原发性肝细胞癌端粒酶检测
作者：傅建民1 张 伟2 金顺钱2 赵东兵1 高 峰 1 刘 毅2 邵永孚1
单位：
关键词：
中华医学杂志/980934 为探险讨端粒酶作为原发性肝细胞癌(HCC)肿瘤标志物的可能性,我们采用端粒重复扩大记录(telomeric prepeat amplification protocol ,TRAP)方法，对原发性肝细胞癌HCC及其相应癌旁组织，其他肝脏良恶性肿瘤和正常肝组织进行端粒酶性检测。
一.材料与方法
标本取自我院手术切除的肝组织，离体后半小时内采集，液氮速冻后转至-80℃冰箱贮存备用。每例标本取100mg组织，研成粉沫，立即加※ 中国医学科学院 协和医科大学 肿瘤医院 肿瘤研究所 邮政编码:1000211.肿瘤医院腹部外科，2.肿瘤研究所肿瘤生物学检测中心本课题部分受中国医学科学院CMB院校长基金资助入预冷的裂解液200μl，混匀后在0℃裂解30分钟，4℃离心30分钟，吸取上清，进行蛋白质含量测定,放-80℃冰箱冻存。采用TRAP法检测端粒酶活性[1] ,反应体积25μl,反应体系含20mM Tris-HCl(pH 8.3)，1mM MgCl2, 63mM KCl, 0.005% Tween-20,1mM EGTA, 50mMdNTP, 1μg T4基因32蛋白，0.1μg/ml BSA，2μCi α32P- dCTP, 2U Taq酶和0.1μg TS引物(5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'),加6μg组织蛋白，混匀后30℃保温30分钟，90℃90秒灭活端粒酶，加0.1 μg CX引物(5'-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3'), PCR仪上进行31个循环(90℃40秒，50℃ 40 秒, 72 ℃50秒,72℃延长10分钟)，加入6μl电泳加样缓冲液，在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳后行放射自显影，12小时后显示结果。每次检测以6μg肺癌细胞系GLC蛋白作为阳性对照，阴性对照在反应液中不加组织提取物。采用X2检验进行统计分析。
, 百拇医药
二.结 果
阳性结果经放射自显影后可见间隔6bp的梯形带。在33例HCC中，有30例端粒酶表达阳性,阳性率90.9%，癌旁组织阳性率27.3%(9/33)。4/4肝转移癌及其2/4癌旁组织,1/6肝良性肿瘤端粒酶表达阳性,6例正常肝组织均端粒酶表达阴性。HCC肿瘤大小,数目,有无包膜,病理分级及HBsAg情况与端粒酶表达无关(p>0.05)。
讨 论
端粒酶是一种核糖核蛋白复合体,是一种专一的逆转录酶,能以自身的RNA为模板从头合成端粒,以补偿细胞分裂时的染色体末端缩短,维持端粒长度。最近研究表明,端粒酶的活化在细胞癌变中起重要作用,由于端粒酶的活化,使端粒的长度维持一种动态平衡,细胞得以无限制地增殖下去,由此导致了肿瘤的发生[1]。端粒酶活性已在人体绝大多数恶性肿瘤中获得检出，Shay[2]总结了近2年来文献报导的HCC端粒酶活性研究，其阳性率为149/173(86%)，癌旁阳性率为1/50(2%)，正常肝组织中未见端粒酶活性。
, 百拇医药
本研究检测了33例HCC组织端粒酶活性，阳性率为90.9%;端粒酶活性与HCC肿瘤大小,数目,有无包膜和分化程度无关,与国外文献报导基本一致,提示端粒酶活化普遍存在于HCC组织中,与HCC病理分期无必然联系,对于诊断高分化的小肝癌有临床应用价值[34]. 本研究癌旁组织端粒酶阳性率为27.3%,较国外文献报导为高，分析其原因可能是本组癌旁组织中绝大多数是结节性肝硬化(29/33)，而端粒酶阳性的癌旁组织均为肝硬化，其中部分为失代偿肝硬化，其结果与国外肝炎和肝硬化研究报导基本相符,提示端粒酶活化在HCC早期癌变过程中起重要作用[56]。
目前端粒酶已成为令人关注的抗肿瘤治疗的新靶点之一,端粒酶抑制剂有可能成为一类新的抗肿瘤药物。肝癌端粒酶的研究为肝癌抗端粒酶治疗提供了重要理论基础。
参考文献
1.Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity witrh immortal cells and cancer.Science,1994; 266: 2011-2015.
, http://www.100md.com
2.Shay JW,Bacchetti S,et al.A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer,1997;33(5),pp:787-791.
3.Ide T,Takara H,Nakashio M,et al.Telomerase in hepatocellular carcinogenesis. Hum Cell,1996,9:283-286.
4.Miura N,Horikawa I,Nashimoto A,et al.Progressive telomerase shortening and reactivation during hepatocellular carcinogenesis.Cancer Genet Cytogenet,1997;93(1):56-63.
5.Kojima H,Yokosuka F,Imazeki F,et al.Telomerase activity and telomere length in hepatocellular carcinoma and chronic liver disease.Gstroenterology, 1997;112(2):493-500.
6.Nakashio R,Kitamoto M,Takara H,et al.Significance of telomerase activity of small differentiated hepatocellular carcinoma.Int J Cancer,1997;74(2):141-1477.o1, 百拇医药
单位：
关键词：
中华医学杂志/980934 为探险讨端粒酶作为原发性肝细胞癌(HCC)肿瘤标志物的可能性,我们采用端粒重复扩大记录(telomeric prepeat amplification protocol ,TRAP)方法，对原发性肝细胞癌HCC及其相应癌旁组织，其他肝脏良恶性肿瘤和正常肝组织进行端粒酶性检测。
一.材料与方法
标本取自我院手术切除的肝组织，离体后半小时内采集，液氮速冻后转至-80℃冰箱贮存备用。每例标本取100mg组织，研成粉沫，立即加※ 中国医学科学院 协和医科大学 肿瘤医院 肿瘤研究所 邮政编码:1000211.肿瘤医院腹部外科，2.肿瘤研究所肿瘤生物学检测中心本课题部分受中国医学科学院CMB院校长基金资助入预冷的裂解液200μl，混匀后在0℃裂解30分钟，4℃离心30分钟，吸取上清，进行蛋白质含量测定,放-80℃冰箱冻存。采用TRAP法检测端粒酶活性[1] ,反应体积25μl,反应体系含20mM Tris-HCl(pH 8.3)，1mM MgCl2, 63mM KCl, 0.005% Tween-20,1mM EGTA, 50mMdNTP, 1μg T4基因32蛋白，0.1μg/ml BSA，2μCi α32P- dCTP, 2U Taq酶和0.1μg TS引物(5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'),加6μg组织蛋白，混匀后30℃保温30分钟，90℃90秒灭活端粒酶，加0.1 μg CX引物(5'-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3'), PCR仪上进行31个循环(90℃40秒，50℃ 40 秒, 72 ℃50秒,72℃延长10分钟)，加入6μl电泳加样缓冲液，在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳后行放射自显影，12小时后显示结果。每次检测以6μg肺癌细胞系GLC蛋白作为阳性对照，阴性对照在反应液中不加组织提取物。采用X2检验进行统计分析。
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二.结 果
阳性结果经放射自显影后可见间隔6bp的梯形带。在33例HCC中，有30例端粒酶表达阳性,阳性率90.9%，癌旁组织阳性率27.3%(9/33)。4/4肝转移癌及其2/4癌旁组织,1/6肝良性肿瘤端粒酶表达阳性,6例正常肝组织均端粒酶表达阴性。HCC肿瘤大小,数目,有无包膜,病理分级及HBsAg情况与端粒酶表达无关(p>0.05)。
讨 论
端粒酶是一种核糖核蛋白复合体,是一种专一的逆转录酶,能以自身的RNA为模板从头合成端粒,以补偿细胞分裂时的染色体末端缩短,维持端粒长度。最近研究表明,端粒酶的活化在细胞癌变中起重要作用,由于端粒酶的活化,使端粒的长度维持一种动态平衡,细胞得以无限制地增殖下去,由此导致了肿瘤的发生[1]。端粒酶活性已在人体绝大多数恶性肿瘤中获得检出，Shay[2]总结了近2年来文献报导的HCC端粒酶活性研究，其阳性率为149/173(86%)，癌旁阳性率为1/50(2%)，正常肝组织中未见端粒酶活性。
, 百拇医药
本研究检测了33例HCC组织端粒酶活性，阳性率为90.9%;端粒酶活性与HCC肿瘤大小,数目,有无包膜和分化程度无关,与国外文献报导基本一致,提示端粒酶活化普遍存在于HCC组织中,与HCC病理分期无必然联系,对于诊断高分化的小肝癌有临床应用价值[34]. 本研究癌旁组织端粒酶阳性率为27.3%,较国外文献报导为高，分析其原因可能是本组癌旁组织中绝大多数是结节性肝硬化(29/33)，而端粒酶阳性的癌旁组织均为肝硬化，其中部分为失代偿肝硬化，其结果与国外肝炎和肝硬化研究报导基本相符,提示端粒酶活化在HCC早期癌变过程中起重要作用[56]。
目前端粒酶已成为令人关注的抗肿瘤治疗的新靶点之一,端粒酶抑制剂有可能成为一类新的抗肿瘤药物。肝癌端粒酶的研究为肝癌抗端粒酶治疗提供了重要理论基础。
参考文献
1.Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity witrh immortal cells and cancer.Science,1994; 266: 2011-2015.
, http://www.100md.com
2.Shay JW,Bacchetti S,et al.A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer,1997;33(5),pp:787-791.
3.Ide T,Takara H,Nakashio M,et al.Telomerase in hepatocellular carcinogenesis. Hum Cell,1996,9:283-286.
4.Miura N,Horikawa I,Nashimoto A,et al.Progressive telomerase shortening and reactivation during hepatocellular carcinogenesis.Cancer Genet Cytogenet,1997;93(1):56-63.
5.Kojima H,Yokosuka F,Imazeki F,et al.Telomerase activity and telomere length in hepatocellular carcinoma and chronic liver disease.Gstroenterology, 1997;112(2):493-500.
6.Nakashio R,Kitamoto M,Takara H,et al.Significance of telomerase activity of small differentiated hepatocellular carcinoma.Int J Cancer,1997;74(2):141-1477.o1, 百拇医药