胃肠道粘膜下肿瘤端粒酶表达的意义*
作者：杨仕明 房殿春 罗元辉 鲁 荣 刘为纹
单位：
关键词：胃肠肿瘤/酶学；胃粘膜/酶学；肠粘膜/酶学；端粒/酶学；逆转录酶类/代谢
华人消化杂志980914Telomerase activity in gastroenterological submucous tumors and its clinical significance*
YANG Shi-Ming, FANG Dian-Chun, LUO Yuan-Hui, LU Rong, and LIU Wei-Wen
Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
, 百拇医药
Subject headings gastrointestinal neoplasms/enzymology; gastric mucosa/enzymology; intestinal mucosa/enzymology; telomere/enzymology; RNA-directed DNA polymerase
Abstract
AIM To explore the role of telomerase activity in the development and progression of gastric submucous tumors.
METHODS Telomerase activity was examined in 5 specimens with lymphomas and 1 specimen with smooth muscle tumor, by using telomeric repeat amplification protocol (TRAP). Meanwhile, malignant tumor tissues were also analyzed by serial dilution.
, 百拇医药
RESULTS Telomerase activity was detected in 4 of 5 lymphomas and 1 benign tumor, as well as 2 of 6 adjacent tissues.
CONCLUSION Telomerase activity is not only detected in malignant tumors, but also in benign tumors of gastroenterological submucosa.
摘 要
目的 探讨胃肠道粘膜下肿瘤端粒酶活性表达的意义.
方法 采用TRAP法检测6例胃肠道粘膜下肿瘤(5例恶性淋巴瘤，1例平滑肌瘤)的端粒酶活性，同时对恶性肿瘤端粒酶提取物进行梯度稀释，以检测其活性大小.
, 百拇医药
结果 恶性淋巴瘤中5例中有4例端粒酶阳性，1例平滑肌瘤亦为阳性，6例瘤(癌)旁组织中，端粒酶2例阳性，余均为阴性.
结论 端粒酶不仅在胃肠道粘膜下恶性肿瘤表达，而且在胃肠道粘膜下良性肿瘤中亦可有阳性表达.
0 引言
正常人体细胞端粒逐渐缩短将使细胞退出细胞周期而衰老死亡. 永生细胞或恶性细胞由于其端粒酶激活，端粒长度不再继续缩短而维持一种动态平衡状态，因此这些细胞可以无限制地有丝分裂下去，由此导致肿瘤的发生. 有关胃癌端粒酶活性检测国外仅见个别报道，但胃粘膜下肿瘤端粒酶的表达，国内外均未见研究. 本文对6例胃肠道粘膜下肿瘤的端粒酶活性进行检测，藉以探讨端粒酶在这些肿瘤中表达.
1 材料和方法
1.1 材料 胃肠道粘膜下恶性淋巴瘤5例及胃粘膜下平滑肌瘤1例，均来自本院1995-01/1996-12的手术切除标本. 手术切下肿瘤后，立即收集肿瘤及癌旁组织(距肿瘤边缘2cm)，剔除出血及坏死组织后-80℃贮存备用，所有病例均经病理证实. 每例标本各取50mg～100mg，置经DEPC处理的试管中，用冰缓冲液200μL洗涤[10mmol/L HEPES-KOH(pH 7.5， Merk公司)，1.5mmol/L MgCl2, 10mmol/L，KCl， 1mmol/L DTT (Promega公司)]. 然后用眼科剪将组织剪碎，加冷裂解液200μL [0.5% CHAPS (Boehringer Mannheim), 10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L MgCl2, 1mmol/L EGTA(Boehringer Mannheim), 100mL/L甘油，5mmol/L β-巯基乙醇，0.1mmol/L AEBSF (Boehringer Mannheim)]，混匀后冰上孵育30min，收集上清，紫外分光光度计(Beckman公司)测定蛋白质及核酸浓度，-80℃冻存.
, 百拇医药
1.2 方法 采用Kim et al报告的TRAP(telomere repeat amplification protocol)法略加改进[3]. 简述如下： 按核酸定量取1μg提取物，加反应液[含20mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，1.5mmol/L MgCl2， 63mmol/L KCl， 0.05mL/L Tween-20, 1mmol/L EGTA, dNTP各150mmol/L，32P dCTP和32PdATP 各 37mBq, 0.03μg TS引物(5＇-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3＇)，0.2μg T4g 32蛋白(Boehringer Mannheim)]加去离子水至8.5μL，室温下反应30min，以完成端粒酶介导的TS延伸反应. 然后加CX引物(5＇-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3＇)，混匀后90℃作用90s，以灭活端粒酶活性，然后于PCR循环仪(Perkin Elmer Cetus, 2400)进行扩增反应，循环参数为93℃ 40s、48℃ 40s、72℃ 60s，循环38次，最后72℃继续反应10min. 每次以已知端粒酶阳性组织作为阳性对照，以RNA酶消化过的组织作为阴性对照. 对于癌组织，取1μg提取物用裂解液按1∶10及1∶100分别稀释后重复上述反应. 取10μL PCR产物100g/L非变性聚丙烯凝胶电泳，干燥后医用X光片放射自显影24h～36h.
, 百拇医药
2 结果
TRAP阳性产物经放射自显影后可见间隔6bp的梯形信号(图1). 恶性淋巴瘤5例中有4例端粒酶阳性，1例胃平滑肌瘤端粒酶亦为阳性(表1). 瘤旁组织中，端粒酶2例阳性，其余均为阴性.
图1 端粒酶在胃肠道粘膜下肿瘤中的表达.
注：1，2，4，5为淋巴瘤，3为平滑肌瘤(弱阳性)
表1 胃肠道粘膜下肿瘤端粒酶表达与临床病理的关系
号
性别
年龄
, 百拇医药
肿瘤部位
大小(cm)
浸润深度
淋巴结转移
诊断
端粒酶活性
癌旁
×1
×10
×100
1
男
60
, 百拇医药
胃窦
2×2
粘膜下
+
淋巴瘤
+
+
-
-
2
女
42
胃窦
3×2
, 百拇医药
深肌层
-
淋巴瘤
+
+
-
+
3
男
56
直肠
4×3
浆膜
+
, 百拇医药
淋巴瘤
-
-
-
-
4
男
31
胃体
6×6
浆膜
-
淋巴瘤
+
, http://www.100md.com
+
-
-
5
男
46
结肠
1cm多发
肌层
+
淋巴瘤
+
+
-
, 百拇医药
+
6
男
74
胃体
7×5
平滑肌瘤
+
-
3 讨论
端粒是真核生物染色体末端一种由许多简单重复序列及其相关的蛋白质组成的复合体，具有防止染色体结构的完整性及解决末端复制难题(end replication problem)的作用[1]. 端粒酶本质上是一种逆转录酶，由RNA和蛋白质组成，它以自身RNA为模板，合成端粒重复序列，使端粒延伸并维持一定长度. 除生殖细胞和少数造血细胞外，正常体细胞的端粒酶均处于失活状态，因此，正常体细胞染色体的端粒是随着有丝分裂次数的增加而逐渐缩短，当端粒短至一定程度时，细胞停止分裂，进入衰老期. 永生细胞(immortal cell)和癌细胞由于端粒酶活化，端粒不再继续缩短而维持一种动态平衡状态，细胞可以无限制地分裂繁殖下去[2].
, http://www.100md.com
端粒酶活化可见于多种肿瘤[3-5]. Hiyama et al[4]检测胃癌组织66例，有56例(85%)检出端粒酶活性，端粒酶阳性率在晚期胃癌明显高于早期胃癌，在淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组，提示检测端粒酶活性不仅可检出临床标本中永生细胞而诊断肿瘤，而且对预后的估计亦有意义. 我们采用TRAP及梯度稀释法检测了胃恶性淋巴瘤5例，发现端粒酶阳性4例，阴性1例，提示端粒酶活化可能是导致胃恶性淋巴瘤发生的重要原因，其实际临床意义需进一步研究. 本组4例端粒酶阳性的恶性淋巴瘤，有2例不但肿瘤组织端粒酶阳性，且肿瘤旁组织端粒酶亦为阳性，其原因一要考虑肿瘤旁的肿瘤细胞浸润，亦可能与局部有大量淋巴细胞浸润有关. 有作者报告，外周血淋巴细胞和骨髓造血组织可检测到低活性的端粒酶[6].
文献报告良性肿瘤的端粒酶表达多为阴性[3]. 我们检测了胃平滑肌肿瘤1例，其端粒酶为阳性. 作者曾对本院42例平滑肌肿瘤进行分析，发现直径>5cm者多为肉瘤，而<5cm者多为良性平滑肌瘤[7]. 本组1例平滑肌瘤体积较大，最大径为7cm，其端粒酶阳性可能反映了此病有潜在的恶变性质. 因此，检测胃平滑肌瘤端粒酶活性对监测平滑肌瘤的恶性变可能具有重要意义.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Zakian VA. Telomeres: beginning to understand the end. Science, 1995;270(5242):1601-1607
2 de Lange T. Activation of telomerase in a human tumor. Proc Natl Acad Sci USA, 1994;91(8):2882-2885
3 Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Prowse KR, Harley CB, West MD et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994;266(5193):2011-2015
, 百拇医药
4 Hiyama E, Okoyama T, Tatsumoto N, Hiyama K, Imamura Y, Murakami Y et al. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res, 1995;55(15):3258-3262
5 Hiyama E, Gollahon L, Kataoka T, Kuroi K, Yokoyama T, Gazdar AF et al. Telomerase activity in human breast tumors. J Natl Cancer Ins, 1996;88(2):116-122
6 Counter CM, Gupta J, Harley CB, Leber B, Bacchetti S. Telomerase activity in normal leukocytes and in hematologic malignancies. Blood, 1995;85(9):2315-2320
7 房殿春，刘为纹，王源敏. 胃平滑肌肿瘤的临床诊断与治疗. 中华内科杂志，1987；26(5)：260-262, 百拇医药
单位：
关键词：胃肠肿瘤/酶学；胃粘膜/酶学；肠粘膜/酶学；端粒/酶学；逆转录酶类/代谢
华人消化杂志980914Telomerase activity in gastroenterological submucous tumors and its clinical significance*
YANG Shi-Ming, FANG Dian-Chun, LUO Yuan-Hui, LU Rong, and LIU Wei-Wen
Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
, 百拇医药
Subject headings gastrointestinal neoplasms/enzymology; gastric mucosa/enzymology; intestinal mucosa/enzymology; telomere/enzymology; RNA-directed DNA polymerase
Abstract
AIM To explore the role of telomerase activity in the development and progression of gastric submucous tumors.
METHODS Telomerase activity was examined in 5 specimens with lymphomas and 1 specimen with smooth muscle tumor, by using telomeric repeat amplification protocol (TRAP). Meanwhile, malignant tumor tissues were also analyzed by serial dilution.
, 百拇医药
RESULTS Telomerase activity was detected in 4 of 5 lymphomas and 1 benign tumor, as well as 2 of 6 adjacent tissues.
CONCLUSION Telomerase activity is not only detected in malignant tumors, but also in benign tumors of gastroenterological submucosa.
摘 要
目的 探讨胃肠道粘膜下肿瘤端粒酶活性表达的意义.
方法 采用TRAP法检测6例胃肠道粘膜下肿瘤(5例恶性淋巴瘤，1例平滑肌瘤)的端粒酶活性，同时对恶性肿瘤端粒酶提取物进行梯度稀释，以检测其活性大小.
, 百拇医药
结果 恶性淋巴瘤中5例中有4例端粒酶阳性，1例平滑肌瘤亦为阳性，6例瘤(癌)旁组织中，端粒酶2例阳性，余均为阴性.
结论 端粒酶不仅在胃肠道粘膜下恶性肿瘤表达，而且在胃肠道粘膜下良性肿瘤中亦可有阳性表达.
0 引言
正常人体细胞端粒逐渐缩短将使细胞退出细胞周期而衰老死亡. 永生细胞或恶性细胞由于其端粒酶激活，端粒长度不再继续缩短而维持一种动态平衡状态，因此这些细胞可以无限制地有丝分裂下去，由此导致肿瘤的发生. 有关胃癌端粒酶活性检测国外仅见个别报道，但胃粘膜下肿瘤端粒酶的表达，国内外均未见研究. 本文对6例胃肠道粘膜下肿瘤的端粒酶活性进行检测，藉以探讨端粒酶在这些肿瘤中表达.
1 材料和方法
1.1 材料 胃肠道粘膜下恶性淋巴瘤5例及胃粘膜下平滑肌瘤1例，均来自本院1995-01/1996-12的手术切除标本. 手术切下肿瘤后，立即收集肿瘤及癌旁组织(距肿瘤边缘2cm)，剔除出血及坏死组织后-80℃贮存备用，所有病例均经病理证实. 每例标本各取50mg～100mg，置经DEPC处理的试管中，用冰缓冲液200μL洗涤[10mmol/L HEPES-KOH(pH 7.5， Merk公司)，1.5mmol/L MgCl2, 10mmol/L，KCl， 1mmol/L DTT (Promega公司)]. 然后用眼科剪将组织剪碎，加冷裂解液200μL [0.5% CHAPS (Boehringer Mannheim), 10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L MgCl2, 1mmol/L EGTA(Boehringer Mannheim), 100mL/L甘油，5mmol/L β-巯基乙醇，0.1mmol/L AEBSF (Boehringer Mannheim)]，混匀后冰上孵育30min，收集上清，紫外分光光度计(Beckman公司)测定蛋白质及核酸浓度，-80℃冻存.
, 百拇医药
1.2 方法 采用Kim et al报告的TRAP(telomere repeat amplification protocol)法略加改进[3]. 简述如下： 按核酸定量取1μg提取物，加反应液[含20mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，1.5mmol/L MgCl2， 63mmol/L KCl， 0.05mL/L Tween-20, 1mmol/L EGTA, dNTP各150mmol/L，32P dCTP和32PdATP 各 37mBq, 0.03μg TS引物(5＇-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3＇)，0.2μg T4g 32蛋白(Boehringer Mannheim)]加去离子水至8.5μL，室温下反应30min，以完成端粒酶介导的TS延伸反应. 然后加CX引物(5＇-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3＇)，混匀后90℃作用90s，以灭活端粒酶活性，然后于PCR循环仪(Perkin Elmer Cetus, 2400)进行扩增反应，循环参数为93℃ 40s、48℃ 40s、72℃ 60s，循环38次，最后72℃继续反应10min. 每次以已知端粒酶阳性组织作为阳性对照，以RNA酶消化过的组织作为阴性对照. 对于癌组织，取1μg提取物用裂解液按1∶10及1∶100分别稀释后重复上述反应. 取10μL PCR产物100g/L非变性聚丙烯凝胶电泳，干燥后医用X光片放射自显影24h～36h.
, 百拇医药
2 结果
TRAP阳性产物经放射自显影后可见间隔6bp的梯形信号(图1). 恶性淋巴瘤5例中有4例端粒酶阳性，1例胃平滑肌瘤端粒酶亦为阳性(表1). 瘤旁组织中，端粒酶2例阳性，其余均为阴性.
图1 端粒酶在胃肠道粘膜下肿瘤中的表达.
注：1，2，4，5为淋巴瘤，3为平滑肌瘤(弱阳性)
表1 胃肠道粘膜下肿瘤端粒酶表达与临床病理的关系
号
性别
年龄
, 百拇医药
肿瘤部位
大小(cm)
浸润深度
淋巴结转移
诊断
端粒酶活性
癌旁
×1
×10
×100
1
男
60
, 百拇医药
胃窦
2×2
粘膜下
+
淋巴瘤
+
+
-
-
2
女
42
胃窦
3×2
, 百拇医药
深肌层
-
淋巴瘤
+
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+
3
男
56
直肠
4×3
浆膜
+
, 百拇医药
淋巴瘤
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4
男
31
胃体
6×6
浆膜
-
淋巴瘤
+
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+
-
-
5
男
46
结肠
1cm多发
肌层
+
淋巴瘤
+
+
-
, 百拇医药
+
6
男
74
胃体
7×5
平滑肌瘤
+
-
3 讨论
端粒是真核生物染色体末端一种由许多简单重复序列及其相关的蛋白质组成的复合体，具有防止染色体结构的完整性及解决末端复制难题(end replication problem)的作用[1]. 端粒酶本质上是一种逆转录酶，由RNA和蛋白质组成，它以自身RNA为模板，合成端粒重复序列，使端粒延伸并维持一定长度. 除生殖细胞和少数造血细胞外，正常体细胞的端粒酶均处于失活状态，因此，正常体细胞染色体的端粒是随着有丝分裂次数的增加而逐渐缩短，当端粒短至一定程度时，细胞停止分裂，进入衰老期. 永生细胞(immortal cell)和癌细胞由于端粒酶活化，端粒不再继续缩短而维持一种动态平衡状态，细胞可以无限制地分裂繁殖下去[2].
, http://www.100md.com
端粒酶活化可见于多种肿瘤[3-5]. Hiyama et al[4]检测胃癌组织66例，有56例(85%)检出端粒酶活性，端粒酶阳性率在晚期胃癌明显高于早期胃癌，在淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组，提示检测端粒酶活性不仅可检出临床标本中永生细胞而诊断肿瘤，而且对预后的估计亦有意义. 我们采用TRAP及梯度稀释法检测了胃恶性淋巴瘤5例，发现端粒酶阳性4例，阴性1例，提示端粒酶活化可能是导致胃恶性淋巴瘤发生的重要原因，其实际临床意义需进一步研究. 本组4例端粒酶阳性的恶性淋巴瘤，有2例不但肿瘤组织端粒酶阳性，且肿瘤旁组织端粒酶亦为阳性，其原因一要考虑肿瘤旁的肿瘤细胞浸润，亦可能与局部有大量淋巴细胞浸润有关. 有作者报告，外周血淋巴细胞和骨髓造血组织可检测到低活性的端粒酶[6].
文献报告良性肿瘤的端粒酶表达多为阴性[3]. 我们检测了胃平滑肌肿瘤1例，其端粒酶为阳性. 作者曾对本院42例平滑肌肿瘤进行分析，发现直径>5cm者多为肉瘤，而<5cm者多为良性平滑肌瘤[7]. 本组1例平滑肌瘤体积较大，最大径为7cm，其端粒酶阳性可能反映了此病有潜在的恶变性质. 因此，检测胃平滑肌瘤端粒酶活性对监测平滑肌瘤的恶性变可能具有重要意义.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Zakian VA. Telomeres: beginning to understand the end. Science, 1995;270(5242):1601-1607
2 de Lange T. Activation of telomerase in a human tumor. Proc Natl Acad Sci USA, 1994;91(8):2882-2885
3 Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Prowse KR, Harley CB, West MD et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994;266(5193):2011-2015
, 百拇医药
4 Hiyama E, Okoyama T, Tatsumoto N, Hiyama K, Imamura Y, Murakami Y et al. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res, 1995;55(15):3258-3262
5 Hiyama E, Gollahon L, Kataoka T, Kuroi K, Yokoyama T, Gazdar AF et al. Telomerase activity in human breast tumors. J Natl Cancer Ins, 1996;88(2):116-122
6 Counter CM, Gupta J, Harley CB, Leber B, Bacchetti S. Telomerase activity in normal leukocytes and in hematologic malignancies. Blood, 1995;85(9):2315-2320
7 房殿春，刘为纹，王源敏. 胃平滑肌肿瘤的临床诊断与治疗. 中华内科杂志，1987；26(5)：260-262, 百拇医药