兔内毒素血症肺组织诱生型一氧化氮合酶基因表达的原位检测
作者：万梅 凌亦凌 金磊 韩凤连 王俊霞 丛斌
单位：050017 石家庄，河北医科大学病理生理教研室(万梅、凌亦凌)，中国人民解放军第三○二医院生物工程室(金磊，韩凤连)，河北医科大学分子生物学研究室(王俊霞、丛斌)
关键词：
中华医学杂志/980932 本实验观察了家兔内毒素的主要成分脂多糖(lipopolysacchride, LPS)注入后1小时和5小时，诱生型一氧化氮合酶iNOS蛋白和基因表达的肺内分布。
一、材料与方法
图1 阳性信号可见于LPS注入后5小时组肺内的巨噬细胞，棕黄色ABC法×400 图2 肺内的小血管中未见阳性信号，ABC法×200 图3 肺内巨噬细胞蓝黑色 原位杂交×400 图4 未见阳性信号 原位杂交×200 图5 原位PCR方法检测iNOS mRNA的分布.阳性信号(蓝黑色)可见于LPS注入后5小时组遍布全肺的巨噬细胞(↑)和白细胞()×400 图6 气管上皮细胞×400 图7 小动脉平滑肌细胞()、内皮细胞(↑) ×400 图8 静脉内皮细胞 ×400
, 百拇医药
家兔雌雄不限，体重2.0～2.5 kg，年龄10～12周。耳缘静脉注入乌拉坦1 g/kg，行全身麻醉。耳缘静脉注入大肠杆菌脂多糖8 mg/kg前(对照组)和后1小时(LPS 1小时组)，5小时 (LPS 5小时组)取肺组织用Northern杂交、免疫组织化学、原位杂交和原位PCR反应检测iNOS。上游引物和下游引物的序列是依据文献报道的iNOS cDNA序列(1621～1920)设计的。应用iNOS cDNA片段(1621～2653)作为模板，经PCR反应扩增出300 bp iNOS cDNA片段，经纯化后用DIG-11-dUTP标记(boehringer mannheim)作为杂交探针。采用异硫氰酸胍一步法进行肺组织RNA的提取，经电泳及转膜后进行预杂交和Northern杂交，地高辛标记的iNOS cDNA探针浓度为125 ng/ml。采用ABC免疫检测试剂盒进行肺组织免疫组织化学检测。石蜡包埋的肺组织切片在进行原位杂交反应时地高辛标记的iNOS cDNA探针浓度为2 ng/μl。切片进行原位PCR反应时先经杂交前预处理，然后进行原位反转录，最后在原位PCR仪上进行原位PCR反应。使用间接原位PCR反应体系，其中含3 mmol/L MgCl2，60 μl 10 mmol/L，dATP、dTTP、dCTP、dGTP，各10 μl，以及100 U Taq酶5 μl。
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二、结果
3组动物肺组织RNA的Northern杂交显示：对照组和LPS 1小时组未检测到iNOS mRNA，而LPS 5小时组iNOS mRNA有明显表达。
肺组织切片的免疫组织化学检测结果显示：对照组和LPS 1小时组肺组织中未见iNOS蛋白的阳性染色；LPS 5小时组阳性染色(棕黄色)可见于肺内的巨噬细胞(图1)，而肺内的气道上皮和血管中未见阳性信号(图2)。
肺组织切片的原位杂交检测结果显示，iNOS基因的阳性染色(蓝黑色)只存在于LPS 5小时组肺内巨噬细胞(图3)，其他细胞未见阳性信号(图4)。
肺组织切片的原位PCR检测显示，阳性染色(蓝黑色)除可见LPS 5小时组肺内绝大多数的巨噬细胞外，中性粒细胞(图5)，气管上皮细胞(图6)以及动脉，静脉的内皮细胞和平滑肌细胞也有阳性染色(图7、8)；对照组和LPS 1小时组没有阳性发现。
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在我们设置的LPS 5小时组一系列的阴性对照片中均未见到iNOS mRNA的阳性信号。
三、讨论
本实验所做的Northern杂交、免疫组织化学、原位杂交和原位PCR一系列的检测实验均显示，LPS注入后5小时肺组织中有iNOS的表达，而1小时却未见表达。免疫组织化学和原位杂交取得了相似的结果，即LPS注入后5小时肺组织中见到iNOS主要分布于肺内的巨噬细胞。而原位PCR显示阳性信号也存在于气管、支气管上皮细胞，血管平滑肌细胞和上皮细胞，表明在这些部位iNOS基因的拷贝数较低以至于原位杂交不能检测出来，同时表明原位PCR技术是比原位杂交技术更为敏感的能检测细胞中低拷贝基因的新技术。iNOS mRNA在上述细胞的表达提示兔内毒素血症中iNOS释放的NO可能是参与肺组织炎症反应和肺损伤的主要因素之一。 (收稿：1997-10-31 修回：1998-04-09), 百拇医药
单位：050017 石家庄，河北医科大学病理生理教研室(万梅、凌亦凌)，中国人民解放军第三○二医院生物工程室(金磊，韩凤连)，河北医科大学分子生物学研究室(王俊霞、丛斌)
关键词：
中华医学杂志/980932 本实验观察了家兔内毒素的主要成分脂多糖(lipopolysacchride, LPS)注入后1小时和5小时，诱生型一氧化氮合酶iNOS蛋白和基因表达的肺内分布。
一、材料与方法
图1 阳性信号可见于LPS注入后5小时组肺内的巨噬细胞，棕黄色ABC法×400 图2 肺内的小血管中未见阳性信号，ABC法×200 图3 肺内巨噬细胞蓝黑色 原位杂交×400 图4 未见阳性信号 原位杂交×200 图5 原位PCR方法检测iNOS mRNA的分布.阳性信号(蓝黑色)可见于LPS注入后5小时组遍布全肺的巨噬细胞(↑)和白细胞()×400 图6 气管上皮细胞×400 图7 小动脉平滑肌细胞()、内皮细胞(↑) ×400 图8 静脉内皮细胞 ×400
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家兔雌雄不限，体重2.0～2.5 kg，年龄10～12周。耳缘静脉注入乌拉坦1 g/kg，行全身麻醉。耳缘静脉注入大肠杆菌脂多糖8 mg/kg前(对照组)和后1小时(LPS 1小时组)，5小时 (LPS 5小时组)取肺组织用Northern杂交、免疫组织化学、原位杂交和原位PCR反应检测iNOS。上游引物和下游引物的序列是依据文献报道的iNOS cDNA序列(1621～1920)设计的。应用iNOS cDNA片段(1621～2653)作为模板，经PCR反应扩增出300 bp iNOS cDNA片段，经纯化后用DIG-11-dUTP标记(boehringer mannheim)作为杂交探针。采用异硫氰酸胍一步法进行肺组织RNA的提取，经电泳及转膜后进行预杂交和Northern杂交，地高辛标记的iNOS cDNA探针浓度为125 ng/ml。采用ABC免疫检测试剂盒进行肺组织免疫组织化学检测。石蜡包埋的肺组织切片在进行原位杂交反应时地高辛标记的iNOS cDNA探针浓度为2 ng/μl。切片进行原位PCR反应时先经杂交前预处理，然后进行原位反转录，最后在原位PCR仪上进行原位PCR反应。使用间接原位PCR反应体系，其中含3 mmol/L MgCl2，60 μl 10 mmol/L，dATP、dTTP、dCTP、dGTP，各10 μl，以及100 U Taq酶5 μl。
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二、结果
3组动物肺组织RNA的Northern杂交显示：对照组和LPS 1小时组未检测到iNOS mRNA，而LPS 5小时组iNOS mRNA有明显表达。
肺组织切片的免疫组织化学检测结果显示：对照组和LPS 1小时组肺组织中未见iNOS蛋白的阳性染色；LPS 5小时组阳性染色(棕黄色)可见于肺内的巨噬细胞(图1)，而肺内的气道上皮和血管中未见阳性信号(图2)。
肺组织切片的原位杂交检测结果显示，iNOS基因的阳性染色(蓝黑色)只存在于LPS 5小时组肺内巨噬细胞(图3)，其他细胞未见阳性信号(图4)。
肺组织切片的原位PCR检测显示，阳性染色(蓝黑色)除可见LPS 5小时组肺内绝大多数的巨噬细胞外，中性粒细胞(图5)，气管上皮细胞(图6)以及动脉，静脉的内皮细胞和平滑肌细胞也有阳性染色(图7、8)；对照组和LPS 1小时组没有阳性发现。
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在我们设置的LPS 5小时组一系列的阴性对照片中均未见到iNOS mRNA的阳性信号。
三、讨论
本实验所做的Northern杂交、免疫组织化学、原位杂交和原位PCR一系列的检测实验均显示，LPS注入后5小时肺组织中有iNOS的表达，而1小时却未见表达。免疫组织化学和原位杂交取得了相似的结果，即LPS注入后5小时肺组织中见到iNOS主要分布于肺内的巨噬细胞。而原位PCR显示阳性信号也存在于气管、支气管上皮细胞，血管平滑肌细胞和上皮细胞，表明在这些部位iNOS基因的拷贝数较低以至于原位杂交不能检测出来，同时表明原位PCR技术是比原位杂交技术更为敏感的能检测细胞中低拷贝基因的新技术。iNOS mRNA在上述细胞的表达提示兔内毒素血症中iNOS释放的NO可能是参与肺组织炎症反应和肺损伤的主要因素之一。 (收稿：1997-10-31 修回：1998-04-09), 百拇医药