸72 ℃分钟，循环30次。取6 μl PCR产物于1.5%琼脂糖中电泳。
, http://www.100md.com
3.Southern blot杂交：RT-PCR产物电泳后转移至Hybond N+尼龙膜上，分别与地戈辛随机引物标记(宝灵曼公司)的CYP11B2 cDNA杂交。于55 ℃预杂交6小时，杂交18小时。按要求洗膜、显色。
4.原位杂交：按照Yabu M修饰法，SD大鼠乙醚麻醉，用生理盐水及4%多聚甲醛灌注后，留取肝脏和肺脏，在多聚甲醛固定液中于4 ℃浸泡4小时，冰冻切片，厚度20 μm。原位杂交前，用PBS洗，并于37 ℃用2 μg/ml蛋白酶K处理30分钟，4%多聚甲醛固定10分钟，PBS再洗，脱水。室温预杂交8小时；在杂交液加入地戈辛随机引物标记(如上述)的CYP11B2 cDNA 0.25 μg/ml，42 ℃杂交24小时。杂交毕后，按要求洗片、显色。
5.组织学：肺组织石蜡切片用McNary法染色。肝组织冰冻切片在0.02%氯化金溶液中室温浸泡6小时，然后在5%硫代硫酸钠中放5分钟后封片。光镜下观察切片。
, 百拇医药
二、结果
在肾上腺、肺及肝脏的电泳带中可清楚地看到297 bp CYP11B2的转录产物。原位杂交表明在肝的储脂细胞(伊藤细胞，图1)及肺的Ⅱ型肺泡细胞(图2)的胞浆内可见CYP11B2探针着色。这些细胞分别由氯化金染色及Mc CNary法染色进一步确定。
三、讨论
醛固酮生物合成由两个基因控制，其一是P45011β(CYP11B1)，主要负责醛固酮生物合成早期阶段即醛固酮前体物质；其二是CYP11B2，编码醛固酮的最终合成，是醛固酮合成的标志基因。本结果表明CYP11B2 mRNA在肝脏及肺脏有表达，位于肝脏的伊藤细胞和肺的Ⅱ型肺泡上皮细胞。现已证明肾上腺外组织，包括血管床、大脑、肝脏和肺脏能合成醛固酮。细胞类型包括血管内皮及平滑肌细胞、肝脏的伊藤细胞及肺的Ⅱ型肺泡细胞。
图1 CYP11B2 mRNA在肝脏储脂细胞的表达，氯化金染色 ×40 图2 CYP11B2 mRNA在Ⅱ型肺泡细胞中的表达，氯化金染色 ×40
本课题为广东省自然科学基金资助项目(950555)
(收稿：1997-07-21 修回：1998-02-16), 百拇医药
单位：510515 广州，第一军医大学附属南方医院心内科
关键词：
中华医学杂志980837 曾有组织存在肾素—血管紧张素系统的报道，而没有组织存在醛固酮的证明。现将我们对肾上腺外组织—肺脏及肝脏合成醛固酮研究报道如下。
一、材料和方法
1.提取 总RNA：SD大鼠200～250 g，乙醚麻醉，留取肺、肝脏及肾上腺，液氮中速冻，用6 mmol/L异硫氰酸胍(德国SERVA产品)溶液提取总RNA，于紫外分光光度计260 nm处测量总RNA含量。
2.RT-PCR扩增醛固酮合成酶基因(P450aldo，又名CYP11B2)：取1 μg总RNA行RT-PCR扩增，RT试剂盒购自宝灵曼公司，为AMV逆转录酶，反应温度25 ℃，10分钟，42 ℃ 60分钟。CYP11B2 PCR引物序列分别为：5′-ACCATGGATGTCCAGCAA-3′和5′-GAGAGCTGCCGAGTCTGA-3′；扩增该基因第657-954位硷基，引物由上海细胞所合成。Taq酶为Promega产品，PCR反应温度分别为变性94℃ 1分钟，退火56℃ 1分钟，延伸72 ℃分钟，循环30次。取6 μl PCR产物于1.5%琼脂糖中电泳。
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3.Southern blot杂交：RT-PCR产物电泳后转移至Hybond N+尼龙膜上，分别与地戈辛随机引物标记(宝灵曼公司)的CYP11B2 cDNA杂交。于55 ℃预杂交6小时，杂交18小时。按要求洗膜、显色。
4.原位杂交：按照Yabu M修饰法，SD大鼠乙醚麻醉，用生理盐水及4%多聚甲醛灌注后，留取肝脏和肺脏，在多聚甲醛固定液中于4 ℃浸泡4小时，冰冻切片，厚度20 μm。原位杂交前，用PBS洗，并于37 ℃用2 μg/ml蛋白酶K处理30分钟，4%多聚甲醛固定10分钟，PBS再洗，脱水。室温预杂交8小时；在杂交液加入地戈辛随机引物标记(如上述)的CYP11B2 cDNA 0.25 μg/ml，42 ℃杂交24小时。杂交毕后，按要求洗片、显色。
5.组织学：肺组织石蜡切片用McNary法染色。肝组织冰冻切片在0.02%氯化金溶液中室温浸泡6小时，然后在5%硫代硫酸钠中放5分钟后封片。光镜下观察切片。
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二、结果
在肾上腺、肺及肝脏的电泳带中可清楚地看到297 bp CYP11B2的转录产物。原位杂交表明在肝的储脂细胞(伊藤细胞，图1)及肺的Ⅱ型肺泡细胞(图2)的胞浆内可见CYP11B2探针着色。这些细胞分别由氯化金染色及Mc CNary法染色进一步确定。
三、讨论
醛固酮生物合成由两个基因控制，其一是P45011β(CYP11B1)，主要负责醛固酮生物合成早期阶段即醛固酮前体物质；其二是CYP11B2，编码醛固酮的最终合成，是醛固酮合成的标志基因。本结果表明CYP11B2 mRNA在肝脏及肺脏有表达，位于肝脏的伊藤细胞和肺的Ⅱ型肺泡上皮细胞。现已证明肾上腺外组织，包括血管床、大脑、肝脏和肺脏能合成醛固酮。细胞类型包括血管内皮及平滑肌细胞、肝脏的伊藤细胞及肺的Ⅱ型肺泡细胞。
图1 CYP11B2 mRNA在肝脏储脂细胞的表达，氯化金染色 ×40 图2 CYP11B2 mRNA在Ⅱ型肺泡细胞中的表达，氯化金染色 ×40
本课题为广东省自然科学基金资助项目(950555)
(收稿：1997-07-21 修回：1998-02-16), 百拇医药
参见：首页 > 医疗版 > 疾病专题 > 内分泌科 > 肾上腺疾病 > 原发性醛固酮增多症