门静脉高压症大鼠断流术后胃粘膜内皮素-1及一氧化氮合酶mRNA的表达
作者：管洪庚 陈易人 钱海鑫 吕光成 曹苇
单位：215006 苏州医学院第一附属医院普外科
关键词：高血压，门脉；门脉系统分流术，外科；内皮素；一氧化氮合酶
中华医学杂志/980923 【摘要】 目的 研究肝硬化门静脉高压性胃病(PHG)大鼠断流术后胃粘膜内皮素-1 (ET-1)、一氧化氮合酶(NOS)的基因表达，探讨ET-1、NO是否参与断流术后PHG局部微循环改变。方法 取Wistar大鼠36只，分正常对照组12只；肝硬化合并PHG组12只,模型复制是硫代乙酰胺60 mg*kg-1，腹腔注射，每日1次连续16周；断流手术组12只，按上述复制出模型，作联合断流术，术后饲养3个月。采用Dot blot杂交技术定量研究3组胃粘膜ET-1、NOS mRNA表达。结果 大鼠在肝硬化合并PHG时，ET-1 mRNA较正常减少(P<0.01)，断流术后其变化更加明显(P<0.01)；NOS mRNA在肝硬化PHG时含量轻度增加(P>0.05)，断流术后增加明显，差异有显著意义(P<0.01)。结论 断流术后胃粘膜ET含量不足使缩血管能力下降、NO释放过多使血管过分扩张, ET/NO表达比例失调可能至少部分是断流术后PHG微循环紊乱再出血的重要原因。
, http://www.100md.com
Expression of endothelin-1 and nitric oxide synthase mRNA in gastric mucosa of rats with cirrhosis and portal hyptensive gastropathy after disconnective opertations.
Guan Honggeng, Chen Yiren, Qian Haixin et al. Department of General Surgery, First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou 215006
【Abstract】 Objective To investigate expression of endothelin-1 (ET-1) and nitric oxide synthase(NOS) gene in gastric mucosa in the rats with cirrhosis and portal hypertensive gastropathy (PHG) after disconnective operation. Methods Wistar rats were divided into three groups: normal (n=12)，cirrhosis and PHG (n=12), and post-disconnective (n=12). The rat models were induced by intraperitonal injection of thiocetamide for 16 weeks .The third group rats were reared for 3 months after the operations. ET-1 and NOS mRNA from the gastric mucosa of the three groups were measured quantitatively by Dot blot technique. Results ET-1 mRNA decreased in the PHG rats as compared to the nomal rats (P<0.01). Further decrease was found in the post-disconnective rats (P<0.01). NOS mRNA increased slightly in the PHG rats (P>0.05) and increased obviously in the post-disconnective rats (P<0.01). Conclusions After the cirrhosis and PHG rats were subjected to disconnective operations, ET-1 was insufficient and NOS was too much in the gastric mucosa. These resulted in the gastric mucosal vessel dilatation. The imbalance of ET/NO proportion could partly attribute to rebleeding after disconnection.
, 百拇医药
【Key words】 Hypertension, portal Portacaval anostamosis, surgery Endothelin Nitric oxide synthase.
(Natl Med J China, 1998, 78：702-703)
门静脉高压性胃病(PHG) 病理机制尚未明了,断流术后PHG机理更为复杂。为此作者检测了正常、PHG鼠及断流术后胃局部内皮素1(ET-1)和一氧化氮合酶(NOS)的基因表达,探讨其是否参与PHG尤其断流术后PHG的发病机制。
材料与方法
一、材料
1.试剂：ET-1 cDNA探针，长度为800 bp,由北京医科大学心肺内分泌研究室提供。NOS cDNA探针,长度670 bP,购于北京华美公司,提取总RNA的TRZOLTM试剂为GIBCO/BRL公司产品。a-32P-dNTP为Amersham公司产品,放射性比活度111GBq/mol。焦碳酸二乙酯(PEPC)为Fluka公司产品。
, http://www.100md.com
2.实验分组及准备：取Wistar大鼠36只(苏州医学院实验动物中心),全部雄性,6周龄,体重150-200g。随机分3组。A组为正常对照,与实验组同期饲养,不作处理;B组为肝硬化合并PHG模型，3%硫代乙酰胺(thioacetamide TAA),大鼠50 mg-1*kg-1腹腔注射,每日1次,计16周,后停药自由饲养。C组为断流术组,按B组方法用药16周停药1周,作联合断流术,术后饲养3个月。每组12只。3组动物同时准备,同批用于研究。
3.动物处理：各组动物到期后,每次每组随机取1只,共3只,分别处死。取全胃，剖开，用0.1% PEPC水反复冲洗胃腔至少3次,小心剥离胃粘膜,分别放入试管。注意所有操作器械均180℃干烤3小时,确保无RNA裂解酶污染。
二、方法
1.总RNA提取按TRIZOLTM方法：50～100 mg胃粘膜组织,粗玻璃棒捣碎→加1 ml TrizolTM试剂→匀浆→0.2 ml 氯仿→振荡15秒→离心(12 000 r/min)15秒→取上清液0.5 ml异丙醇→离心(12 000转/分)15秒→70%乙醇洗沉淀→晾干。
, 百拇医药
2.探针标记：膜转移后DNA模板约50 ng,100 ℃变性已到3分钟后,加入标记混合物10 μl,dNTP至20 μmol,BSA至400 μg/ml,a-32P-dNTP 1850kBq补加水至终体积50 μl，并加入DNA聚合酶1大片段5U,室温2小时或过夜。用DE-81膜测掺入率>70%。
3.杂交：将交联有RNA样品的膜至于杂交袋中,加入快速杂交液至0.125 ml/cm2膜,预杂交65℃半小时,随后加入标记好的探针。65℃杂交2个小时,杂交后首先在室温用2×标准枸橼酸盐水0.1%十二烷基硫酸钠洗膜2次。然后在暗盒中放射自显影曝光,在2～3天后冲片。用灰度扫描仪图像分析系统定量处理放射自显影强度。 数据以
±s表示,方差分析。
结果
, http://www.100md.com 1.ET-1 mRNA表达水平：各组间胃粘膜ET mRNA比较,大鼠正常情况下,即表达相当多的ET-1,灰度为4.1±0.8(A值),在肝硬化、PHG时,ET-1 mRNA减少为3.01±0.66(P<0.01),而在断流术后3个月进一步减少为1.91±0.38，与PHG模型、正常组比较差异均有极显著意义(P<0.01)。
2.NOSmRNA表达水平：大鼠在生理状态下胃粘膜表达NOS的mRNA很少，仅1.45±0.31 A值，肝硬化PHG时,NOS mRNA轻度增加1.51±0.37(P>0.05),断流术后3个月明显上升为3.85±0.61 A值，与正常、PHG时比较差异均有极显著意义(分别为P<0.01)。
讨论
本实验说明胃粘膜细胞可表达相当水平的ET-1 mRNA,ET通过旁分泌形式使胃局部动脉平滑肌收缩,维持胃微循环。在肝硬化门静脉高压时,有报道,血浆ET较正常低,Schrier[1]认为这种ET-1含量不足导致血管扩张,与高动力循环有关,亦可造成水钠潴留或腹水形成。我们观察到鼠在肝硬化、PHG时,胃粘膜局部分泌ET较正常低,断流术后下降更为显著，提示局部ET分泌不足，小动脉扩张，使PHG充血加剧,如胃A-V shunt扩大开放,则有效血量更加不足。大鼠从正常→肝硬化PHG→断流术后,胃充血状态下的粘膜缺血逐步加重的因素之一，可能是胃局部ET逐步减少之故。
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本实验证实鼠胃粘膜细胞可表达NOSmRNA,在肝硬变PHG时局部分泌NOS增加,断流术后更上升,提示NO参与PHG及断流术后PHG再出血的病理过程。 Pizcueta等[2]认为门静脉高压时,NO释放增加可使缩血管敏感性下降,以致胃粘膜血管扩张,A-V shunt开放,Casadevall等[3]认为NO调节胃肠道血流。门静脉高压时,激活剂如内毒素等使NOS激活,NO大量释放,使胃粘膜充血致PHG。Guslandi[4]认为NO在胃肠道广泛存在,使平滑肌舒张,调节胃肠动力。门静脉高压时,NO增多,胃运动功能减弱,使粘膜与损伤性因素接触延长,加剧PHG。
我们的研究及文献报道多种类型门静脉高压动物模型及临床肝硬化合并PHG患者的胃都具有这种特征性的血流动力学改变。Casadevall[3]认为是门静脉回流受阻和动脉供血来源增加即“后向性(Backward)血流”与“前向性(forward)血流”共同作用的结果。我们的结果提示，ET、NO这2种血管调节因子参与了门静脉高压性胃病上述血流动力学变化的病理过程。因此, 胃粘膜表达ET/NO比例失调可能至少部分是断流术后PHG致再出血的局部因素。
, 百拇医药
参考文献
1 Schrier RW. Peripheral aterial vasodilation hypothesis: a proposal for initiation of renal sodium and water ratention of cirrosis. Hepatology，1988，8: 1151-1156.
2 Pizcueta P.Pique JM,Fernandea M,et al. Moducation of the hyperdynamic circulation of cirrhotic rats by nitric oxide inhibition.Gastroenteroly，1992，103:1909-1913.
3 Casadevall M, Panes J, Pique JM, et al. Involvement of nitric oxide and prostaglandins in gastric mucosal hyperemia of portal hypertensive and sthetizde rats. Hepatology，1993，18：628-631.
4 Guslandi M. Nitric oxide:an ubiquitous actor in the gastrontestonal tract.Dig Disease, 1994，12：28-32.
(收稿：1998-01-14 修回：1998-05-27, 百拇医药
单位：215006 苏州医学院第一附属医院普外科
关键词：高血压，门脉；门脉系统分流术，外科；内皮素；一氧化氮合酶
中华医学杂志/980923 【摘要】 目的 研究肝硬化门静脉高压性胃病(PHG)大鼠断流术后胃粘膜内皮素-1 (ET-1)、一氧化氮合酶(NOS)的基因表达，探讨ET-1、NO是否参与断流术后PHG局部微循环改变。方法 取Wistar大鼠36只，分正常对照组12只；肝硬化合并PHG组12只,模型复制是硫代乙酰胺60 mg*kg-1，腹腔注射，每日1次连续16周；断流手术组12只，按上述复制出模型，作联合断流术，术后饲养3个月。采用Dot blot杂交技术定量研究3组胃粘膜ET-1、NOS mRNA表达。结果 大鼠在肝硬化合并PHG时，ET-1 mRNA较正常减少(P<0.01)，断流术后其变化更加明显(P<0.01)；NOS mRNA在肝硬化PHG时含量轻度增加(P>0.05)，断流术后增加明显，差异有显著意义(P<0.01)。结论 断流术后胃粘膜ET含量不足使缩血管能力下降、NO释放过多使血管过分扩张, ET/NO表达比例失调可能至少部分是断流术后PHG微循环紊乱再出血的重要原因。
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Expression of endothelin-1 and nitric oxide synthase mRNA in gastric mucosa of rats with cirrhosis and portal hyptensive gastropathy after disconnective opertations.
Guan Honggeng, Chen Yiren, Qian Haixin et al. Department of General Surgery, First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou 215006
【Abstract】 Objective To investigate expression of endothelin-1 (ET-1) and nitric oxide synthase(NOS) gene in gastric mucosa in the rats with cirrhosis and portal hypertensive gastropathy (PHG) after disconnective operation. Methods Wistar rats were divided into three groups: normal (n=12)，cirrhosis and PHG (n=12), and post-disconnective (n=12). The rat models were induced by intraperitonal injection of thiocetamide for 16 weeks .The third group rats were reared for 3 months after the operations. ET-1 and NOS mRNA from the gastric mucosa of the three groups were measured quantitatively by Dot blot technique. Results ET-1 mRNA decreased in the PHG rats as compared to the nomal rats (P<0.01). Further decrease was found in the post-disconnective rats (P<0.01). NOS mRNA increased slightly in the PHG rats (P>0.05) and increased obviously in the post-disconnective rats (P<0.01). Conclusions After the cirrhosis and PHG rats were subjected to disconnective operations, ET-1 was insufficient and NOS was too much in the gastric mucosa. These resulted in the gastric mucosal vessel dilatation. The imbalance of ET/NO proportion could partly attribute to rebleeding after disconnection.
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【Key words】 Hypertension, portal Portacaval anostamosis, surgery Endothelin Nitric oxide synthase.
(Natl Med J China, 1998, 78：702-703)
门静脉高压性胃病(PHG) 病理机制尚未明了,断流术后PHG机理更为复杂。为此作者检测了正常、PHG鼠及断流术后胃局部内皮素1(ET-1)和一氧化氮合酶(NOS)的基因表达,探讨其是否参与PHG尤其断流术后PHG的发病机制。
材料与方法
一、材料
1.试剂：ET-1 cDNA探针，长度为800 bp,由北京医科大学心肺内分泌研究室提供。NOS cDNA探针,长度670 bP,购于北京华美公司,提取总RNA的TRZOLTM试剂为GIBCO/BRL公司产品。a-32P-dNTP为Amersham公司产品,放射性比活度111GBq/mol。焦碳酸二乙酯(PEPC)为Fluka公司产品。
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2.实验分组及准备：取Wistar大鼠36只(苏州医学院实验动物中心),全部雄性,6周龄,体重150-200g。随机分3组。A组为正常对照,与实验组同期饲养,不作处理;B组为肝硬化合并PHG模型，3%硫代乙酰胺(thioacetamide TAA),大鼠50 mg-1*kg-1腹腔注射,每日1次,计16周,后停药自由饲养。C组为断流术组,按B组方法用药16周停药1周,作联合断流术,术后饲养3个月。每组12只。3组动物同时准备,同批用于研究。
3.动物处理：各组动物到期后,每次每组随机取1只,共3只,分别处死。取全胃，剖开，用0.1% PEPC水反复冲洗胃腔至少3次,小心剥离胃粘膜,分别放入试管。注意所有操作器械均180℃干烤3小时,确保无RNA裂解酶污染。
二、方法
1.总RNA提取按TRIZOLTM方法：50～100 mg胃粘膜组织,粗玻璃棒捣碎→加1 ml TrizolTM试剂→匀浆→0.2 ml 氯仿→振荡15秒→离心(12 000 r/min)15秒→取上清液0.5 ml异丙醇→离心(12 000转/分)15秒→70%乙醇洗沉淀→晾干。
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2.探针标记：膜转移后DNA模板约50 ng,100 ℃变性已到3分钟后,加入标记混合物10 μl,dNTP至20 μmol,BSA至400 μg/ml,a-32P-dNTP 1850kBq补加水至终体积50 μl，并加入DNA聚合酶1大片段5U,室温2小时或过夜。用DE-81膜测掺入率>70%。
3.杂交：将交联有RNA样品的膜至于杂交袋中,加入快速杂交液至0.125 ml/cm2膜,预杂交65℃半小时,随后加入标记好的探针。65℃杂交2个小时,杂交后首先在室温用2×标准枸橼酸盐水0.1%十二烷基硫酸钠洗膜2次。然后在暗盒中放射自显影曝光,在2～3天后冲片。用灰度扫描仪图像分析系统定量处理放射自显影强度。 数据以
±s表示,方差分析。结果
, http://www.100md.com 1.ET-1 mRNA表达水平：各组间胃粘膜ET mRNA比较,大鼠正常情况下,即表达相当多的ET-1,灰度为4.1±0.8(A值),在肝硬化、PHG时,ET-1 mRNA减少为3.01±0.66(P<0.01),而在断流术后3个月进一步减少为1.91±0.38，与PHG模型、正常组比较差异均有极显著意义(P<0.01)。
2.NOSmRNA表达水平：大鼠在生理状态下胃粘膜表达NOS的mRNA很少，仅1.45±0.31 A值，肝硬化PHG时,NOS mRNA轻度增加1.51±0.37(P>0.05),断流术后3个月明显上升为3.85±0.61 A值，与正常、PHG时比较差异均有极显著意义(分别为P<0.01)。
讨论
本实验说明胃粘膜细胞可表达相当水平的ET-1 mRNA,ET通过旁分泌形式使胃局部动脉平滑肌收缩,维持胃微循环。在肝硬化门静脉高压时,有报道,血浆ET较正常低,Schrier[1]认为这种ET-1含量不足导致血管扩张,与高动力循环有关,亦可造成水钠潴留或腹水形成。我们观察到鼠在肝硬化、PHG时,胃粘膜局部分泌ET较正常低,断流术后下降更为显著，提示局部ET分泌不足，小动脉扩张，使PHG充血加剧,如胃A-V shunt扩大开放,则有效血量更加不足。大鼠从正常→肝硬化PHG→断流术后,胃充血状态下的粘膜缺血逐步加重的因素之一，可能是胃局部ET逐步减少之故。
, http://www.100md.com
本实验证实鼠胃粘膜细胞可表达NOSmRNA,在肝硬变PHG时局部分泌NOS增加,断流术后更上升,提示NO参与PHG及断流术后PHG再出血的病理过程。 Pizcueta等[2]认为门静脉高压时,NO释放增加可使缩血管敏感性下降,以致胃粘膜血管扩张,A-V shunt开放,Casadevall等[3]认为NO调节胃肠道血流。门静脉高压时,激活剂如内毒素等使NOS激活,NO大量释放,使胃粘膜充血致PHG。Guslandi[4]认为NO在胃肠道广泛存在,使平滑肌舒张,调节胃肠动力。门静脉高压时,NO增多,胃运动功能减弱,使粘膜与损伤性因素接触延长,加剧PHG。
我们的研究及文献报道多种类型门静脉高压动物模型及临床肝硬化合并PHG患者的胃都具有这种特征性的血流动力学改变。Casadevall[3]认为是门静脉回流受阻和动脉供血来源增加即“后向性(Backward)血流”与“前向性(forward)血流”共同作用的结果。我们的结果提示，ET、NO这2种血管调节因子参与了门静脉高压性胃病上述血流动力学变化的病理过程。因此, 胃粘膜表达ET/NO比例失调可能至少部分是断流术后PHG致再出血的局部因素。
, 百拇医药
参考文献
1 Schrier RW. Peripheral aterial vasodilation hypothesis: a proposal for initiation of renal sodium and water ratention of cirrosis. Hepatology，1988，8: 1151-1156.
2 Pizcueta P.Pique JM,Fernandea M,et al. Moducation of the hyperdynamic circulation of cirrhotic rats by nitric oxide inhibition.Gastroenteroly，1992，103:1909-1913.
3 Casadevall M, Panes J, Pique JM, et al. Involvement of nitric oxide and prostaglandins in gastric mucosal hyperemia of portal hypertensive and sthetizde rats. Hepatology，1993，18：628-631.
4 Guslandi M. Nitric oxide:an ubiquitous actor in the gastrontestonal tract.Dig Disease, 1994，12：28-32.
(收稿：1998-01-14 修回：1998-05-27, 百拇医药