胆囊肿瘤组织中细胞凋亡及bcl-2基因的研究
作者：陈汝福 邹声泉 钱家勤
单位：同济医科大学附属同济医院普外科 湖北省武汉市 430030
关键词：胆囊肿瘤/病理学；脱噬作用；癌基因；基因表达调控
华人消化杂志980812 Apoptosis and expression of bcl-2 gene in gallbladder neoplasms
CHEN Ru-Fu, ZOU Sheng-Quan and QIAN Jia-Qin
Department of General Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030, Hubei Province, China
, 百拇医药
Subject headings gallbladder neoplasms/pathology; apoptosis; oncogenes; gene expression regulation
Abstract
AIM To investigate the effects of apoptosis and bcl-2 gene in gallbladder neoplasms.
METHODS The number of apoptosis and the bcl-2 positive expression rate were observed in 24 cases of gallbladder carcinomas and 16 gallbladder adenomas,using in situ and labeling (ISEL) method and immunohistochemical staining.
, 百拇医药
RESULTS The incidence and number of apoptosis in gallbladder adenoma was significantly lower than in gallbladder carcinoma (Nevin stage S4,S5) (5.6% vs 100%,χ2=36.115，P<0.01), and well differentiated gallbladder carcinoma had less apoptosis cells than poorly differentiated gallbladder carcinoma (Nevin stage S1-S3, χ2=19.05，P<0.01). In bcl-2 positive expression, there was no significant difference between gallbladder carcinoma and gallbladder adenoma (χ2=1.111，P>0.05). The expression of bcl-2 was related to apoptosis in gallbladder carcinoma (χ2=11.82，P<0.01).
, 百拇医药
CONCLUSION The rate of apoptosis may be a perfect prognostic index for gallbladder carcinoma, and apoptosis may play an important role in the pathogenesis of gallbladder carcinoma.
中国图书资料分类号 R 735.8
摘 要
目的 探讨细胞凋亡及其调控基因bcl-2在胆囊癌发生发展中的作用.
方法 用原位末端标记法(ISEL)和免疫组化ABC法对24例胆囊癌和16例胆囊腺瘤中的凋亡细胞及其调控基因bcl-2的表达产物进行了检测. 同时观察胆囊癌中的调亡细胞与胆囊癌病理类型、分化程度和浸润转移的关系，分析bcl-2基因对细胞凋亡的调控作用.
, http://www.100md.com
结果 胆囊癌、胆囊腺瘤中的细胞凋亡发生率分别为100%和5.6%；胆囊癌中的凋亡细胞数明显高于胆囊腺瘤(χ2=36.111，P<0.01)；低分化腺癌及Nevin分期S1～S3胆囊癌中的凋亡细胞数明显高于高分化及Nevin分期S4，S5者(χ2=19.051，P<0.01). 高分化腺癌中的凋亡细胞多呈点状分布，低分化腺癌及转移性胆囊癌中的凋亡细胞呈片状或块状分布. bcl-2基因在胆囊癌和胆囊腺瘤中的表达无显著差异(χ2=1.111，P>0.05). 在胆囊癌中，bcl-2产物阳性表达与细胞凋亡密切相关(χ2=11.82，P<0.01).
结论 细胞凋亡bcl-2基因在胆囊癌发生发展中起重要作用.
0 引言
, 百拇医药 为探讨细胞凋亡及bcl-2基因在胆囊癌形成和发展中的作用，我们应用原位末端标记法(ISEL)和免疫组化方法对40例胆囊良恶性肿瘤组织中的凋亡细胞和bcl-2基因产物进行了检测，结果报告如下.
1 材料和方法
1.1 材料 收集同济医院1989/ 1996间手术切除的胆囊癌标本24例，胆囊腺瘤标本16例，所有标本均经病理学证实. 其中高分化腺癌14例，低分化腺癌8例，未分化癌2例. Nevin分期S1，S2，S3期11例；S4，S5期13例. 全部标本均为存档资料，均经100 mL/ L福尔马林固定，石蜡包埋，每个蜡块行4 μm连续切片4张.
1.2 方法 Dig-dUTP,dNTP,Klenow酶、NTB购于德国Boehringer Mannheim生物技术公司. bcl-2单抗为Santa-Cruz生物公司产品. 细胞凋亡检测采用ISEL法，bcl-2检测采用免疫组化ABC法. ISEL的步骤为：切片常规二甲苯脱蜡及逐级水化，置2×SSC溶液中加热，蛋白酶K消化，流水冲洗终止反应，用含量Tri-Cl, MgCl,β-巯基乙醇、牛血清蛋白的缓冲液漂洗，置湿盒内加标记的d-NTP，dig-dUTP，Klenow酶，1 mL/ L H2O2的PBS阻断内源性过氧化酶，PBS冲洗后置湿盒内dig-Ab点片，加入NBT显色，脱水，封片. 用已知的肝癌凋亡细胞为阳性片为对照. bcl-2染色按免疫组化ABC法常规流程进行，DAB显色.
, http://www.100md.com
统计学处理 χ2检验，四格表确切概率法.
2 结果
细胞核内呈蓝紫色反应者为凋亡细胞. 每个标本均取5个高倍视野，计算每个视野内的凋亡细胞数目，取5个高倍视野的平均数，分为0，+(1～10),++(11～20),+++(≥21). bcl-2以胞质内呈现棕黄色颗粒为阳性.
全部胆囊癌中均可见凋亡细胞，16例胆囊腺瘤中仅1例发现有少量凋亡细胞，且位于腺瘤的表面. 高分化胆囊癌中的凋亡细胞多位于癌实质中央，呈散在点状分布(图1)；低分化及有转移的胆囊癌中的凋亡细胞多位于肿瘤的边缘，中央区多为坏死组织，凋亡细胞数量多且多呈片状或块状分布(图2). 胆囊癌中的细胞凋亡数显著高于胆囊腺瘤(χ2=36.111，P<0.01)；低分化及Nevin分期S4，S5的胆囊癌明显高于高分化及Nevin分期S1，S2，S3者(χ2=19.051，P<0.01，表1). bcl-2在胆囊腺瘤和胆囊癌中的阳性率为37.5%和54.2%. 胆囊癌中的凋亡细胞数与bcl-2的阳性表达呈负相关(表2，图3).
, http://www.100md.com
表1 胆囊肿瘤中细胞凋亡及bcl-2的表达 类 型
n
凋亡细胞
Bcl-2
0
+
++
+++
+
-
胆囊腺瘤
16
15
, 百拇医药
1
0
0
6
10
胆囊腺癌
24
0
14
3
7b
13
11c
, 百拇医药
高分化腺癌
14
0
13
1
0
7
7
低分化腺癌
0
1
2
5d
, 百拇医药 5
3
未分化癌
0
0
0
2d
1
1
Nevin分期 S1-S3
11
0
9
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2
0
7
4
S4，S5
13
0
5
1
7a
6
7
aP<0.05，vs S1～S3组；bP<0.01，cP<0.05，vs 胆囊腺瘤组；dP<0.01，vs 高分化腺癌组.表2 胆囊癌中的凋亡细胞与Bcl-2表达的关系
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细 胞 凋 亡
0
+
++
+++
Bcl-2
+
0
11
2
0
-
0
3
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1
7
P<0.01，χ2=11.82.
图1 高分化腺癌AP(+) ISEL×40
图2 低分化腺癌AP(+) ISEL×40
图3 胆囊腺癌bcl-2(+) ABC×40
3 讨论
近年来研究表明，细胞凋亡是由基因控制的自我消亡过程，此过程的紊乱与肿瘤的发生有密切关系[1]. 肿瘤的形成不仅是细胞无限增殖所致的细胞积聚，在许多肿瘤中即有细胞的大量增殖，同时存在细胞凋亡. 但对胆囊肿瘤中细胞凋亡及其调控基因的相关性，尤其是细胞凋亡的分布和临床病理特征的关系目前国内外尚未见报道.
, 百拇医药
我们采用Gavrieli et al[2]首创的原位末端标记法(ISEL)，可特异原位显示凋亡，克服了单纯形态学观察只能定性，DNA降解片段分析仅能定量的不足. 该法能识别凋亡的早期细胞，并且双染色可了解凋亡相关基因的表达和蛋白的分布，因此ISEL为凋亡病理开辟了新的途径. 细胞(尤其是突变细胞)的基因调控失败导致细胞过度分裂、增殖或凋亡减少是肿瘤发生的原因. 本结果表明，胆囊癌中细胞凋亡率为100%，凋亡细胞数目也明显高于胆囊腺瘤，这说明在胆囊癌发生过程中，细胞凋亡可看作是机体对抗癌变的主动努力. 本结果与Hino et al[3]在肝细胞癌中的研究结果相一致. 同时我们发现分化差及有转移的胆囊癌中的凋亡细胞明显增多，这可能是由于分化差的肿瘤组织中的细胞恶性增殖快，易受缺氧、营养缺乏和其他有害因素的损伤所致[4]. 此外恶性程度高，有转移的胆囊癌中的凋亡细胞常位于肿瘤周围，则可能是肿瘤受浸润的巨噬细胞释放肿瘤坏死因子等或受到细胞毒性T细胞攻击的结果[5].
, 百拇医药
bcl-2是一种与细胞凋亡相关的基因，其编码产物Bcl-2蛋白是细胞凋亡的主要负调节因子. 本组24例胆囊癌中13例(54.2%)bcl-2反应阳性，表明bcl-2在多数胆囊癌中表达，提示bcl-2不同程度地参与大部分胆囊癌的调亡调变. bcl-2在胆囊癌中的表达同胆囊腺瘤无显著差异，但与胆囊中的细胞凋亡呈负相关，间接提示bcl-2的表达可能具有提示预后的意义. 但由于本组病例选择数量少，因此对bcl-2与细胞凋亡的相关性及作用，有待进一步研究.
陈汝福，男，1963-02-17生，山东省利津县人，汉族. 1983年潍坊医学院毕业，主治医师，同济医科大学附属同济医院普外科博士生，主要从事肝胆肿瘤的分子生物学研究，已发表论文22篇.
通讯作者 陈汝福，430030，同济医科大学附属同济医院普外科，湖北省武汉市航空路13号.
Correspondence to:CHEN Ru-Fu, Department of General Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical University, 13 Hangkonglu, Wuhan 430030, Hubei Province, China
, 百拇医药
Tel. +86·27·83691403
收稿日期 1998-04-20
4 参考文献
1 陈汝福. 细胞凋亡在肝胆肿瘤形成和治疗中的意义. 国外医学肿瘤分册，1997；24(2)：90-92
2 Gavrieli Y, Shermen Y, Ben Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992;119(4):493-501
3 Hino H, Higashi T, Nousok. Apoptosis and proliferation of human hepatocellular carcinoma. Liver, 1996;16(2):123-125
4 Fukude K, Kojiro M, Chiu JF. Demostation of extensive chromtin cleargeg in transplanted morris hepatoma 777 tissue: apoptosis or necrosis. Am J Pathol, 1993;142(3):935-937
5 Martz E, Howell DM. Virus control cell first and cytolytic cells second Immunol Today, 1989;10(1):79-81, 百拇医药
单位：同济医科大学附属同济医院普外科 湖北省武汉市 430030
关键词：胆囊肿瘤/病理学；脱噬作用；癌基因；基因表达调控
华人消化杂志980812 Apoptosis and expression of bcl-2 gene in gallbladder neoplasms
CHEN Ru-Fu, ZOU Sheng-Quan and QIAN Jia-Qin
Department of General Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030, Hubei Province, China
, 百拇医药
Subject headings gallbladder neoplasms/pathology; apoptosis; oncogenes; gene expression regulation
Abstract
AIM To investigate the effects of apoptosis and bcl-2 gene in gallbladder neoplasms.
METHODS The number of apoptosis and the bcl-2 positive expression rate were observed in 24 cases of gallbladder carcinomas and 16 gallbladder adenomas,using in situ and labeling (ISEL) method and immunohistochemical staining.
, 百拇医药
RESULTS The incidence and number of apoptosis in gallbladder adenoma was significantly lower than in gallbladder carcinoma (Nevin stage S4,S5) (5.6% vs 100%,χ2=36.115，P<0.01), and well differentiated gallbladder carcinoma had less apoptosis cells than poorly differentiated gallbladder carcinoma (Nevin stage S1-S3, χ2=19.05，P<0.01). In bcl-2 positive expression, there was no significant difference between gallbladder carcinoma and gallbladder adenoma (χ2=1.111，P>0.05). The expression of bcl-2 was related to apoptosis in gallbladder carcinoma (χ2=11.82，P<0.01).
, 百拇医药
CONCLUSION The rate of apoptosis may be a perfect prognostic index for gallbladder carcinoma, and apoptosis may play an important role in the pathogenesis of gallbladder carcinoma.
中国图书资料分类号 R 735.8
摘 要
目的 探讨细胞凋亡及其调控基因bcl-2在胆囊癌发生发展中的作用.
方法 用原位末端标记法(ISEL)和免疫组化ABC法对24例胆囊癌和16例胆囊腺瘤中的凋亡细胞及其调控基因bcl-2的表达产物进行了检测. 同时观察胆囊癌中的调亡细胞与胆囊癌病理类型、分化程度和浸润转移的关系，分析bcl-2基因对细胞凋亡的调控作用.
, http://www.100md.com
结果 胆囊癌、胆囊腺瘤中的细胞凋亡发生率分别为100%和5.6%；胆囊癌中的凋亡细胞数明显高于胆囊腺瘤(χ2=36.111，P<0.01)；低分化腺癌及Nevin分期S1～S3胆囊癌中的凋亡细胞数明显高于高分化及Nevin分期S4，S5者(χ2=19.051，P<0.01). 高分化腺癌中的凋亡细胞多呈点状分布，低分化腺癌及转移性胆囊癌中的凋亡细胞呈片状或块状分布. bcl-2基因在胆囊癌和胆囊腺瘤中的表达无显著差异(χ2=1.111，P>0.05). 在胆囊癌中，bcl-2产物阳性表达与细胞凋亡密切相关(χ2=11.82，P<0.01).
结论 细胞凋亡bcl-2基因在胆囊癌发生发展中起重要作用.
0 引言
, 百拇医药 为探讨细胞凋亡及bcl-2基因在胆囊癌形成和发展中的作用，我们应用原位末端标记法(ISEL)和免疫组化方法对40例胆囊良恶性肿瘤组织中的凋亡细胞和bcl-2基因产物进行了检测，结果报告如下.
1 材料和方法
1.1 材料 收集同济医院1989/ 1996间手术切除的胆囊癌标本24例，胆囊腺瘤标本16例，所有标本均经病理学证实. 其中高分化腺癌14例，低分化腺癌8例，未分化癌2例. Nevin分期S1，S2，S3期11例；S4，S5期13例. 全部标本均为存档资料，均经100 mL/ L福尔马林固定，石蜡包埋，每个蜡块行4 μm连续切片4张.
1.2 方法 Dig-dUTP,dNTP,Klenow酶、NTB购于德国Boehringer Mannheim生物技术公司. bcl-2单抗为Santa-Cruz生物公司产品. 细胞凋亡检测采用ISEL法，bcl-2检测采用免疫组化ABC法. ISEL的步骤为：切片常规二甲苯脱蜡及逐级水化，置2×SSC溶液中加热，蛋白酶K消化，流水冲洗终止反应，用含量Tri-Cl, MgCl,β-巯基乙醇、牛血清蛋白的缓冲液漂洗，置湿盒内加标记的d-NTP，dig-dUTP，Klenow酶，1 mL/ L H2O2的PBS阻断内源性过氧化酶，PBS冲洗后置湿盒内dig-Ab点片，加入NBT显色，脱水，封片. 用已知的肝癌凋亡细胞为阳性片为对照. bcl-2染色按免疫组化ABC法常规流程进行，DAB显色.
, http://www.100md.com
统计学处理 χ2检验，四格表确切概率法.
2 结果
细胞核内呈蓝紫色反应者为凋亡细胞. 每个标本均取5个高倍视野，计算每个视野内的凋亡细胞数目，取5个高倍视野的平均数，分为0，+(1～10),++(11～20),+++(≥21). bcl-2以胞质内呈现棕黄色颗粒为阳性.
全部胆囊癌中均可见凋亡细胞，16例胆囊腺瘤中仅1例发现有少量凋亡细胞，且位于腺瘤的表面. 高分化胆囊癌中的凋亡细胞多位于癌实质中央，呈散在点状分布(图1)；低分化及有转移的胆囊癌中的凋亡细胞多位于肿瘤的边缘，中央区多为坏死组织，凋亡细胞数量多且多呈片状或块状分布(图2). 胆囊癌中的细胞凋亡数显著高于胆囊腺瘤(χ2=36.111，P<0.01)；低分化及Nevin分期S4，S5的胆囊癌明显高于高分化及Nevin分期S1，S2，S3者(χ2=19.051，P<0.01，表1). bcl-2在胆囊腺瘤和胆囊癌中的阳性率为37.5%和54.2%. 胆囊癌中的凋亡细胞数与bcl-2的阳性表达呈负相关(表2，图3).
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表1 胆囊肿瘤中细胞凋亡及bcl-2的表达 类 型
n
凋亡细胞
Bcl-2
0
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胆囊腺瘤
16
15
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1
0
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胆囊腺癌
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高分化腺癌
14
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未分化癌
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aP<0.05，vs S1～S3组；bP<0.01，cP<0.05，vs 胆囊腺瘤组；dP<0.01，vs 高分化腺癌组.表2 胆囊癌中的凋亡细胞与Bcl-2表达的关系
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细 胞 凋 亡
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Bcl-2
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P<0.01，χ2=11.82.
图1 高分化腺癌AP(+) ISEL×40
图2 低分化腺癌AP(+) ISEL×40
图3 胆囊腺癌bcl-2(+) ABC×40
3 讨论
近年来研究表明，细胞凋亡是由基因控制的自我消亡过程，此过程的紊乱与肿瘤的发生有密切关系[1]. 肿瘤的形成不仅是细胞无限增殖所致的细胞积聚，在许多肿瘤中即有细胞的大量增殖，同时存在细胞凋亡. 但对胆囊肿瘤中细胞凋亡及其调控基因的相关性，尤其是细胞凋亡的分布和临床病理特征的关系目前国内外尚未见报道.
, 百拇医药
我们采用Gavrieli et al[2]首创的原位末端标记法(ISEL)，可特异原位显示凋亡，克服了单纯形态学观察只能定性，DNA降解片段分析仅能定量的不足. 该法能识别凋亡的早期细胞，并且双染色可了解凋亡相关基因的表达和蛋白的分布，因此ISEL为凋亡病理开辟了新的途径. 细胞(尤其是突变细胞)的基因调控失败导致细胞过度分裂、增殖或凋亡减少是肿瘤发生的原因. 本结果表明，胆囊癌中细胞凋亡率为100%，凋亡细胞数目也明显高于胆囊腺瘤，这说明在胆囊癌发生过程中，细胞凋亡可看作是机体对抗癌变的主动努力. 本结果与Hino et al[3]在肝细胞癌中的研究结果相一致. 同时我们发现分化差及有转移的胆囊癌中的凋亡细胞明显增多，这可能是由于分化差的肿瘤组织中的细胞恶性增殖快，易受缺氧、营养缺乏和其他有害因素的损伤所致[4]. 此外恶性程度高，有转移的胆囊癌中的凋亡细胞常位于肿瘤周围，则可能是肿瘤受浸润的巨噬细胞释放肿瘤坏死因子等或受到细胞毒性T细胞攻击的结果[5].
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bcl-2是一种与细胞凋亡相关的基因，其编码产物Bcl-2蛋白是细胞凋亡的主要负调节因子. 本组24例胆囊癌中13例(54.2%)bcl-2反应阳性，表明bcl-2在多数胆囊癌中表达，提示bcl-2不同程度地参与大部分胆囊癌的调亡调变. bcl-2在胆囊癌中的表达同胆囊腺瘤无显著差异，但与胆囊中的细胞凋亡呈负相关，间接提示bcl-2的表达可能具有提示预后的意义. 但由于本组病例选择数量少，因此对bcl-2与细胞凋亡的相关性及作用，有待进一步研究.
陈汝福，男，1963-02-17生，山东省利津县人，汉族. 1983年潍坊医学院毕业，主治医师，同济医科大学附属同济医院普外科博士生，主要从事肝胆肿瘤的分子生物学研究，已发表论文22篇.
通讯作者 陈汝福，430030，同济医科大学附属同济医院普外科，湖北省武汉市航空路13号.
Correspondence to:CHEN Ru-Fu, Department of General Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical University, 13 Hangkonglu, Wuhan 430030, Hubei Province, China
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Tel. +86·27·83691403
收稿日期 1998-04-20
4 参考文献
1 陈汝福. 细胞凋亡在肝胆肿瘤形成和治疗中的意义. 国外医学肿瘤分册，1997；24(2)：90-92
2 Gavrieli Y, Shermen Y, Ben Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992;119(4):493-501
3 Hino H, Higashi T, Nousok. Apoptosis and proliferation of human hepatocellular carcinoma. Liver, 1996;16(2):123-125
4 Fukude K, Kojiro M, Chiu JF. Demostation of extensive chromtin cleargeg in transplanted morris hepatoma 777 tissue: apoptosis or necrosis. Am J Pathol, 1993;142(3):935-937
5 Martz E, Howell DM. Virus control cell first and cytolytic cells second Immunol Today, 1989;10(1):79-81, 百拇医药