肝损伤过程中eNOS和IL-10的基因表达对肝再生调控机制的探讨
作者：汪谦 黄洁夫
单位：510080 广州，中山医科大学附属第一医院肝胆外科
关键词：肝再生；白细胞介素10；基因表达；内皮型一氧化氮合酶
中华外科杂志980903 【摘要】 目的 探讨内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和白细胞介素10(IL-10)在肝再生信息传导中的作用。 方法 切除70%肝脏，制备肝再生模型，注射50%CCl4和脾切除引起肝损伤和机体免疫功能低下，48小时后采用逆转录PCR和点杂交方法检测eNOS和IL-10 mRNA基因表达，免疫组化LSAB法检测IL-10蛋白在肝内的分布，流式细胞仪(FCM)检测再生肝DNA含量，采用统计学方法进行再生肝组织DNA含量与IL-10和eNOS变化的相关分析，以此判断IL-10和eNOS的变化对肝再生的影响。 结果 eNOS的表达同肝细胞的再生呈正相关，而IL-10的表达与其呈负相关。 结论 eNOS和IL-10对肝再生具有明显的调控作用，无论在生理或在病理状态下都是如此，并且二者呈现一种完全相反的调控方式，同时受到脾脏或全身免疫系统的影响。
, 百拇医药
Expression of eNOS and IL-10 gene in signal transduction for liver regeneration Wang Qian, Huang Jiefu.Department of Hepatobiliary Surgery,First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080.
【Abstract】 Objective To detect the effects of eNOS and IL-10 on liver regeneration under physiological and pathological condition. Method The rat model of liver regeneration was made by partial(70%) hepatectomy. Some rats were injected with CCl4 and performed splenectomy.Hepatocytes DNA replication was tested by flow cytometry method (FCM) and the gene expression of eNOS in liver cells were analysed using RT-PCR.The IL-10 gene expression in liver cells was shown by Dot Blot hybridization method.The synthesis and distribution of IL-10 protein in liver tissue were examined by immune histochemical and morphometric method. Result The expression of eNOS gene promoted liver regeneration while the expression of IL-10 gene inhibited it. Conclusion eNOS and IL-10 play an important immunomodulatory role in liver regeneration under physiological or pathological conditions. The effects of eNOS and IL-10 on liver regeneration differ and they show an opposite modulatory effects on liver regeneration. Such effects are affected by spleen and general immune system.
, 百拇医药
【Key words】 Liver regeneration Interleukin-10 Gene expression eNOS
肝细胞的再生是一个复杂的过程，并受到多种因素的影响。生理状态下肝细胞的再生弥补凋亡的缺少或丢失[1]，病理状况下则是为了恢复与维持肝脏的生理功能。已知在肝细胞再生信息传导途径中，细胞因子发挥着极重要的作用，而eNOS和IL-10是生物活性较高的细胞因子，参与机体多系统的调控，但是对肝再生的作用如何，尚未见报道。本实验探讨二者在肝再生信息传导中的作用，以便为促进肝再生摸索出一些有效的方法。
材料与方法
1.实验动物及分组: 二级SD大鼠，体重200～250 g，按常规条件饲养。实验分对照组、CCl4组、切脾组和切脾并CCl4组，每组8只。所有动物切除肝脏70%制备肝再生模型，切脾组同时切除脾脏，CCl4组手术完毕后1次性腹腔注射大剂量50% CCl4油剂(0.5 ml/100 g)，48小时后手术切取肝组织1块液氮保存(提取DNA)或福尔马林固定(免疫组化)，其余肝脏以原位胶原酶灌注分离肝细胞行流式细胞仪检测DNA。
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2.逆转录PCR(RT-PCR)检测eNOS的基因表达: 以5 M异硫氰酸胍按Promage法提取肝组织总RNA，根据North提供的eNOS cDNA序列由中科院上海细胞所合成引物。按RT-PCR法用200 IU逆转录酶MMLV合成eNOS cDNA片段(191 bp)，再以1.5 M的Tag DNA多聚酶在PCR扩增仪上行cDNA扩增，琼脂糖凝胶电泳，透射式紫外灯下观察拍照，并行条带薄层扫描仪定量。
3.点杂交检测IL-10 mRNA基因表达:本校免疫室提供含hIL-10探针的重组质粒PUC18，双酶切获hIL-10 cDNA片段(157 bp)、电泳回收、消化提纯、随机引物地高辛(DIG)标记探针，点杂交吸印仪(GIBCO)将提取的肝脏总RNA转至硝酸纤维膜，经予杂交4小时、杂交16小时，SSC和SDS洗膜，用1∶5000的DIG抗体采用免疫学方法检测hIL-10 mRNA的基因表达[2]。
4.免疫组化技术链霉素标记的生物素方法(LSAB法)检测IL-10蛋白在肝内的分布: 由各实验组取肝组织标本6例，石腊切片采用LSAB法，利用Genzyme公司生产的抗IL-10抗体(1∶100)和DAKO公司的LSAB试剂盒，经一抗、二抗和LSAB初染，DAB显色，甲基氯复染。高倍镜下计数200个细胞，计算出阳性细胞百分率。标本同时行HE染色观察细胞形态。
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5.流式细胞仪(FCM)检测再生肝DNA含量: 以胶原酶体内原位灌注并体外器皿内消化分离制备肝细胞悬液，约5×106个/50 μl，经DNA染色剂碘化丙啶(PI，5 mg/ml)避光染色30分钟后，应用Coulter公司生产的Elite型流式细胞仪，测定计数10000个细胞，测出的数据经软件处理，得出细胞各周期的DNA相对含量和百分数，分析比较各组间的差异以及这种差异与IL-10和eNOS变化的相互分析。
结果
1.eNOS mRNA在不同实验组肝细胞内的表达：用扩增eNOS cDNA 的特异引物在多个实验组的肝组织内分别检测出与设计相符的基因片段，大小约191 bp，采用薄层扫描技术显示各组RT-PCR产物的相对含量OD值。结果显示，与单纯的对照组相比，CCl4组中eNOS mRNA含量显著减少(P<0.01)，在切脾组内含量也有所减少，但幅度较低(P<0.05)。切脾+CCl4组的含量与CCl4组相比，其差异无显著意义(P>0.05)。
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2.各实验组动物肝组织内IL-10 mRNA基因的表达：以IL-10 cDNA探针行点杂交显示，单纯切除70%肝脏组可见有IL-10的基因表达，如同时切除脾脏使IL-10基因表达增强(P<0.05)；CCl4组表达量最高(P<0.01),而CCl4+切脾组表达量相对略低,将杂交带以薄层扫描后所得数据组间相比较,结果更显著。
3.免疫组化检测肝组织内IL-10的分布：以抗-IL-10抗体采用LSAB免疫组化法染色后，发现并非所有肝细胞均含有IL-10颗粒，阳性染色的肝细胞在组织内散在分布，密度不同。通过形态测量学统计阳性染色细胞，各组间差异有显著意义(P<0.05)，其中CCl4组阳性细胞数最多，切脾+CCl4组、对照组和切脾组数量渐少。
4.FCM检测的再生肝DNA相对含量改变以及同eNOS和IL-10改变的相关分析：以FCM检测各实验组肝组织分离肝细胞的DNA相对含量(通道值)，发现对照组的肝细胞处于S期的为多，其DNA含量最高；CCl4组肝细胞的DNA复制显著降低；于对照组相比，切除脾脏后使DNA复制减少，这在CCl4组肝损伤后的表现更为明显。相关分析表明DNA含量与免疫组化染色的IL-10阳性细胞数变化呈显著正相关(r＝0.54，P<0.01)。同法发现DNA的含量与eNOS之间的变化呈负相关(r＝-0.62，P<0.01)。
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讨论
肝再生分子水平上的调控机制按细胞膜受体不同可分为两种，一种是跨膜糖蛋白受体。另一种是苏氨酸蛋白激酶受体。细胞因子诱导的肝再生主要通过糖蛋白受体结合途径，激活胞浆内非受体型的苏氨酸蛋白激酶，将信息传导到细胞核，引起DNA的复制；而丝裂原诱导的肝再生则是通过促进G蛋白同苏氨酸蛋白激酶受体的结合引起肝细胞DNA的复制。肝脏具有强大的再生能力，但在病理状态下如严重的肝硬变，肝脏的再生能力大大受损，探讨其受损的机制对临床治疗具有重要的指导意义。
eNOS和IL-10是机体内多种细胞分泌的物质，自从1981年和1989年二者分别被发现认定以来，相关的研究内容较多[3]。两种因子有许多相似的地方，其一，都积极参与机体内的信息传递和免疫调控；其二，在许多病理反应中都表现有分泌量和功能的改变。由于肝再生是机体的一种自我保护措施，推测肝损伤后的肝再生受抑制，可能与eNOS和IL-10有一定关系。本实验结果所示，CCl4引起肝损伤导致肝细胞的再生能力降低，DNA复制减少，伴随的是eNOS基因表达水平也同时降低，根据eNOS的生物学特性分析，在损伤过程中eNOS通过减少基因表达抑制了肝细胞的DNA复制；与此相类似的是切除脾脏致机体免疫力降低后可引起同样的结果。但切脾引起的DNA合成减少与eNOS表达降低的程度却相对较低，说明生理状态下脾脏可通过促进eNOS表达对肝脏的再生发挥作用。在病理状态下脾脏并不表现对eNOS有促进作用，CCl4损伤的同时切除脾脏，虽然DNA合成大为减少，但eNOS表达没有明显降低，分析可能与免疫系统的网状调控机制有关。
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IL-10对肝再生的作用与eNOS不同，分子杂交结果提示“正常”情况下，即单纯切肝70%后肝细胞DNA大量合成的同时有IL-10的表达，切除脾脏后肝内IL-10表达量减少，说明脾脏内存在某种与IL-10相类似的因子，而IL-10对肝再生呈一种反馈式的调控机制。CCl4引起肝损伤后，可见DNA合成减少的同时伴IL-10的大量表达。切除脾脏后给予CCl4，IL-10的表达略低，说明在病理反应过程中脾脏同样对IL-10有协同作用。免疫组化染色的结果提示并非所有肝细胞在同一时间内都有IL-10基因的表达，并且这些表达IL-10基因的细胞在肝内的散在分布有一定规律，与肝细胞DNA的合成有一定相关性。这种分布规律可能与肝内的血流途径有关，说明IL-10对肝再生的调控伴有血循环某些因子的参与[4]。
上述实验结果表明，eNOS和IL-10对肝再生具有明显的调控作用，无论在生理或在病理状态下都是如此，并且二者呈现一种完全相反的调控方式，同时受到脾脏或全身免疫系统的影响。多数情况下，eNOS的表达同肝细胞的再生呈正相关关系，而IL-10的表达与其呈负相关关系，如果进一步的研究能够认识到二者的调控在何种情况下对肝再生有益，实验可以采用转基因技术，应用高效表达载体，通过顺向或逆向转录手段，将eNOS和IL-10用于临床肝再生的治疗。
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参考文献
1Bulera SJ, Sattler CA, Pitot HC, et al. The translation inhibitor cycloheximide represses growth factor depletion-induced apoptosis in an alb-SV407 transgene rat liver cell line. Hepatology,1996,23:1591-1601.
2汪谦，主编. 现代医学实验方法. 第1版. 北京:人民卫生出版社,1997.660-674.
3Roach TI,Barton CH, Chatterjee D, et al. Opposing effects of interferon-γ on ions and interleukin-10 expression in lipopolysaccharide and myco-bacterial lipoarabinomannan-stimulated macrophages. Immunology, 1997,85:106-113.
4Rodeberg DA,Chaet MS,Bass RC,et al. Nitric oxide:an overview. Am J Surg,1995,170:292-303.
(收稿：1997-09-03 修回：1998-07-09), 百拇医药
单位：510080 广州，中山医科大学附属第一医院肝胆外科
关键词：肝再生；白细胞介素10；基因表达；内皮型一氧化氮合酶
中华外科杂志980903 【摘要】 目的 探讨内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和白细胞介素10(IL-10)在肝再生信息传导中的作用。 方法 切除70%肝脏，制备肝再生模型，注射50%CCl4和脾切除引起肝损伤和机体免疫功能低下，48小时后采用逆转录PCR和点杂交方法检测eNOS和IL-10 mRNA基因表达，免疫组化LSAB法检测IL-10蛋白在肝内的分布，流式细胞仪(FCM)检测再生肝DNA含量，采用统计学方法进行再生肝组织DNA含量与IL-10和eNOS变化的相关分析，以此判断IL-10和eNOS的变化对肝再生的影响。 结果 eNOS的表达同肝细胞的再生呈正相关，而IL-10的表达与其呈负相关。 结论 eNOS和IL-10对肝再生具有明显的调控作用，无论在生理或在病理状态下都是如此，并且二者呈现一种完全相反的调控方式，同时受到脾脏或全身免疫系统的影响。
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Expression of eNOS and IL-10 gene in signal transduction for liver regeneration Wang Qian, Huang Jiefu.Department of Hepatobiliary Surgery,First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080.
【Abstract】 Objective To detect the effects of eNOS and IL-10 on liver regeneration under physiological and pathological condition. Method The rat model of liver regeneration was made by partial(70%) hepatectomy. Some rats were injected with CCl4 and performed splenectomy.Hepatocytes DNA replication was tested by flow cytometry method (FCM) and the gene expression of eNOS in liver cells were analysed using RT-PCR.The IL-10 gene expression in liver cells was shown by Dot Blot hybridization method.The synthesis and distribution of IL-10 protein in liver tissue were examined by immune histochemical and morphometric method. Result The expression of eNOS gene promoted liver regeneration while the expression of IL-10 gene inhibited it. Conclusion eNOS and IL-10 play an important immunomodulatory role in liver regeneration under physiological or pathological conditions. The effects of eNOS and IL-10 on liver regeneration differ and they show an opposite modulatory effects on liver regeneration. Such effects are affected by spleen and general immune system.
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【Key words】 Liver regeneration Interleukin-10 Gene expression eNOS
肝细胞的再生是一个复杂的过程，并受到多种因素的影响。生理状态下肝细胞的再生弥补凋亡的缺少或丢失[1]，病理状况下则是为了恢复与维持肝脏的生理功能。已知在肝细胞再生信息传导途径中，细胞因子发挥着极重要的作用，而eNOS和IL-10是生物活性较高的细胞因子，参与机体多系统的调控，但是对肝再生的作用如何，尚未见报道。本实验探讨二者在肝再生信息传导中的作用，以便为促进肝再生摸索出一些有效的方法。
材料与方法
1.实验动物及分组: 二级SD大鼠，体重200～250 g，按常规条件饲养。实验分对照组、CCl4组、切脾组和切脾并CCl4组，每组8只。所有动物切除肝脏70%制备肝再生模型，切脾组同时切除脾脏，CCl4组手术完毕后1次性腹腔注射大剂量50% CCl4油剂(0.5 ml/100 g)，48小时后手术切取肝组织1块液氮保存(提取DNA)或福尔马林固定(免疫组化)，其余肝脏以原位胶原酶灌注分离肝细胞行流式细胞仪检测DNA。
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2.逆转录PCR(RT-PCR)检测eNOS的基因表达: 以5 M异硫氰酸胍按Promage法提取肝组织总RNA，根据North提供的eNOS cDNA序列由中科院上海细胞所合成引物。按RT-PCR法用200 IU逆转录酶MMLV合成eNOS cDNA片段(191 bp)，再以1.5 M的Tag DNA多聚酶在PCR扩增仪上行cDNA扩增，琼脂糖凝胶电泳，透射式紫外灯下观察拍照，并行条带薄层扫描仪定量。
3.点杂交检测IL-10 mRNA基因表达:本校免疫室提供含hIL-10探针的重组质粒PUC18，双酶切获hIL-10 cDNA片段(157 bp)、电泳回收、消化提纯、随机引物地高辛(DIG)标记探针，点杂交吸印仪(GIBCO)将提取的肝脏总RNA转至硝酸纤维膜，经予杂交4小时、杂交16小时，SSC和SDS洗膜，用1∶5000的DIG抗体采用免疫学方法检测hIL-10 mRNA的基因表达[2]。
4.免疫组化技术链霉素标记的生物素方法(LSAB法)检测IL-10蛋白在肝内的分布: 由各实验组取肝组织标本6例，石腊切片采用LSAB法，利用Genzyme公司生产的抗IL-10抗体(1∶100)和DAKO公司的LSAB试剂盒，经一抗、二抗和LSAB初染，DAB显色，甲基氯复染。高倍镜下计数200个细胞，计算出阳性细胞百分率。标本同时行HE染色观察细胞形态。
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5.流式细胞仪(FCM)检测再生肝DNA含量: 以胶原酶体内原位灌注并体外器皿内消化分离制备肝细胞悬液，约5×106个/50 μl，经DNA染色剂碘化丙啶(PI，5 mg/ml)避光染色30分钟后，应用Coulter公司生产的Elite型流式细胞仪，测定计数10000个细胞，测出的数据经软件处理，得出细胞各周期的DNA相对含量和百分数，分析比较各组间的差异以及这种差异与IL-10和eNOS变化的相互分析。
结果
1.eNOS mRNA在不同实验组肝细胞内的表达：用扩增eNOS cDNA 的特异引物在多个实验组的肝组织内分别检测出与设计相符的基因片段，大小约191 bp，采用薄层扫描技术显示各组RT-PCR产物的相对含量OD值。结果显示，与单纯的对照组相比，CCl4组中eNOS mRNA含量显著减少(P<0.01)，在切脾组内含量也有所减少，但幅度较低(P<0.05)。切脾+CCl4组的含量与CCl4组相比，其差异无显著意义(P>0.05)。
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2.各实验组动物肝组织内IL-10 mRNA基因的表达：以IL-10 cDNA探针行点杂交显示，单纯切除70%肝脏组可见有IL-10的基因表达，如同时切除脾脏使IL-10基因表达增强(P<0.05)；CCl4组表达量最高(P<0.01),而CCl4+切脾组表达量相对略低,将杂交带以薄层扫描后所得数据组间相比较,结果更显著。
3.免疫组化检测肝组织内IL-10的分布：以抗-IL-10抗体采用LSAB免疫组化法染色后，发现并非所有肝细胞均含有IL-10颗粒，阳性染色的肝细胞在组织内散在分布，密度不同。通过形态测量学统计阳性染色细胞，各组间差异有显著意义(P<0.05)，其中CCl4组阳性细胞数最多，切脾+CCl4组、对照组和切脾组数量渐少。
4.FCM检测的再生肝DNA相对含量改变以及同eNOS和IL-10改变的相关分析：以FCM检测各实验组肝组织分离肝细胞的DNA相对含量(通道值)，发现对照组的肝细胞处于S期的为多，其DNA含量最高；CCl4组肝细胞的DNA复制显著降低；于对照组相比，切除脾脏后使DNA复制减少，这在CCl4组肝损伤后的表现更为明显。相关分析表明DNA含量与免疫组化染色的IL-10阳性细胞数变化呈显著正相关(r＝0.54，P<0.01)。同法发现DNA的含量与eNOS之间的变化呈负相关(r＝-0.62，P<0.01)。
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讨论
肝再生分子水平上的调控机制按细胞膜受体不同可分为两种，一种是跨膜糖蛋白受体。另一种是苏氨酸蛋白激酶受体。细胞因子诱导的肝再生主要通过糖蛋白受体结合途径，激活胞浆内非受体型的苏氨酸蛋白激酶，将信息传导到细胞核，引起DNA的复制；而丝裂原诱导的肝再生则是通过促进G蛋白同苏氨酸蛋白激酶受体的结合引起肝细胞DNA的复制。肝脏具有强大的再生能力，但在病理状态下如严重的肝硬变，肝脏的再生能力大大受损，探讨其受损的机制对临床治疗具有重要的指导意义。
eNOS和IL-10是机体内多种细胞分泌的物质，自从1981年和1989年二者分别被发现认定以来，相关的研究内容较多[3]。两种因子有许多相似的地方，其一，都积极参与机体内的信息传递和免疫调控；其二，在许多病理反应中都表现有分泌量和功能的改变。由于肝再生是机体的一种自我保护措施，推测肝损伤后的肝再生受抑制，可能与eNOS和IL-10有一定关系。本实验结果所示，CCl4引起肝损伤导致肝细胞的再生能力降低，DNA复制减少，伴随的是eNOS基因表达水平也同时降低，根据eNOS的生物学特性分析，在损伤过程中eNOS通过减少基因表达抑制了肝细胞的DNA复制；与此相类似的是切除脾脏致机体免疫力降低后可引起同样的结果。但切脾引起的DNA合成减少与eNOS表达降低的程度却相对较低，说明生理状态下脾脏可通过促进eNOS表达对肝脏的再生发挥作用。在病理状态下脾脏并不表现对eNOS有促进作用，CCl4损伤的同时切除脾脏，虽然DNA合成大为减少，但eNOS表达没有明显降低，分析可能与免疫系统的网状调控机制有关。
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IL-10对肝再生的作用与eNOS不同，分子杂交结果提示“正常”情况下，即单纯切肝70%后肝细胞DNA大量合成的同时有IL-10的表达，切除脾脏后肝内IL-10表达量减少，说明脾脏内存在某种与IL-10相类似的因子，而IL-10对肝再生呈一种反馈式的调控机制。CCl4引起肝损伤后，可见DNA合成减少的同时伴IL-10的大量表达。切除脾脏后给予CCl4，IL-10的表达略低，说明在病理反应过程中脾脏同样对IL-10有协同作用。免疫组化染色的结果提示并非所有肝细胞在同一时间内都有IL-10基因的表达，并且这些表达IL-10基因的细胞在肝内的散在分布有一定规律，与肝细胞DNA的合成有一定相关性。这种分布规律可能与肝内的血流途径有关，说明IL-10对肝再生的调控伴有血循环某些因子的参与[4]。
上述实验结果表明，eNOS和IL-10对肝再生具有明显的调控作用，无论在生理或在病理状态下都是如此，并且二者呈现一种完全相反的调控方式，同时受到脾脏或全身免疫系统的影响。多数情况下，eNOS的表达同肝细胞的再生呈正相关关系，而IL-10的表达与其呈负相关关系，如果进一步的研究能够认识到二者的调控在何种情况下对肝再生有益，实验可以采用转基因技术，应用高效表达载体，通过顺向或逆向转录手段，将eNOS和IL-10用于临床肝再生的治疗。
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参考文献
1Bulera SJ, Sattler CA, Pitot HC, et al. The translation inhibitor cycloheximide represses growth factor depletion-induced apoptosis in an alb-SV407 transgene rat liver cell line. Hepatology,1996,23:1591-1601.
2汪谦，主编. 现代医学实验方法. 第1版. 北京:人民卫生出版社,1997.660-674.
3Roach TI,Barton CH, Chatterjee D, et al. Opposing effects of interferon-γ on ions and interleukin-10 expression in lipopolysaccharide and myco-bacterial lipoarabinomannan-stimulated macrophages. Immunology, 1997,85:106-113.
4Rodeberg DA,Chaet MS,Bass RC,et al. Nitric oxide:an overview. Am J Surg,1995,170:292-303.
(收稿：1997-09-03 修回：1998-07-09), 百拇医药