重组人肝再生增强因子对大鼠实验性肝纤维化的保护作用
作者：王爱民 杨晓明 郭瑞峰 杨跃伟 李培建 王清明 贺福初
单位：
关键词：
中华医学杂志/980925 初步研究表明，从哺乳动物幼仔肝、胚胎肝组织提取的肝细胞生长因子(HGF)、肝刺激物(HSS)有抗慢性肝损伤的作用。我们以四氯化碳(CCl4)中毒性大鼠肝纤维化为模型，研究了重组人肝再生增强因子(hALR)的抗慢性肝损伤作用，结果表明，重组hALR有明显的抗肝纤维化活性。
一、材料与方法
1.动物：Wistar大鼠92只，雌雄各半，体重180～220 g，由全军动物中心提供。
2.人ALR：自行构建的pBV-hALR表达菌株[1]，经诱导表达、纯化，获纯度>95%的人ALR。
, http://www.100md.com
3.其它实验材料：四氯化碳为北京化工厂产品，含量>99.5%。羟脯氨酸标准品为中国科学院生物物理研究所中生公司产品。
4.模型的建立、动物分组及标本留取：40%(V/V)的CCl4(溶于蓖麻油中)按2 ml/kg予Wistar大鼠腹腔注射，每周2次，共8周。92只Wistar大鼠分为下列5组：(1) 正常组12只；(2) 模型组20只：按上述方法造模；(3) 阴性对照组20只：在造模的同时予生理盐水腹腔注射；(4) hALR 1组20只：在造模的同时，给予hALR 5 μg/kg腹腔注射，直至造模完成。(5) hALR 2组20只：在造模的同时予hALR 20 μg/kg腹腔注射，直至造模完成。所有动物在完成8周实验后活杀，切取肝脏。除留病理检查外，余迅速投入液氮，此后转入-70℃保存待检。血液标本离心后取血清，-70℃保存待检。
5.肝组织胶原蛋白含量测定：参照文献[2] 的方法略有改进。将所得结果羟脯氨酸含量换算为胶原蛋白含量。
, 百拇医药
6.血清丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)的测定：血清标本经全自动生化分析仪测定。血清甲胎蛋白(AFP)的测定：用天津九鼎医学生物工程公司生产的甲胎蛋白放免试剂盒，经γ计数仪测定。
7.统计学处理：各组动物存活率间用χ2检验；各组动物血清酶、胶原蛋白含量、AFP间用方差分析。
二、结果
1.hALR对大鼠存活率的影响(表1)
表1 各组动物存活情况 组别
总鼠数
存活数
存活
率(%)
, 百拇医药
正常对照组
12
12
100
模型组
20
11
55
阴性对照组
20
10
50
治疗组1
, 百拇医药 20
14
70
治疗组2
20
17
85*
注：与模型组相比，* P<0.05(χ2=4.29) 2.hALR对血清ALT、AST、LDH的影响(表2)
表2 各组动物血清酶(U/L，
±s)的变化 组别
鼠数
, http://www.100md.com
ALT
AST
LDH
正常
对照组
12
22
±8
144
±40
948
±265
模型组
, http://www.100md.com 11
103
±23
430
±92
2667
±632
阴性
对照组
10
96
±39
392
, 百拇医药 ±131
2605
±487
治疗
组1
14
71
±24*
293
±67*
2267
±432
治疗
, http://www.100md.com
组2
17
66
±21*
198
±48*
1099
±402*
注：与模型组相比，* P<0.01
3.各组动物肝组织病理学改变：HE染色光镜下可见模型组大鼠肝细胞广泛坏死、脂肪变性，有炎性细胞浸润；肝小叶结构破坏，纤维组织增生明显，将肝小叶分隔包绕成大小不等的肝细胞团。阴性对照组光镜下所见同模型组。hALR 1组肝细胞坏死、脂肪变性，汇管区及小叶间纤维组织增生均明显轻于模型组。hALR 2组较hALR 1组上述病理改变又有明显减轻，仅见汇管区纤维组织向小叶间伸展，未完全包裹肝小叶。
, 百拇医药
4.hALR对肝组织胶原蛋白含量及血清AFP水平的影响
各组动物(动物数同表2)肝组织胶原蛋白含量(mg/g)如下：正常对照组2.26±0.20，模型组6.97±0.31，阴性对照组7.03±0.24，治疗组1 5.81±0.25，治疗组2 4.57±0.40。治疗组1、2与模型组比，治疗组2与治疗组1比，差异均有非常显著意义(P<0.01)。
各组动物血清AFP水平差异无显著意义。
三、讨论
我们研究了基因重组的人肝再生增强因子(hALR)对实验性肝纤维化的预防作用。结果表明，hALR可提高CCl4所致慢性肝损伤动物的存活率，显著降低实验性肝纤维化大鼠血清ALT、AST、LDH水平。说明hALR对损伤肝细胞有一定的保护作用。病理检查可见hALR治疗组大鼠肝脏汇管区及小叶间纤维组织增生较模型组显著为轻。肝组织胶原蛋白含量的测定也证实hALR治疗组大鼠肝组织胶原蛋白含量显著低于模型组。这表明hALR有明显的抗纤维化活性。hALR抗肝纤维化作用的机理目前尚不清楚。
, http://www.100md.com
既往的研究表明肝刺激物(HSS)在体外可刺激多种肝癌细胞系的生长。对重组hALR的研究也表明它在体外能直接刺激原代培养肝细胞和HTC肝癌细胞增殖[3]。重组hALR长期应用是否会诱发肝癌的发生是我们非常关心的问题。本研究中重组hALR两组病理切片上未见细胞异型性，血清AFP检测与正常组无显著差异。这表明本实验未见重组hALR的体内诱癌活性。
综上所述，重组人肝再生增强因子有明显的抗肝纤维化活性，可望成为慢性肝病治疗药物。参考文献
1 杨晓明，谢玲，吴祖泽，等.肝再生增强因子在大肠杆菌中的高效表达及生物活性研究.生物物理与生物化学学报，1997，4：421-425.
2 郑少雄，蔡文仪，邱明才，等.血、尿羟脯氨酸测定的方法改进.中华医学检验杂志，1983，6：133-136.
3 杨晓明，胡志远，谢玲，等.人肝再生增强因子在体外能直接刺激HTC肝癌细胞增殖.生理学报，1997，49：557-561.
(收稿：1997-12-05 修回：1998-05-12), 百拇医药
单位：
关键词：
中华医学杂志/980925 初步研究表明，从哺乳动物幼仔肝、胚胎肝组织提取的肝细胞生长因子(HGF)、肝刺激物(HSS)有抗慢性肝损伤的作用。我们以四氯化碳(CCl4)中毒性大鼠肝纤维化为模型，研究了重组人肝再生增强因子(hALR)的抗慢性肝损伤作用，结果表明，重组hALR有明显的抗肝纤维化活性。
一、材料与方法
1.动物：Wistar大鼠92只，雌雄各半，体重180～220 g，由全军动物中心提供。
2.人ALR：自行构建的pBV-hALR表达菌株[1]，经诱导表达、纯化，获纯度>95%的人ALR。
, http://www.100md.com
3.其它实验材料：四氯化碳为北京化工厂产品，含量>99.5%。羟脯氨酸标准品为中国科学院生物物理研究所中生公司产品。
4.模型的建立、动物分组及标本留取：40%(V/V)的CCl4(溶于蓖麻油中)按2 ml/kg予Wistar大鼠腹腔注射，每周2次，共8周。92只Wistar大鼠分为下列5组：(1) 正常组12只；(2) 模型组20只：按上述方法造模；(3) 阴性对照组20只：在造模的同时予生理盐水腹腔注射；(4) hALR 1组20只：在造模的同时，给予hALR 5 μg/kg腹腔注射，直至造模完成。(5) hALR 2组20只：在造模的同时予hALR 20 μg/kg腹腔注射，直至造模完成。所有动物在完成8周实验后活杀，切取肝脏。除留病理检查外，余迅速投入液氮，此后转入-70℃保存待检。血液标本离心后取血清，-70℃保存待检。
5.肝组织胶原蛋白含量测定：参照文献[2] 的方法略有改进。将所得结果羟脯氨酸含量换算为胶原蛋白含量。
, 百拇医药
6.血清丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)的测定：血清标本经全自动生化分析仪测定。血清甲胎蛋白(AFP)的测定：用天津九鼎医学生物工程公司生产的甲胎蛋白放免试剂盒，经γ计数仪测定。
7.统计学处理：各组动物存活率间用χ2检验；各组动物血清酶、胶原蛋白含量、AFP间用方差分析。
二、结果
1.hALR对大鼠存活率的影响(表1)
表1 各组动物存活情况 组别
总鼠数
存活数
存活
率(%)
, 百拇医药
正常对照组
12
12
100
模型组
20
11
55
阴性对照组
20
10
50
治疗组1
, 百拇医药 20
14
70
治疗组2
20
17
85*
注：与模型组相比，* P<0.05(χ2=4.29) 2.hALR对血清ALT、AST、LDH的影响(表2)
表2 各组动物血清酶(U/L，
±s)的变化 组别鼠数
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ALT
AST
LDH
正常
对照组
12
22
±8
144
±40
948
±265
模型组
, http://www.100md.com 11
103
±23
430
±92
2667
±632
阴性
对照组
10
96
±39
392
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2605
±487
治疗
组1
14
71
±24*
293
±67*
2267
±432
治疗
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组2
17
66
±21*
198
±48*
1099
±402*
注：与模型组相比，* P<0.01
3.各组动物肝组织病理学改变：HE染色光镜下可见模型组大鼠肝细胞广泛坏死、脂肪变性，有炎性细胞浸润；肝小叶结构破坏，纤维组织增生明显，将肝小叶分隔包绕成大小不等的肝细胞团。阴性对照组光镜下所见同模型组。hALR 1组肝细胞坏死、脂肪变性，汇管区及小叶间纤维组织增生均明显轻于模型组。hALR 2组较hALR 1组上述病理改变又有明显减轻，仅见汇管区纤维组织向小叶间伸展，未完全包裹肝小叶。
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4.hALR对肝组织胶原蛋白含量及血清AFP水平的影响
各组动物(动物数同表2)肝组织胶原蛋白含量(mg/g)如下：正常对照组2.26±0.20，模型组6.97±0.31，阴性对照组7.03±0.24，治疗组1 5.81±0.25，治疗组2 4.57±0.40。治疗组1、2与模型组比，治疗组2与治疗组1比，差异均有非常显著意义(P<0.01)。
各组动物血清AFP水平差异无显著意义。
三、讨论
我们研究了基因重组的人肝再生增强因子(hALR)对实验性肝纤维化的预防作用。结果表明，hALR可提高CCl4所致慢性肝损伤动物的存活率，显著降低实验性肝纤维化大鼠血清ALT、AST、LDH水平。说明hALR对损伤肝细胞有一定的保护作用。病理检查可见hALR治疗组大鼠肝脏汇管区及小叶间纤维组织增生较模型组显著为轻。肝组织胶原蛋白含量的测定也证实hALR治疗组大鼠肝组织胶原蛋白含量显著低于模型组。这表明hALR有明显的抗纤维化活性。hALR抗肝纤维化作用的机理目前尚不清楚。
, http://www.100md.com
既往的研究表明肝刺激物(HSS)在体外可刺激多种肝癌细胞系的生长。对重组hALR的研究也表明它在体外能直接刺激原代培养肝细胞和HTC肝癌细胞增殖[3]。重组hALR长期应用是否会诱发肝癌的发生是我们非常关心的问题。本研究中重组hALR两组病理切片上未见细胞异型性，血清AFP检测与正常组无显著差异。这表明本实验未见重组hALR的体内诱癌活性。
综上所述，重组人肝再生增强因子有明显的抗肝纤维化活性，可望成为慢性肝病治疗药物。参考文献
1 杨晓明，谢玲，吴祖泽，等.肝再生增强因子在大肠杆菌中的高效表达及生物活性研究.生物物理与生物化学学报，1997，4：421-425.
2 郑少雄，蔡文仪，邱明才，等.血、尿羟脯氨酸测定的方法改进.中华医学检验杂志，1983，6：133-136.
3 杨晓明，胡志远，谢玲，等.人肝再生增强因子在体外能直接刺激HTC肝癌细胞增殖.生理学报，1997，49：557-561.
(收稿：1997-12-05 修回：1998-05-12), 百拇医药