大鼠烫伤致肠道免疫屏障损伤与血浆内毒素变化的关系
作者:于 勇 田惠民 施志国 姚咏明 王亚平 陆连荣 于 燕 常国友 马诺山 盛志勇
单位:解放军304医院创伤外科中心 北京市 100037
关键词:烧伤/并发症;肠/病理学;内毒素/血症;疾病模型,动物
华人消化杂志980819Relationship between endotoxemia and dysfunction of intestinal immuno-barrier after scald in rats
YU Yong, TIAN Hui-Min, SHI Zhi-Guo, YAO Yong-Ming, WANG Ya-Ping, LU Lian-Rong, YU Yan, CHANG Guo-You, MA Nuo-Shan and SHENG Zhi-Yong
, 百拇医药
Trauma Center, Chinese PLA 304 Hospital, Beijing 100037, China
Subject headings burns/complications; intestine/pathology; endotoxemia; disease models, animal
Abstract
AIM To investigate the intestinal immunological factor associated with development of endotoxiemia and gut-derived sepsis after burns.
METHODS The level of IgA in intestinal content, the coat rate of intestinal bacteria by IgA and endotoxin level were measured in rats (n=40) after 40% total body surface area (TBSA) full-thickness scald injury.
, 百拇医药
RESULTS The IgA level in intestinal content and coat rate of intestinal bacteria by IgA(%) were significantly lower (341.5μg/g±40.2μg/g and 44.3%±6.5%) than that in control group (n=10) (562.9μg/g±172.0μg/g and 63.9%±6.5%, both P<0.01), and the endotoxin levels in plasma were significantly higher (0.113kEU/L±0.039kEU/L) than that in control group (0.083kEU/L±0.007kEU/L, P<0.05) on day 3 following scald injury.
CONCLUSION The changes in level and function of IgA may play an important role in the development of endotoxemia and gut-derived sepsis after major burns.
, http://www.100md.com
中国图书资料分类号 R644.06
摘 要
目的 探讨导致烧伤后血浆内毒素水平升高和肠源性脓毒症的肠道免疫学因素.
方法 采用40%体表面积(TBSA)Ⅲ度烫伤大鼠模型(n=40),对肠道内IgA含量、肠道细菌IgA包被率和血浆内毒素的变化进行动态观察.
结果 伤后血浆内毒素水平(kEU/L)明显升高,伤后3d达0.113±0.039,(对照组,n=10,0.083±0.007,P<0.05);肠内容物中IgA含量(μg/g) 逐渐下降,伤后1d,3d均明显降低,其中3d达341.5±40.2(对照组为562.9±172.0,P<0.01),为最低点;而后逐渐回升,至伤后10d已接近对照组水平. 烫伤后各时相点肠道细菌的IgA包被率均明显降低,伤后3d降至44.3%±6.5%(对照组为63.9%±6.5%,P<0.01).
, http://www.100md.com
结论 烧伤后肠道内IgA含量与功能的异常可能是导致内毒素血症和肠源性脓毒症的重要原因之一.
0 引言
严重烧伤可以破坏肠道屏障,促使肠道内的细菌、毒素等有害物质穿过肠壁,侵入血液及脏器[1]. 特别是肠道内的内毒素在伤后大量入血,可激发全身炎症反应,导致脓毒症,甚至威胁患者生命[2]. 但关于烧伤后肠道屏障的损伤及其与内毒素血症发生的关系仍不十分清楚. 因此,我们以肠内容物IgA含量及肠道细菌IgA包被率作为肠道免疫屏障的观测指标,对大鼠烫伤后肠道免疫屏障的损伤情况,血浆内毒素水平的变化及两者之间的相互关系进行了初步探索.
1 材料和方法
1.1 材料 Wistar大鼠50只(军事医学科学院实验动物场提供),雌雄各半,体重220g~300g,随机分为:对照组(n=10)和烫伤组(n=40). 实验当日ip戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后,背部脱毛,将背部浸于沸水中12s,造成40%体表面积(TBSA)Ⅲ度烫伤(对照组不烫伤). 伤后1h,烫伤动物腹部sc生理盐水抗休克(50mL/kg). 烫伤组动物分别于伤后1,3,7,10d行腹主动脉穿刺抽血处死(每个时相点n=10),对照组动物于处理后1d用同样方法抽血处死.
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 肠内容物IgA含量测定 留取回肠末端肠内容物约0.1g,稀释后取上清为待测标本. 采用ELISA间接夹心法测定肠内容物中IgA. 所用小鼠抗大鼠IgA单抗(MARA-1)、羊抗大鼠IgA抗血清(SCA-1)及大鼠IgA参考血清均为比利时Bazin教授惠赠. 酶标抗体(驴抗羊IgG-HRP)由军事医学科学院五所提供.
1.2.2 肠道细菌IgA包被率的测定 回肠内容物1∶100稀释后涂片,干燥后固定;滴加羊抗大鼠IgA抗血清,置湿盒内过夜;滴加驴抗羊IgG荧光抗体(军事医学科学院五所提供),孵育后振荡清洗,干燥后封片,用Olympus PM-10AD万能显微镜观察结果. 以显示为完整、明亮狭长圆环状菌体为被IgA包被的细菌,观察100个菌体计算细菌的IgA包被率.
1.2.3 血浆内毒素水平测定 严格无菌操作留取血标本,采用姚咏明et al[3]建立的改良过氯酸法预处理血浆(试剂为日本生化学工业株式会社产品)、鲎试剂基质显色法定量测定血浆内毒素水平(试剂购于上海医学化验所)
, 百拇医药
2 结果
2.1 肠内容物IgA含量 烫伤后肠内容物中IgA含量逐渐下降,伤后1d,3d均明显低于对照组,其中d3达最低点(P<0.01). 而后逐渐回升,至伤后d10,已接近对照组水平(表1).
2.2 肠道细菌的IgA包被率 烫伤后各时间点菌体荧光强度均明显减弱,肠道细菌的IgA包被率也明显降低(P<0.01,表1).
2.3 血浆内毒素水平 伤后血浆内毒素水平逐渐升高,在伤后d3达高峰,明显高于对照组(P<0.05). 而后逐渐下降,至伤后d10,已接近对照组水平(表1).
表1 烫伤大鼠肠道免疫与血浆内毒素水平 (±s)
组别
, 百拇医药
IgA含量
(μg/g)
细菌IgA包被率
(%)
血浆内毒素水平
(kEU/L)
对照
562.9±172.0
63.9±6.5
0.083±0.007
伤后
1d
, http://www.100md.com 383.5±153.6a
48.5±8.6a
0.094±0.020
3d
341.5±40.2b
44.3±11.8b
0.113±0.039a
7d
473.9±153.5
46.8±8.2b
, 百拇医药
0.082±0.005
10d
500.2±125.2
42.6±13.1b
0.088±0.009
aP<0.05,bP<0.01,vs 对照组.
3 讨论
IgA是体内分泌量最大的免疫球蛋白,能中和病毒、毒素和酶等生物活性抗原;与补体、溶菌酶协同还具有杀菌作用[4],具有广泛的保护作用. IgA阻止细菌及其毒素对机体的伤害主要通过两种方式实现,其一是阻止细菌对肠上皮细胞表面的吸附. 因为细菌吸附到肠上皮表面,即可以避免被肠蠕动时肠内容物的定向运动清除掉,有利于其穿透肠上皮,向其他部位扩散. 同时,细菌分泌的有毒产物也可以直接作用于靶细胞,有效地发挥毒性作用[5]. 其二是IgA对肠道菌群中的革兰阴性菌具有特殊的亲合力,可以包被这些细菌[6]. 大量IgA与细菌结合,细菌被IgA包被之后,细菌表面与肠上皮结合的特异性部位被封闭,对机体有害的代谢产物释放受抑制,最终阻止其穿过肠上皮向体内其他部位扩散[7]. 此外,IgA的杀菌作用使被包被的细菌本身也受到某种程度的抑制,活力、毒力相应降低. 烧伤后肠道内毒素移位是造成内毒素血症的主要原因;其入血途径可能有两种;即游离内毒素直接入血和菌体入血后释放或崩解产生内毒素;IgA的保护作用恰恰可以阻断肠道内毒素入血的途径,因此,可以认为IgA是肠道中能够直接对抗细菌与毒素对机体伤害的主要免疫成分之一.
, 百拇医药
我们观察到,大鼠伤后d3,血浆内毒素水平明显升高,肠内容物中IgA含量在伤后d1明显下降,在d3降至最低点,二者成负相关;另一方面,烫伤后大鼠肠道细菌IgA包被率也明显降低,而且至伤后d10,始终处于一个较低的水平. 伤后肠内容物中IgA含量的下降可能是由于内脏缺血,引起肝、肠等主要合成IgA的组织损伤,使IgA的合成减少,以及大量IgA聚集于烧伤部位[8],使IgA的消耗增加等因素造成的. 而肠道细菌IgA包被率降低可能与伤后肠内IgA减少有关,但也不能排除伤后IgA组成、结构的改变,导致其功能异常的可能. 肠道细菌IgA包被率在伤后一直处于较低水平,与肠内容物中IgA含量的变化不平行,这可能是由于伤后肠道内IgA包被细菌功能的恢复 与IgA含量的恢复相比,需要更长的时间. 至于这一变化与血浆内毒素水平变化的不同,则可能是体内其他防御机能代偿的结果. 上述结果提示伤后肠道内IgA杀菌、抑菌、阻止细菌对肠上皮吸附以及中和毒素等保护功能被削弱,这一改变与伤后内毒素血症的发生有着密切关系.
烧伤后内毒素血症是导致严重并发症和病情恶化的主要原因之一,本实验结果表明,烧伤后肠道内IgA的含量与功能的异常,可能是造成内毒素血症的一个重要原因;因此,保护肠道免疫屏障,维持肠道内IgA含量与功能的正常,对于防止烧伤后内毒素血症的发生,提高烧伤救治水平可能具有一定的意义.
, 百拇医药
于勇,男,1957-02-28生,安徽省宿县人,汉族. 1983年山西医学院毕业,1995年获解放军军医学院硕士学位,助理研究员,主要从事创伤后肠源性脓毒症发生机制及防治的研究,发表论文20篇.
通讯作者 于勇,100037,解放军304医院创伤外科中心,北京市海淀区阜城路51号.
Correspondence to:YU Yong, Trauma Center, Chinese PLA 304 Hospital, 51 Fuchenglu, Haidian District, Beijing 100037, China
Tel. +86·10·66867394
收稿日期 1998-05-06
4 参考文献
, http://www.100md.com
1 Saadia R, Scheih M, MacFarlane C, Boffard KD. Gut barrier function and the surgeon. Br J Surg, 1990;77(5):487-492
2 Herndon DN, Zeigler ST. Bacterial translocation after thermal injury. Crit Care Med, 1993;21(2):S50-S54
3 姚咏明,田惠民,王亚平,于燕,施志国,盛志勇.过氯酸法预处理血浆定量检测微量内毒素的鲎试验方法及其应用. 上海医学检验杂志,1993;8(1):31-33
4 Doe WF. The intestinal immune system. Gut, 1989;30(12):1679-1685
, 百拇医药
5 Alverdy JC, Aoys E. The effect of dexamethasone and endotoxemia administration on biliary IgA and bacterial adherence. J Surg Res, 1992;53(11):450-454
6 Alverdy J, Aoys E. The effect of glucocorticoid administration on bacterial translocation. Ann Surg, 1991;214(6):719-723
7 Diebel LN, Liberati DM, Brown WJ, Dulchvsky SA, Painter TM, Diflio CA et al. Secretory immunoglobulin a block hypoxia-augmented bacterial passage across Madin-Darby Canine kidney cell monolayers. J Trauma, 1997;43(5):759-763
8 Cappeler WA, Bloch KJ, Hatz RA, Carter EA, Fagundes J, Sullivan DA et al.Reduction in biliary IgA after burn injury. Ann Surg, 1992;215(4):338-343, http://www.100md.com
单位:解放军304医院创伤外科中心 北京市 100037
关键词:烧伤/并发症;肠/病理学;内毒素/血症;疾病模型,动物
华人消化杂志980819Relationship between endotoxemia and dysfunction of intestinal immuno-barrier after scald in rats
YU Yong, TIAN Hui-Min, SHI Zhi-Guo, YAO Yong-Ming, WANG Ya-Ping, LU Lian-Rong, YU Yan, CHANG Guo-You, MA Nuo-Shan and SHENG Zhi-Yong
, 百拇医药
Trauma Center, Chinese PLA 304 Hospital, Beijing 100037, China
Subject headings burns/complications; intestine/pathology; endotoxemia; disease models, animal
Abstract
AIM To investigate the intestinal immunological factor associated with development of endotoxiemia and gut-derived sepsis after burns.
METHODS The level of IgA in intestinal content, the coat rate of intestinal bacteria by IgA and endotoxin level were measured in rats (n=40) after 40% total body surface area (TBSA) full-thickness scald injury.
, 百拇医药
RESULTS The IgA level in intestinal content and coat rate of intestinal bacteria by IgA(%) were significantly lower (341.5μg/g±40.2μg/g and 44.3%±6.5%) than that in control group (n=10) (562.9μg/g±172.0μg/g and 63.9%±6.5%, both P<0.01), and the endotoxin levels in plasma were significantly higher (0.113kEU/L±0.039kEU/L) than that in control group (0.083kEU/L±0.007kEU/L, P<0.05) on day 3 following scald injury.
CONCLUSION The changes in level and function of IgA may play an important role in the development of endotoxemia and gut-derived sepsis after major burns.
, http://www.100md.com
中国图书资料分类号 R644.06
摘 要
目的 探讨导致烧伤后血浆内毒素水平升高和肠源性脓毒症的肠道免疫学因素.
方法 采用40%体表面积(TBSA)Ⅲ度烫伤大鼠模型(n=40),对肠道内IgA含量、肠道细菌IgA包被率和血浆内毒素的变化进行动态观察.
结果 伤后血浆内毒素水平(kEU/L)明显升高,伤后3d达0.113±0.039,(对照组,n=10,0.083±0.007,P<0.05);肠内容物中IgA含量(μg/g) 逐渐下降,伤后1d,3d均明显降低,其中3d达341.5±40.2(对照组为562.9±172.0,P<0.01),为最低点;而后逐渐回升,至伤后10d已接近对照组水平. 烫伤后各时相点肠道细菌的IgA包被率均明显降低,伤后3d降至44.3%±6.5%(对照组为63.9%±6.5%,P<0.01).
, http://www.100md.com
结论 烧伤后肠道内IgA含量与功能的异常可能是导致内毒素血症和肠源性脓毒症的重要原因之一.
0 引言
严重烧伤可以破坏肠道屏障,促使肠道内的细菌、毒素等有害物质穿过肠壁,侵入血液及脏器[1]. 特别是肠道内的内毒素在伤后大量入血,可激发全身炎症反应,导致脓毒症,甚至威胁患者生命[2]. 但关于烧伤后肠道屏障的损伤及其与内毒素血症发生的关系仍不十分清楚. 因此,我们以肠内容物IgA含量及肠道细菌IgA包被率作为肠道免疫屏障的观测指标,对大鼠烫伤后肠道免疫屏障的损伤情况,血浆内毒素水平的变化及两者之间的相互关系进行了初步探索.
1 材料和方法
1.1 材料 Wistar大鼠50只(军事医学科学院实验动物场提供),雌雄各半,体重220g~300g,随机分为:对照组(n=10)和烫伤组(n=40). 实验当日ip戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后,背部脱毛,将背部浸于沸水中12s,造成40%体表面积(TBSA)Ⅲ度烫伤(对照组不烫伤). 伤后1h,烫伤动物腹部sc生理盐水抗休克(50mL/kg). 烫伤组动物分别于伤后1,3,7,10d行腹主动脉穿刺抽血处死(每个时相点n=10),对照组动物于处理后1d用同样方法抽血处死.
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 肠内容物IgA含量测定 留取回肠末端肠内容物约0.1g,稀释后取上清为待测标本. 采用ELISA间接夹心法测定肠内容物中IgA. 所用小鼠抗大鼠IgA单抗(MARA-1)、羊抗大鼠IgA抗血清(SCA-1)及大鼠IgA参考血清均为比利时Bazin教授惠赠. 酶标抗体(驴抗羊IgG-HRP)由军事医学科学院五所提供.
1.2.2 肠道细菌IgA包被率的测定 回肠内容物1∶100稀释后涂片,干燥后固定;滴加羊抗大鼠IgA抗血清,置湿盒内过夜;滴加驴抗羊IgG荧光抗体(军事医学科学院五所提供),孵育后振荡清洗,干燥后封片,用Olympus PM-10AD万能显微镜观察结果. 以显示为完整、明亮狭长圆环状菌体为被IgA包被的细菌,观察100个菌体计算细菌的IgA包被率.
1.2.3 血浆内毒素水平测定 严格无菌操作留取血标本,采用姚咏明et al[3]建立的改良过氯酸法预处理血浆(试剂为日本生化学工业株式会社产品)、鲎试剂基质显色法定量测定血浆内毒素水平(试剂购于上海医学化验所)
, 百拇医药
2 结果
2.1 肠内容物IgA含量 烫伤后肠内容物中IgA含量逐渐下降,伤后1d,3d均明显低于对照组,其中d3达最低点(P<0.01). 而后逐渐回升,至伤后d10,已接近对照组水平(表1).
2.2 肠道细菌的IgA包被率 烫伤后各时间点菌体荧光强度均明显减弱,肠道细菌的IgA包被率也明显降低(P<0.01,表1).
2.3 血浆内毒素水平 伤后血浆内毒素水平逐渐升高,在伤后d3达高峰,明显高于对照组(P<0.05). 而后逐渐下降,至伤后d10,已接近对照组水平(表1).
表1 烫伤大鼠肠道免疫与血浆内毒素水平 (±s)
组别
, 百拇医药
IgA含量
(μg/g)
细菌IgA包被率
(%)
血浆内毒素水平
(kEU/L)
对照
562.9±172.0
63.9±6.5
0.083±0.007
伤后
1d
, http://www.100md.com 383.5±153.6a
48.5±8.6a
0.094±0.020
3d
341.5±40.2b
44.3±11.8b
0.113±0.039a
7d
473.9±153.5
46.8±8.2b
, 百拇医药
0.082±0.005
10d
500.2±125.2
42.6±13.1b
0.088±0.009
aP<0.05,bP<0.01,vs 对照组.
3 讨论
IgA是体内分泌量最大的免疫球蛋白,能中和病毒、毒素和酶等生物活性抗原;与补体、溶菌酶协同还具有杀菌作用[4],具有广泛的保护作用. IgA阻止细菌及其毒素对机体的伤害主要通过两种方式实现,其一是阻止细菌对肠上皮细胞表面的吸附. 因为细菌吸附到肠上皮表面,即可以避免被肠蠕动时肠内容物的定向运动清除掉,有利于其穿透肠上皮,向其他部位扩散. 同时,细菌分泌的有毒产物也可以直接作用于靶细胞,有效地发挥毒性作用[5]. 其二是IgA对肠道菌群中的革兰阴性菌具有特殊的亲合力,可以包被这些细菌[6]. 大量IgA与细菌结合,细菌被IgA包被之后,细菌表面与肠上皮结合的特异性部位被封闭,对机体有害的代谢产物释放受抑制,最终阻止其穿过肠上皮向体内其他部位扩散[7]. 此外,IgA的杀菌作用使被包被的细菌本身也受到某种程度的抑制,活力、毒力相应降低. 烧伤后肠道内毒素移位是造成内毒素血症的主要原因;其入血途径可能有两种;即游离内毒素直接入血和菌体入血后释放或崩解产生内毒素;IgA的保护作用恰恰可以阻断肠道内毒素入血的途径,因此,可以认为IgA是肠道中能够直接对抗细菌与毒素对机体伤害的主要免疫成分之一.
, 百拇医药
我们观察到,大鼠伤后d3,血浆内毒素水平明显升高,肠内容物中IgA含量在伤后d1明显下降,在d3降至最低点,二者成负相关;另一方面,烫伤后大鼠肠道细菌IgA包被率也明显降低,而且至伤后d10,始终处于一个较低的水平. 伤后肠内容物中IgA含量的下降可能是由于内脏缺血,引起肝、肠等主要合成IgA的组织损伤,使IgA的合成减少,以及大量IgA聚集于烧伤部位[8],使IgA的消耗增加等因素造成的. 而肠道细菌IgA包被率降低可能与伤后肠内IgA减少有关,但也不能排除伤后IgA组成、结构的改变,导致其功能异常的可能. 肠道细菌IgA包被率在伤后一直处于较低水平,与肠内容物中IgA含量的变化不平行,这可能是由于伤后肠道内IgA包被细菌功能的恢复 与IgA含量的恢复相比,需要更长的时间. 至于这一变化与血浆内毒素水平变化的不同,则可能是体内其他防御机能代偿的结果. 上述结果提示伤后肠道内IgA杀菌、抑菌、阻止细菌对肠上皮吸附以及中和毒素等保护功能被削弱,这一改变与伤后内毒素血症的发生有着密切关系.
烧伤后内毒素血症是导致严重并发症和病情恶化的主要原因之一,本实验结果表明,烧伤后肠道内IgA的含量与功能的异常,可能是造成内毒素血症的一个重要原因;因此,保护肠道免疫屏障,维持肠道内IgA含量与功能的正常,对于防止烧伤后内毒素血症的发生,提高烧伤救治水平可能具有一定的意义.
, 百拇医药
于勇,男,1957-02-28生,安徽省宿县人,汉族. 1983年山西医学院毕业,1995年获解放军军医学院硕士学位,助理研究员,主要从事创伤后肠源性脓毒症发生机制及防治的研究,发表论文20篇.
通讯作者 于勇,100037,解放军304医院创伤外科中心,北京市海淀区阜城路51号.
Correspondence to:YU Yong, Trauma Center, Chinese PLA 304 Hospital, 51 Fuchenglu, Haidian District, Beijing 100037, China
Tel. +86·10·66867394
收稿日期 1998-05-06
4 参考文献
, http://www.100md.com
1 Saadia R, Scheih M, MacFarlane C, Boffard KD. Gut barrier function and the surgeon. Br J Surg, 1990;77(5):487-492
2 Herndon DN, Zeigler ST. Bacterial translocation after thermal injury. Crit Care Med, 1993;21(2):S50-S54
3 姚咏明,田惠民,王亚平,于燕,施志国,盛志勇.过氯酸法预处理血浆定量检测微量内毒素的鲎试验方法及其应用. 上海医学检验杂志,1993;8(1):31-33
4 Doe WF. The intestinal immune system. Gut, 1989;30(12):1679-1685
, 百拇医药
5 Alverdy JC, Aoys E. The effect of dexamethasone and endotoxemia administration on biliary IgA and bacterial adherence. J Surg Res, 1992;53(11):450-454
6 Alverdy J, Aoys E. The effect of glucocorticoid administration on bacterial translocation. Ann Surg, 1991;214(6):719-723
7 Diebel LN, Liberati DM, Brown WJ, Dulchvsky SA, Painter TM, Diflio CA et al. Secretory immunoglobulin a block hypoxia-augmented bacterial passage across Madin-Darby Canine kidney cell monolayers. J Trauma, 1997;43(5):759-763
8 Cappeler WA, Bloch KJ, Hatz RA, Carter EA, Fagundes J, Sullivan DA et al.Reduction in biliary IgA after burn injury. Ann Surg, 1992;215(4):338-343, http://www.100md.com