辅助性肝移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的实验研究
作者：吕毅 潘承恩 刘学民 孟令忠 秦兆寅 张梅
单位：710061 西安医科大学第一临床医学院肝胆外科(吕毅、潘承恩、刘学民、孟令忠、张梅)；西安医科大学第二临床医学院腹部外科(秦兆寅)
关键词：肝功能衰竭；肝移植；肝再生
中华外科杂志980902 基质溶解素(stromelysin)是金属蛋白酶具有代表性的主要成员之一，在多种肿瘤中已经证明恶性肿瘤细胞通过金属蛋白酶降解细胞外基质以突破组织屏障而发生转移，为探讨其在肝脏肿瘤转移中所起的作用，我们应用原位分子杂交技术分别检测了原发性肝癌、继发性肝癌和肝癌肝外转移淋巴结组织中基质溶解素mRNA的表达。
1.资料和方法：手术切除肝脏肿瘤和瘤旁肝组织标本17例。男14例，女3例。年龄33～69岁，平均47.6岁。伴肝硬变者13例，不伴肝硬变者4例。未出现肝外转移的原发性肝细胞癌12例，取癌组织和癌旁肝组织进行检测。肝细胞癌肝外转移至肝门或大网膜淋巴结2例，取淋巴结组织进行检测。继发性肝癌3例(分别为结肠癌、直肠癌和胰腺癌肝转移)，均为原发肿瘤切除之后出现的转移灶。取新鲜组织常规制备冰冻切片。
, 百拇医药
基质溶解素cDNA探针长度1.6 Kb，EcoRⅠ酶切回收。应用地高辛随机引物法标记探针，杂交方法和步骤依据地高辛试剂盒操作流程进行。探针浓度约为390 ng/ml，42℃杂交过夜。终止反应后梯度乙醇脱水。镜下观察细胞出现蓝色反应颗粒为阳性。
2.结果：12例肝细胞癌组织中，7例基质溶解素mRNA表达阳性。2例肝癌肝外转移淋巴结组织和3例继发性肝癌均为阳性，正常肝组织和癌旁肝组织均阴性。病理分级Ⅰ～Ⅱ级肝细胞癌3例，均阴性；Ⅲ～Ⅳ级肝细胞癌9例，阳性7例。镜下观察阳性细胞呈散在的片状或灶状分布，显色和分布不均匀。阳性细胞多位于癌巢边缘部分或管道近旁。2例肝癌肝外转移淋巴结组织中癌细胞深度显色，聚集成片状。3例继发性肝癌也表达出较高水平的基质溶解素mRNA，阳性细胞区域显色深且较多，表达水平均高于未出现肝外转移的肝癌组织。
3.讨论：本实验结果发现，相当部分癌组织中并不表达基质溶解素，而表达基质溶解素的癌细胞则呈散在的片灶状分布，且多位于癌巢边缘或管道近旁，提示具有转移潜能的瘤细胞多位于肿瘤结节的表面和周边，因而肿瘤细胞也易于向周边侵袭并转移。有文献报道金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制物参与了肿瘤内血管的新生以及组织的改建和破坏，也显示了血管旁基质溶解素阳性细胞的增多。本组中病理分级Ⅲ～Ⅳ级肝癌组织的mRNA表达水平要高于Ⅰ～Ⅱ级的肝癌组织，表明随着疾病的进展获得转移潜能肿瘤细胞的增多。
, 百拇医药
肝癌具有早期经门静脉系统发生肿瘤扩散的特点，患者往往尚未出现肝外转移即出现全身衰竭。肝癌肝外淋巴结转移说明其组织类型具有高转移性，其基质溶解素的高表达，提示基质溶解素参与了肝癌转移的过程。本组3例继发性肝癌均表达了较高水平的基质溶解素，也表明了金属蛋白酶在肿瘤转移中的重要性。 存活时间
天数
存活
数(只)
死亡
数(只)
存活率
(%)
主要死因
1
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25
3
89.28
肝衰、出血
2
20
5
71.43
PV血栓、肝衰、肝上IVC破裂出血
4
16
4
57.14
, http://www.100md.com
胆漏、处死
7
10
6
35.71
胆漏、肝衰、处死
14
7
3
25.00
胆漏、腹腔及切口感染、处死
30
4
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3
14.29
处死、心脏抽血致死
60
2
2
7.14
处死
90
2
0
7.14
200
, 百拇医药 2
0
7.14
基质溶解素(stromelysin)是金属蛋白酶具有代表性的主要成员之一，在多种肿瘤中已经证明恶性肿瘤细胞通过金属蛋白酶降解细胞外基质以突破组织屏障而发生转移，为探讨其在肝脏肿瘤转移中所起的作用，我们应用原位分子杂交技术分别检测了原发性肝癌、继发性肝癌和肝癌肝外转移淋巴结组织中基质溶解素mRNA的表达。
1.资料和方法：手术切除肝脏肿瘤和瘤旁肝组织标本17例。男14例，女3例。年龄33～69岁，平均47.6岁。伴肝硬变者13例，不伴肝硬变者4例。未出现肝外转移的原发性肝细胞癌12例，取癌组织和癌旁肝组织进行检测。肝细胞癌肝外转移至肝门或大网膜淋巴结2例，取淋巴结组织进行检测。继发性肝癌3例(分别为结肠癌、直肠癌和胰腺癌肝转移)，均为原发肿瘤切除之后出现的转移灶。取新鲜组织常规制备冰冻切片。
, 百拇医药
基质溶解素cDNA探针长度1.6 Kb，EcoRⅠ酶切回收。应用地高辛随机引物法标记探针，杂交方法和步骤依据地高辛试剂盒操作流程进行。探针浓度约为390 ng/ml，42℃杂交过夜。终止反应后梯度乙醇脱水。镜下观察细胞出现蓝色反应颗粒为阳性。
2.结果：12例肝细胞癌组织中，7例基质溶解素mRNA表达阳性。2例肝癌肝外转移淋巴结组织和3例继发性肝癌均为阳性，正常肝组织和癌旁肝组织均阴性。病理分级Ⅰ～Ⅱ级肝细胞癌3例，均阴性；Ⅲ～Ⅳ级肝细胞癌9例，阳性7例。镜下观察阳性细胞呈散在的片状或灶状分布，显色和分布不均匀。阳性细胞多位于癌巢边缘部分或管道近旁。2例肝癌肝外转移淋巴结组织中癌细胞深度显色，聚集成片状。3例继发性肝癌也表达出较高水平的基质溶解素mRNA，阳性细胞区域显色深且较多，表达水平均高于未出现肝外转移的肝癌组织。
3.讨论：本实验结果发现，相当部分癌组织中并不表达基质溶解素，而表达基质溶解素的癌细胞则呈散在的片灶状分布，且多位于癌巢边缘或管道近旁，提示具有转移潜能的瘤细胞多位于肿瘤结节的表面和周边，因而肿瘤细胞也易于向周边侵袭并转移。有文献报道金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制物参与了肿瘤内血管的新生以及组织的改建和破坏，也显示了血管旁基质溶解素阳性细胞的增多。本组中病理分级Ⅲ～Ⅳ级肝癌组织的mRNA表达水平要高于Ⅰ～Ⅱ级的肝癌组织，表明随着疾病的进展获得转移潜能肿瘤细胞的增多。
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肝癌具有早期经门静脉系统发生肿瘤扩散的特点，患者往往尚未出现肝外转移即出现全身衰竭。肝癌肝外淋巴结转移说明其组织类型具有高转移性，其基质溶解素的高表达，提示基质溶解素参与了肝癌转移的过程。本组3例继发性肝癌均表达了较高水平的基质溶解素，也表明了金属蛋白酶在肿瘤转移中的重要性。 项 目
正常大鼠(n=10)
FHF大鼠(n=8)
APHLT后1周(n=8)
APHLT后2周内(n=6)
ALT(U/L)
35.38±25.20
661.50±48.94*
, 百拇医药
209.38±49.40*
72.00±58.10
AST(U/L)
159.00±43.00
1609.30±468.9*
907.50±85.40*
119.00±47.95
ALP
62.88±36.60
534.30±163.7*
, 百拇医药
278.88±103.3*
94.33±29.00
Tbili(μmol/L)
7.69±8.06
30.86±12.59*
9.03±3.81*
6.86±3.76
BG(mmol/L)
5.57±0.68
2.88±0.75*
, 百拇医药
4.88±0.95
5.61±0.63
PT(sec)
14.68±2.89
21.93±3.99*
14.83±2.38
14.50±2.60
*与正常大鼠相比P<0.01; ALT:丙氨酸氨基转移酶； AST：天门冬氨酸氨基转移酶； ALP：碱性磷酸酶； Tbili:血浆总胆红素； BG：血糖； PT：凝血酶原时间
4.辅助肝代谢支持作用：APHLT手术即时为FHF大鼠提供了有效的肝功支持，明显改善了FHF的生存率及生存时间。手术后近期死亡者除定期检查处死外，多死于手术后并发症。肝功能化验结果显示：反映肝功能损害的所有指标在FHF组显著异常。尤其是PT显著延长和血糖明显下降。APHLT术后1周肝功能损害仅表现在酶的异常和胆红素升高，术后2周，肝功指标均恢复正常。利用99mTc-HIDA行SPECT肝功评价结果表明，APHLT术后，辅助肝能有效摄取、排泄99mTc-HIDA。
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5.残肝再生与辅助肝萎缩：正常大鼠可耐受80%肝叶切除而存活，术后5～7天残肝再生可达原肝重量。本研究中残肝历经缺血，且有门静脉血分流，形态及功能恢复缓慢。研究结果表明：APHLT术后14天左右残肝已明显增生，并开始发挥物质代谢功能，辅助肝明显萎缩，呈现功能支持劣势。此后，受体在极大程度上依赖自身原肝再生部分的功能而存活，术后30天辅助肝完全纤维化，不必切除辅助肝，动物仍能长期存活。
参考文献
1Bondjema K,Jaeck D,Simeoni U,et al.Temporary auxiliary liver transplantation for subacute liver failure in child.Lancet,1993,342:778-779.
2吕毅,潘承恩,孟令忠,等.SD大鼠肝脏及附属管道的应用解剖.西安医科大学学报,1998,19:70-73.
, 百拇医药
3黄洁夫,何晓顺,褶文海,等.辅助性部分肝脏移植治疗肝功能衰竭的实验研究.中华外科杂志,1994,32:371-374.
4Ricordi C,Flye MW,Lacy PE.Renal subcapsular transplantation of clusters of hepatocytes in conjunction with pancreatic islets.Transplantation,1988,45:1148-1151.
5Yu W,Wan X,Wright JR,et al.Heterotopic liver transplantation in rats:effect of intrahepatic islet isografts and split portal blood flow on liver integrity after auxiliary liveriso transplantation.Surgery,1994,115:108-117.
(收稿：1997-10-02 修回：1998-06-20), http://www.100md.com
单位：710061 西安医科大学第一临床医学院肝胆外科(吕毅、潘承恩、刘学民、孟令忠、张梅)；西安医科大学第二临床医学院腹部外科(秦兆寅)
关键词：肝功能衰竭；肝移植；肝再生
中华外科杂志980902 基质溶解素(stromelysin)是金属蛋白酶具有代表性的主要成员之一，在多种肿瘤中已经证明恶性肿瘤细胞通过金属蛋白酶降解细胞外基质以突破组织屏障而发生转移，为探讨其在肝脏肿瘤转移中所起的作用，我们应用原位分子杂交技术分别检测了原发性肝癌、继发性肝癌和肝癌肝外转移淋巴结组织中基质溶解素mRNA的表达。
1.资料和方法：手术切除肝脏肿瘤和瘤旁肝组织标本17例。男14例，女3例。年龄33～69岁，平均47.6岁。伴肝硬变者13例，不伴肝硬变者4例。未出现肝外转移的原发性肝细胞癌12例，取癌组织和癌旁肝组织进行检测。肝细胞癌肝外转移至肝门或大网膜淋巴结2例，取淋巴结组织进行检测。继发性肝癌3例(分别为结肠癌、直肠癌和胰腺癌肝转移)，均为原发肿瘤切除之后出现的转移灶。取新鲜组织常规制备冰冻切片。
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基质溶解素cDNA探针长度1.6 Kb，EcoRⅠ酶切回收。应用地高辛随机引物法标记探针，杂交方法和步骤依据地高辛试剂盒操作流程进行。探针浓度约为390 ng/ml，42℃杂交过夜。终止反应后梯度乙醇脱水。镜下观察细胞出现蓝色反应颗粒为阳性。
2.结果：12例肝细胞癌组织中，7例基质溶解素mRNA表达阳性。2例肝癌肝外转移淋巴结组织和3例继发性肝癌均为阳性，正常肝组织和癌旁肝组织均阴性。病理分级Ⅰ～Ⅱ级肝细胞癌3例，均阴性；Ⅲ～Ⅳ级肝细胞癌9例，阳性7例。镜下观察阳性细胞呈散在的片状或灶状分布，显色和分布不均匀。阳性细胞多位于癌巢边缘部分或管道近旁。2例肝癌肝外转移淋巴结组织中癌细胞深度显色，聚集成片状。3例继发性肝癌也表达出较高水平的基质溶解素mRNA，阳性细胞区域显色深且较多，表达水平均高于未出现肝外转移的肝癌组织。
3.讨论：本实验结果发现，相当部分癌组织中并不表达基质溶解素，而表达基质溶解素的癌细胞则呈散在的片灶状分布，且多位于癌巢边缘或管道近旁，提示具有转移潜能的瘤细胞多位于肿瘤结节的表面和周边，因而肿瘤细胞也易于向周边侵袭并转移。有文献报道金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制物参与了肿瘤内血管的新生以及组织的改建和破坏，也显示了血管旁基质溶解素阳性细胞的增多。本组中病理分级Ⅲ～Ⅳ级肝癌组织的mRNA表达水平要高于Ⅰ～Ⅱ级的肝癌组织，表明随着疾病的进展获得转移潜能肿瘤细胞的增多。
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肝癌具有早期经门静脉系统发生肿瘤扩散的特点，患者往往尚未出现肝外转移即出现全身衰竭。肝癌肝外淋巴结转移说明其组织类型具有高转移性，其基质溶解素的高表达，提示基质溶解素参与了肝癌转移的过程。本组3例继发性肝癌均表达了较高水平的基质溶解素，也表明了金属蛋白酶在肿瘤转移中的重要性。 存活时间
天数
存活
数(只)
死亡
数(只)
存活率
(%)
主要死因
1
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25
3
89.28
肝衰、出血
2
20
5
71.43
PV血栓、肝衰、肝上IVC破裂出血
4
16
4
57.14
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胆漏、处死
7
10
6
35.71
胆漏、肝衰、处死
14
7
3
25.00
胆漏、腹腔及切口感染、处死
30
4
, http://www.100md.com
3
14.29
处死、心脏抽血致死
60
2
2
7.14
处死
90
2
0
7.14
200
, 百拇医药 2
0
7.14
基质溶解素(stromelysin)是金属蛋白酶具有代表性的主要成员之一，在多种肿瘤中已经证明恶性肿瘤细胞通过金属蛋白酶降解细胞外基质以突破组织屏障而发生转移，为探讨其在肝脏肿瘤转移中所起的作用，我们应用原位分子杂交技术分别检测了原发性肝癌、继发性肝癌和肝癌肝外转移淋巴结组织中基质溶解素mRNA的表达。
1.资料和方法：手术切除肝脏肿瘤和瘤旁肝组织标本17例。男14例，女3例。年龄33～69岁，平均47.6岁。伴肝硬变者13例，不伴肝硬变者4例。未出现肝外转移的原发性肝细胞癌12例，取癌组织和癌旁肝组织进行检测。肝细胞癌肝外转移至肝门或大网膜淋巴结2例，取淋巴结组织进行检测。继发性肝癌3例(分别为结肠癌、直肠癌和胰腺癌肝转移)，均为原发肿瘤切除之后出现的转移灶。取新鲜组织常规制备冰冻切片。
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基质溶解素cDNA探针长度1.6 Kb，EcoRⅠ酶切回收。应用地高辛随机引物法标记探针，杂交方法和步骤依据地高辛试剂盒操作流程进行。探针浓度约为390 ng/ml，42℃杂交过夜。终止反应后梯度乙醇脱水。镜下观察细胞出现蓝色反应颗粒为阳性。
2.结果：12例肝细胞癌组织中，7例基质溶解素mRNA表达阳性。2例肝癌肝外转移淋巴结组织和3例继发性肝癌均为阳性，正常肝组织和癌旁肝组织均阴性。病理分级Ⅰ～Ⅱ级肝细胞癌3例，均阴性；Ⅲ～Ⅳ级肝细胞癌9例，阳性7例。镜下观察阳性细胞呈散在的片状或灶状分布，显色和分布不均匀。阳性细胞多位于癌巢边缘部分或管道近旁。2例肝癌肝外转移淋巴结组织中癌细胞深度显色，聚集成片状。3例继发性肝癌也表达出较高水平的基质溶解素mRNA，阳性细胞区域显色深且较多，表达水平均高于未出现肝外转移的肝癌组织。
3.讨论：本实验结果发现，相当部分癌组织中并不表达基质溶解素，而表达基质溶解素的癌细胞则呈散在的片灶状分布，且多位于癌巢边缘或管道近旁，提示具有转移潜能的瘤细胞多位于肿瘤结节的表面和周边，因而肿瘤细胞也易于向周边侵袭并转移。有文献报道金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制物参与了肿瘤内血管的新生以及组织的改建和破坏，也显示了血管旁基质溶解素阳性细胞的增多。本组中病理分级Ⅲ～Ⅳ级肝癌组织的mRNA表达水平要高于Ⅰ～Ⅱ级的肝癌组织，表明随着疾病的进展获得转移潜能肿瘤细胞的增多。
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肝癌具有早期经门静脉系统发生肿瘤扩散的特点，患者往往尚未出现肝外转移即出现全身衰竭。肝癌肝外淋巴结转移说明其组织类型具有高转移性，其基质溶解素的高表达，提示基质溶解素参与了肝癌转移的过程。本组3例继发性肝癌均表达了较高水平的基质溶解素，也表明了金属蛋白酶在肿瘤转移中的重要性。 项 目
正常大鼠(n=10)
FHF大鼠(n=8)
APHLT后1周(n=8)
APHLT后2周内(n=6)
ALT(U/L)
35.38±25.20
661.50±48.94*
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209.38±49.40*
72.00±58.10
AST(U/L)
159.00±43.00
1609.30±468.9*
907.50±85.40*
119.00±47.95
ALP
62.88±36.60
534.30±163.7*
, 百拇医药
278.88±103.3*
94.33±29.00
Tbili(μmol/L)
7.69±8.06
30.86±12.59*
9.03±3.81*
6.86±3.76
BG(mmol/L)
5.57±0.68
2.88±0.75*
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4.88±0.95
5.61±0.63
PT(sec)
14.68±2.89
21.93±3.99*
14.83±2.38
14.50±2.60
*与正常大鼠相比P<0.01; ALT:丙氨酸氨基转移酶； AST：天门冬氨酸氨基转移酶； ALP：碱性磷酸酶； Tbili:血浆总胆红素； BG：血糖； PT：凝血酶原时间
4.辅助肝代谢支持作用：APHLT手术即时为FHF大鼠提供了有效的肝功支持，明显改善了FHF的生存率及生存时间。手术后近期死亡者除定期检查处死外，多死于手术后并发症。肝功能化验结果显示：反映肝功能损害的所有指标在FHF组显著异常。尤其是PT显著延长和血糖明显下降。APHLT术后1周肝功能损害仅表现在酶的异常和胆红素升高，术后2周，肝功指标均恢复正常。利用99mTc-HIDA行SPECT肝功评价结果表明，APHLT术后，辅助肝能有效摄取、排泄99mTc-HIDA。
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5.残肝再生与辅助肝萎缩：正常大鼠可耐受80%肝叶切除而存活，术后5～7天残肝再生可达原肝重量。本研究中残肝历经缺血，且有门静脉血分流，形态及功能恢复缓慢。研究结果表明：APHLT术后14天左右残肝已明显增生，并开始发挥物质代谢功能，辅助肝明显萎缩，呈现功能支持劣势。此后，受体在极大程度上依赖自身原肝再生部分的功能而存活，术后30天辅助肝完全纤维化，不必切除辅助肝，动物仍能长期存活。
参考文献
1Bondjema K,Jaeck D,Simeoni U,et al.Temporary auxiliary liver transplantation for subacute liver failure in child.Lancet,1993,342:778-779.
2吕毅,潘承恩,孟令忠,等.SD大鼠肝脏及附属管道的应用解剖.西安医科大学学报,1998,19:70-73.
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3黄洁夫,何晓顺,褶文海,等.辅助性部分肝脏移植治疗肝功能衰竭的实验研究.中华外科杂志,1994,32:371-374.
4Ricordi C,Flye MW,Lacy PE.Renal subcapsular transplantation of clusters of hepatocytes in conjunction with pancreatic islets.Transplantation,1988,45:1148-1151.
5Yu W,Wan X,Wright JR,et al.Heterotopic liver transplantation in rats:effect of intrahepatic islet isografts and split portal blood flow on liver integrity after auxiliary liveriso transplantation.Surgery,1994,115:108-117.
(收稿：1997-10-02 修回：1998-06-20), http://www.100md.com