空肠弯曲菌基因诊断与分型方法的研究进展
作者：杨湘越
单位：
关键词：弯曲杆菌，空肠/遗传学；弯曲杆菌，空肠/分离和提纯；弯曲杆菌，空肠/分类；基因，细菌
空肠弯曲菌基因诊断与分型方法的研究进展 杨湘越 Subject headings campylobacter jejuni
Subject headings campylobacter jejuni/genetics; campylobacter jejuni/classification; campylobacter jejuni/isolation and purification; genes, bacterial
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni以下简称空弯菌)是引起散发性细菌性肠炎最常见的病原体之一. 该菌广泛存在于家禽类动物的肠道中，污染水源或食物后可引起腹泻的暴发流行，该菌还与人的急性感染性多发性神经根神经病，即格林巴利综合征(Guillain-Barre sydrome; GBS)有关. 为了便于进行临床诊断，流行病学调查研究及医院感染监测控制，微生物的诊断与分型技术是必不可少的工具. 传统的诊断方法是分离培养及生化反应，苛刻而费时，且敏感性和特异性不高；而传统的表型分型方法，如血清分型、生物分型、抗生素敏感性分型、噬菌体分型等，其可靠性和重复性不佳，分型率及分辨力不高. 由于分子生物学技术的迅猛发展，现代的基因诊断与分型方法因其敏感性、特异性、分型率和分辨力极高.且操作简便快速而备受重视. 我们就近年来国外在空弯菌基因诊断与分型方法上的研究状况作一综述.
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1 空弯菌的基因诊断方法
包括核酸探针杂交法[1-3]和靶基因PCR扩增法. 后者的敏感性和特异性高于前者. 在研究工作中受到重视. 已被选用的靶基因有16SrRNA基因(16SrDNA)、23SrRNA基因(23SrDNA)、鞭毛蛋白基因(flaA或flaB)、含铁细胞转运相关蛋白基因(ceuE)等 Docherty et al[4]针对16SrDNA的可变区设计了一对引物，扩增一个410?bp片段. 用磁免疫PCR法(MIPA)，即将特异性抗体 包被在磁性颗粒上以捕获进行增菌培养的食品样本中的靶细菌并用吸磁浓缩器回收、洗涤、裂解，取上清液进行PCR反应. 该法能检测出鸡和牛奶中的空弯菌、大肠弯曲菌(C. coli)和海鸥弯曲菌(C. lari)，比直接PCR法更敏感、快速且能克服食品和增菌肉汤中的抑制因子，其敏感性随增菌培养时间而升高，最高可达6.3?cfu/?mL(牛奶)和4.2?cfu/?g(鸡). Oyofo et al[5]. 根据大肠弯曲菌VC167株的flaA基因保守的5＇区序列设计了一对引物，扩增450?bp片段. 该PCR法能特异地检出47株空弯菌和4株大肠弯曲菌，Southern杂交的灵敏度为0.0062?pg/?纯化大肠弯曲菌DNA或相当于4个菌细胞的DNA量. 由于以16SrDNA, 23SrDNA[6]及flaA为靶基因的PCR法对亲缘关系密切的弯曲菌种的鉴别能力有限，尤其是不能较好地鉴别人类肠道主要致病性弯曲菌——空弯菌和大肠弯曲菌，这两种菌在疾病谱、诊断及流行病学意义方面都是不同的，而常规的马尿酸水解鉴别试验并不总是可靠，因此，需要建立一种基因鉴别方法. Gonzalez et al[7]在比较了空弯菌(987?bp)和大肠弯曲菌(984?bp)的ceuE基因序列后，发现其同源性为86.9%，差异性为13.1%，根据其差异性设计了两对种特异的引物和探针，能分别检出空弯菌和大肠弯曲菌，并经探针杂交加以证实. 而其他弯曲菌和选择的G-菌均不能检出. 该法简单、可靠，解决了亲缘关系很近的空弯菌和大肠弯曲菌的鉴别诊断问题.
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2 空弯菌的基因分型方法
2.1 以核糖体rDNA分型
2.1.1 16SrDNA分型 Fitzgerald et al[8]将261株空弯菌的纯化DNA用PstⅠ和HaeⅢ酶切后Southern blot杂交，探针是NCTC11168空弯菌的16SrDNA内的1500?bp片段，经PCR扩增、标记后获得. 结果表明，所有被测菌株均能分型(包括一些血清学未能分型的菌株)，有30个P型和42个H型(每型含3条带)及77个联合型(P型+H型)，除两株外，16SrDNA型和血清型之间没有特定的联系，有9个血清型的rDNA型一致，为同型菌. 作者还进行了一组大肠弯曲菌的平行研究，发现其与空弯菌的16SrDNA型完全不同. Owen et al[9]也做了类似的工作. 由于弯曲菌血清分型的主要缺点是受某些分型抗原表达的不稳定性影响及存在不能分型株(>20%)，所以建立基因分型方法十分必要. 16SrDNA分型完全且能鉴别空弯菌与大肠弯曲菌，而血清分型尚不能做到，如果增加内切酶，联合多种内切酶谱分析，其分辨力还可进一步提高.
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2.1.2 16S加23SrDNA分型 Hernandez et al[10]从海上娱乐场的海水中分离出32株弯曲菌(空弯菌3，大肠弯曲菌29)，另加7株弯曲菌标准参考菌，内切酶为HaeⅢ，生物素标记的探针由大肠埃希菌的16S加23SrRNA的混合物经莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶转录的CDNA制成. 结果获得了32个不同的rDNA型，每型含3～11个片段，表明这些菌株的基因型间存在着高度的变异性，且空弯菌与大肠弯曲菌也能区分.
2.1.3 23SrDNA分型 Iriarte et al[11]提取47株空弯菌的DNA后，加入两种特异引物PCR扩增23SrDNA内(5＇-末端)的2646?bp片段(代表该基因50%的多态性)，分别用HpaⅡ，AluⅠ和DdeⅠ三种内切酶消化，依次得到5个(A～E)、6个(Ⅰ～Ⅵ)和3个(a～c)PCR-RFLP谱型及7个联合型. 大多数菌株(39/?47,83%)为A-Ⅰ-a型， 分离自不同的人或动物及分属不同的血清型. 相对而言，23SrDNA较保守，其株内分辨力不高，可作为种特异的PCR方法使用. 在将来的研究中，若从空弯菌23SrDNA的3＇-末端扩增并选用更多的内切酶，可望提供有关该基因多态性的更多信息.
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2.2 以鞭毛蛋白基因(flaA/?flaB)分型 Nachamkin et al[12]建立了针对空弯菌和大肠弯曲菌flaA的PCR-RFLP分型方法. 322株空弯菌和82株大肠弯曲菌提取DNA后，加入特异引物PCR扩增，产物经DdeⅠ酶切后电泳、染色、紫外灯下拍片，图谱数据用软件程序Pro-RFLPMacintosh. 2.0版处理，结果显示存在83个flaA型，其中空弯菌67个型，大肠弯曲菌17个型，只有1个型(flaA59)存在于两种菌中，有6个型常见，基本弄清了flaA型在美国的分布情况. 有14株血清不能分型的菌株可以用flaA分型，其分型能力不受限制. Mohran et al[13]进一步做了flaA和flaB的PCR-RFLP分型，内切酶分别是EcoRⅠ和PstⅠ，对59株临床分离的埃及空弯菌和(或)大肠弯曲菌的分型结果是：存在14个flaA型和11个flaB型，虽然有一些变异性，但大多菌株的flaA型与flaB型是相同的，也有的同一组LIO血清型间存在着较大的遗传变异性，结果还提示从埃及分离的常见LIO血清组的鞭毛蛋白基因比北美分离的变异性更大.
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2.3 以胞核DNA分型
2.3.1 DNA指纹法 即RFLP法. Lind et al[14]为了找到能显示最佳DNA指纹谱型的内切酶，试用了7种酶，最后确定了HaeⅢ，对3次空弯菌暴发流行的检测结果如下：在挪威的一次水型暴发分离株(11株)中只发现了一个血清型和一个DNA谱型； 在瑞典的一次牛奶型暴发分离株(35株)中发现了两个血清型和两个DNA谱型； 而同在瑞典的一次水型暴发分离株(17株)中发现多个血清型和多个DNA谱型，其中有的血清型不同而DNA谱型相同，有的血清型相同而DNA谱型不同. 与血清分型这个流行病学常用的工具相比，DNA指纹法可以更好地满足需要，但其株内分型能力稍嫌不足.
2.3.2 随机扩增多态性DNA(RAPD) 也叫AP-PCR(arbitrarily primer PCR)，是一种新的DNA多态性分析技术，1990年由Welsh et al[15]建立，随后在不同的病原微生物分型中得到应用. 其最大的优点在于无需预先知道有关基因序列的信息，采用随机选择的单一引物(含9个以上碱基，G+C含量≥60%)，通过PCR其扩增产物即能产生特异性的谱型. RAPD指纹图谱条带的数目、强度及重复性，高度依赖于特定的反应条件，如盐浓度、随机引物的长度、序列及退火温度、模板浓度等. Hernandez et al[10]在35株空弯菌中发现了28个RAPD谱型，其中有6株菌未能分型，可能是由于纯化DNA后的DNA酶活性或其他原因损害了模板. 作者认为RAPD的分辨力高于核糖体rDNA分型. Madden et al[16]对76株临床分离的空弯菌用RAPD100%能分型，且大多数菌株具有独特的RAPD谱型，说明空弯菌的株内变异性是很大的，而从一次有限的食物中毒分离的15株空弯菌的RAPD谱型则完全一致，证明是同一株菌引起的. RAPD法简单、快速、株内分辨力极高、有着广阔的应用前景.
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2.3.3 脉冲场凝胶电泳(PFGE) 1984年Schwartz et al[17]创立了一种在脉冲(宽度1?s～90?s)电泳条件下分离大分子DNA片段(30?kb～2000?kb)的分型技术，其特点是分离片段大，谱型简单清晰而稳定，分辨力很高. Yan et al[18]将12株空弯菌和10株大肠弯曲菌的DNA提取后用SamⅠ酶切，在恒温12℃，75?V，电泳24?h，脉冲宽度12?s或20?s，结果两种菌显示了明显种特异及种内差异(株特异)的谱型. 有两株原先认为是来自同一个患者的一对同源空弯菌却显示了不同的独特谱型；一次牛奶型弯曲菌肠炎暴发流行中同时从奶牛身上分离的两株空弯菌与从牛奶中分离的一株空弯菌的谱型也不同，说明传染源不是来自奶牛. Owen et al[9]分析了170株空弯菌后也证明PFGE具有高分辨的基因亚型分型能力.
3 小结
基因诊断与分型技术问世以来，在不长的时间内发展很快并奠定了它在微生物诊断与分型技术中的重要而不可替代的地位. ①空弯菌的基因诊断方法非常敏感特异，容易出现假阳性和假阴性结果，应适当结合传统方法加以排除. 由于弯曲菌属种类多，同源性高，许多基因诊断方法针对空弯菌的特异性不高，尤其是不易与大肠弯曲菌区别，但针对ceuE基因的PCR法较好地解决了这个问题，值得推荐. ②空弯菌的基因分型方法中以16S或16S加23SrDNA分型、flaA分型RAPD和PFGE的分型率和分辨力佳，能更好地满足流行病学调查的需要，其中RAPD和PFGE不需预先知道有关基因序列，也不需杂交，相对简单，易于操作，获取结果迅速，实用性强，有着更好的应用前景. 随着技术的日益完善和标准化. 基因诊断与分型方法将在空弯菌的临床检测及分子流行病学研究中发挥更大的作用.
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4 参考文献
1 Bustamante VH, Puente JL, Sanchez-Lopez F, Bobadilla M, Calva E. Identification of Campylobacter jejuni and C. coli using the rpoB gene and a cryptic DNA fragment from C. jejuni. Gene, 1995;165(1):1-8
2 Korolik V, Coloe PJ, Krishnapillai V. A specific DNA probe for the identification of Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol, 1988;134(2):521-529
3 Stucki U, Frey J Nicolet J, Burnens AP. Identification of Campylobacter jejuni on the basis of a species-specific gene that encodes a membrane Protein. J Clin Microbiol, 1995;33(4):855-859
, 百拇医药
4 Docherty L, Adams MR, Patel P, McFadden J. The magnetic immuno-polymerase chain reaction assay for the detection of Campylobacter in milk and poultry. Lett Appl Microbiol, 1996;22(3):288-292
5 Oyofo BA, Thornton SA, Burr DH, Trust TJ, Pavlovskis OR, Guerry P. Specific detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coliby using polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1992;30(10):2613-2619
6 Eyers M, Chapelle S, Camp GV, Goossens H, Watcher RD. Discrimination among thermophilic Campylobacter species by polymerase chain reaction amplification of 23SrRNA gene fragments. J Clin Microbiol, 1993;31(12):3340-3343
, http://www.100md.com
7 Gonzalez I, Grant KA, Richardson PT, Park SF, Collins MD. Specific ldentification of the enteropathogens Campylobacter jejuni and Campylobacter coli by using a PCR test based on the ceuE gene encoding a putative Virulence determinant. J Clin Microbiol, 1997;35(3):759-763
8 Fitzgerald C, Cwen RJ, Stanley J, Comprehensive ribotyping scheme for heat-stable serotypes of Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol, 1996;34(2):265-269
, 百拇医药 9 Owen RJ, Sutherland K, Fitzgerald C, Gibson J, Borman P, Stanley J, Molecular subtyping scheme for serotypes HS1 and HS4 of Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol, 1995;33(4):872-877
10 Hernandez J, Fayos A, Alonso JL, Owen RJ. Ribotypes and AP-PCR fingerprints of thermophilic Campylobacters from marine recreational waters. J Appl Bacteriol, 1996;80(2):157-164
11 Iriarte P, Owen RJ. PCR-RFLP analysis of the large subunit (23S)ribosomal RNA genes of Campylobacter jejuni. Lett Appl Microbiol, 1996;23(2):163-166
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12 Nachamkin I, Ung H, Patton CM. Analysis of HL and O serotypes of Campylobacter strains by the flagellin gene typing system. J Clin Microbiol, 1996;34(2):277-281
13 Mohran ZS, Guerry p, Lior H, Murphy JR, EL-gendy AM, Mikhail MM et al Restriction fragment length polymorphism of flagellin genes of Campylobacter jejuni and/?or C. coli isolates from Egypt. J Clin Microbiol, 1996;34(5):1216-1219
14 Lind L, Sjgren E, Melby K, Kaijser B. DNA fingerprinting and serotyping of Campylobacter jejuni isolates from epidemic outbreaks. J Clin Microbiol, 1996;34(4):892-896
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15 Welsh J, McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res, 1990;18(12):7213-7218
16 Madden RH, Moran L, Scates P. Sub-typing of animal and human Campylobacter spp. using RAPD. Lett Appl Microbiol, 1996;23(2):167-170
17 Schwartz DC, Cantor CR. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell, 1984;37(1):67-75
18 Yan W, Chang W, Taylor DE. Pulsed field gel electrophoresis of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli genomic DNA and its epidemiological application. J Infect Dis, 1991;163(5);1068-1072, http://www.100md.com
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关键词：弯曲杆菌，空肠/遗传学；弯曲杆菌，空肠/分离和提纯；弯曲杆菌，空肠/分类；基因，细菌
空肠弯曲菌基因诊断与分型方法的研究进展 杨湘越 Subject headings campylobacter jejuni
Subject headings campylobacter jejuni/genetics; campylobacter jejuni/classification; campylobacter jejuni/isolation and purification; genes, bacterial
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni以下简称空弯菌)是引起散发性细菌性肠炎最常见的病原体之一. 该菌广泛存在于家禽类动物的肠道中，污染水源或食物后可引起腹泻的暴发流行，该菌还与人的急性感染性多发性神经根神经病，即格林巴利综合征(Guillain-Barre sydrome; GBS)有关. 为了便于进行临床诊断，流行病学调查研究及医院感染监测控制，微生物的诊断与分型技术是必不可少的工具. 传统的诊断方法是分离培养及生化反应，苛刻而费时，且敏感性和特异性不高；而传统的表型分型方法，如血清分型、生物分型、抗生素敏感性分型、噬菌体分型等，其可靠性和重复性不佳，分型率及分辨力不高. 由于分子生物学技术的迅猛发展，现代的基因诊断与分型方法因其敏感性、特异性、分型率和分辨力极高.且操作简便快速而备受重视. 我们就近年来国外在空弯菌基因诊断与分型方法上的研究状况作一综述.
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1 空弯菌的基因诊断方法
包括核酸探针杂交法[1-3]和靶基因PCR扩增法. 后者的敏感性和特异性高于前者. 在研究工作中受到重视. 已被选用的靶基因有16SrRNA基因(16SrDNA)、23SrRNA基因(23SrDNA)、鞭毛蛋白基因(flaA或flaB)、含铁细胞转运相关蛋白基因(ceuE)等 Docherty et al[4]针对16SrDNA的可变区设计了一对引物，扩增一个410?bp片段. 用磁免疫PCR法(MIPA)，即将特异性抗体 包被在磁性颗粒上以捕获进行增菌培养的食品样本中的靶细菌并用吸磁浓缩器回收、洗涤、裂解，取上清液进行PCR反应. 该法能检测出鸡和牛奶中的空弯菌、大肠弯曲菌(C. coli)和海鸥弯曲菌(C. lari)，比直接PCR法更敏感、快速且能克服食品和增菌肉汤中的抑制因子，其敏感性随增菌培养时间而升高，最高可达6.3?cfu/?mL(牛奶)和4.2?cfu/?g(鸡). Oyofo et al[5]. 根据大肠弯曲菌VC167株的flaA基因保守的5＇区序列设计了一对引物，扩增450?bp片段. 该PCR法能特异地检出47株空弯菌和4株大肠弯曲菌，Southern杂交的灵敏度为0.0062?pg/?纯化大肠弯曲菌DNA或相当于4个菌细胞的DNA量. 由于以16SrDNA, 23SrDNA[6]及flaA为靶基因的PCR法对亲缘关系密切的弯曲菌种的鉴别能力有限，尤其是不能较好地鉴别人类肠道主要致病性弯曲菌——空弯菌和大肠弯曲菌，这两种菌在疾病谱、诊断及流行病学意义方面都是不同的，而常规的马尿酸水解鉴别试验并不总是可靠，因此，需要建立一种基因鉴别方法. Gonzalez et al[7]在比较了空弯菌(987?bp)和大肠弯曲菌(984?bp)的ceuE基因序列后，发现其同源性为86.9%，差异性为13.1%，根据其差异性设计了两对种特异的引物和探针，能分别检出空弯菌和大肠弯曲菌，并经探针杂交加以证实. 而其他弯曲菌和选择的G-菌均不能检出. 该法简单、可靠，解决了亲缘关系很近的空弯菌和大肠弯曲菌的鉴别诊断问题.
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2 空弯菌的基因分型方法
2.1 以核糖体rDNA分型
2.1.1 16SrDNA分型 Fitzgerald et al[8]将261株空弯菌的纯化DNA用PstⅠ和HaeⅢ酶切后Southern blot杂交，探针是NCTC11168空弯菌的16SrDNA内的1500?bp片段，经PCR扩增、标记后获得. 结果表明，所有被测菌株均能分型(包括一些血清学未能分型的菌株)，有30个P型和42个H型(每型含3条带)及77个联合型(P型+H型)，除两株外，16SrDNA型和血清型之间没有特定的联系，有9个血清型的rDNA型一致，为同型菌. 作者还进行了一组大肠弯曲菌的平行研究，发现其与空弯菌的16SrDNA型完全不同. Owen et al[9]也做了类似的工作. 由于弯曲菌血清分型的主要缺点是受某些分型抗原表达的不稳定性影响及存在不能分型株(>20%)，所以建立基因分型方法十分必要. 16SrDNA分型完全且能鉴别空弯菌与大肠弯曲菌，而血清分型尚不能做到，如果增加内切酶，联合多种内切酶谱分析，其分辨力还可进一步提高.
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2.1.2 16S加23SrDNA分型 Hernandez et al[10]从海上娱乐场的海水中分离出32株弯曲菌(空弯菌3，大肠弯曲菌29)，另加7株弯曲菌标准参考菌，内切酶为HaeⅢ，生物素标记的探针由大肠埃希菌的16S加23SrRNA的混合物经莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶转录的CDNA制成. 结果获得了32个不同的rDNA型，每型含3～11个片段，表明这些菌株的基因型间存在着高度的变异性，且空弯菌与大肠弯曲菌也能区分.
2.1.3 23SrDNA分型 Iriarte et al[11]提取47株空弯菌的DNA后，加入两种特异引物PCR扩增23SrDNA内(5＇-末端)的2646?bp片段(代表该基因50%的多态性)，分别用HpaⅡ，AluⅠ和DdeⅠ三种内切酶消化，依次得到5个(A～E)、6个(Ⅰ～Ⅵ)和3个(a～c)PCR-RFLP谱型及7个联合型. 大多数菌株(39/?47,83%)为A-Ⅰ-a型， 分离自不同的人或动物及分属不同的血清型. 相对而言，23SrDNA较保守，其株内分辨力不高，可作为种特异的PCR方法使用. 在将来的研究中，若从空弯菌23SrDNA的3＇-末端扩增并选用更多的内切酶，可望提供有关该基因多态性的更多信息.
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2.2 以鞭毛蛋白基因(flaA/?flaB)分型 Nachamkin et al[12]建立了针对空弯菌和大肠弯曲菌flaA的PCR-RFLP分型方法. 322株空弯菌和82株大肠弯曲菌提取DNA后，加入特异引物PCR扩增，产物经DdeⅠ酶切后电泳、染色、紫外灯下拍片，图谱数据用软件程序Pro-RFLPMacintosh. 2.0版处理，结果显示存在83个flaA型，其中空弯菌67个型，大肠弯曲菌17个型，只有1个型(flaA59)存在于两种菌中，有6个型常见，基本弄清了flaA型在美国的分布情况. 有14株血清不能分型的菌株可以用flaA分型，其分型能力不受限制. Mohran et al[13]进一步做了flaA和flaB的PCR-RFLP分型，内切酶分别是EcoRⅠ和PstⅠ，对59株临床分离的埃及空弯菌和(或)大肠弯曲菌的分型结果是：存在14个flaA型和11个flaB型，虽然有一些变异性，但大多菌株的flaA型与flaB型是相同的，也有的同一组LIO血清型间存在着较大的遗传变异性，结果还提示从埃及分离的常见LIO血清组的鞭毛蛋白基因比北美分离的变异性更大.
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2.3 以胞核DNA分型
2.3.1 DNA指纹法 即RFLP法. Lind et al[14]为了找到能显示最佳DNA指纹谱型的内切酶，试用了7种酶，最后确定了HaeⅢ，对3次空弯菌暴发流行的检测结果如下：在挪威的一次水型暴发分离株(11株)中只发现了一个血清型和一个DNA谱型； 在瑞典的一次牛奶型暴发分离株(35株)中发现了两个血清型和两个DNA谱型； 而同在瑞典的一次水型暴发分离株(17株)中发现多个血清型和多个DNA谱型，其中有的血清型不同而DNA谱型相同，有的血清型相同而DNA谱型不同. 与血清分型这个流行病学常用的工具相比，DNA指纹法可以更好地满足需要，但其株内分型能力稍嫌不足.
2.3.2 随机扩增多态性DNA(RAPD) 也叫AP-PCR(arbitrarily primer PCR)，是一种新的DNA多态性分析技术，1990年由Welsh et al[15]建立，随后在不同的病原微生物分型中得到应用. 其最大的优点在于无需预先知道有关基因序列的信息，采用随机选择的单一引物(含9个以上碱基，G+C含量≥60%)，通过PCR其扩增产物即能产生特异性的谱型. RAPD指纹图谱条带的数目、强度及重复性，高度依赖于特定的反应条件，如盐浓度、随机引物的长度、序列及退火温度、模板浓度等. Hernandez et al[10]在35株空弯菌中发现了28个RAPD谱型，其中有6株菌未能分型，可能是由于纯化DNA后的DNA酶活性或其他原因损害了模板. 作者认为RAPD的分辨力高于核糖体rDNA分型. Madden et al[16]对76株临床分离的空弯菌用RAPD100%能分型，且大多数菌株具有独特的RAPD谱型，说明空弯菌的株内变异性是很大的，而从一次有限的食物中毒分离的15株空弯菌的RAPD谱型则完全一致，证明是同一株菌引起的. RAPD法简单、快速、株内分辨力极高、有着广阔的应用前景.
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2.3.3 脉冲场凝胶电泳(PFGE) 1984年Schwartz et al[17]创立了一种在脉冲(宽度1?s～90?s)电泳条件下分离大分子DNA片段(30?kb～2000?kb)的分型技术，其特点是分离片段大，谱型简单清晰而稳定，分辨力很高. Yan et al[18]将12株空弯菌和10株大肠弯曲菌的DNA提取后用SamⅠ酶切，在恒温12℃，75?V，电泳24?h，脉冲宽度12?s或20?s，结果两种菌显示了明显种特异及种内差异(株特异)的谱型. 有两株原先认为是来自同一个患者的一对同源空弯菌却显示了不同的独特谱型；一次牛奶型弯曲菌肠炎暴发流行中同时从奶牛身上分离的两株空弯菌与从牛奶中分离的一株空弯菌的谱型也不同，说明传染源不是来自奶牛. Owen et al[9]分析了170株空弯菌后也证明PFGE具有高分辨的基因亚型分型能力.
3 小结
基因诊断与分型技术问世以来，在不长的时间内发展很快并奠定了它在微生物诊断与分型技术中的重要而不可替代的地位. ①空弯菌的基因诊断方法非常敏感特异，容易出现假阳性和假阴性结果，应适当结合传统方法加以排除. 由于弯曲菌属种类多，同源性高，许多基因诊断方法针对空弯菌的特异性不高，尤其是不易与大肠弯曲菌区别，但针对ceuE基因的PCR法较好地解决了这个问题，值得推荐. ②空弯菌的基因分型方法中以16S或16S加23SrDNA分型、flaA分型RAPD和PFGE的分型率和分辨力佳，能更好地满足流行病学调查的需要，其中RAPD和PFGE不需预先知道有关基因序列，也不需杂交，相对简单，易于操作，获取结果迅速，实用性强，有着更好的应用前景. 随着技术的日益完善和标准化. 基因诊断与分型方法将在空弯菌的临床检测及分子流行病学研究中发挥更大的作用.
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4 参考文献
1 Bustamante VH, Puente JL, Sanchez-Lopez F, Bobadilla M, Calva E. Identification of Campylobacter jejuni and C. coli using the rpoB gene and a cryptic DNA fragment from C. jejuni. Gene, 1995;165(1):1-8
2 Korolik V, Coloe PJ, Krishnapillai V. A specific DNA probe for the identification of Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol, 1988;134(2):521-529
3 Stucki U, Frey J Nicolet J, Burnens AP. Identification of Campylobacter jejuni on the basis of a species-specific gene that encodes a membrane Protein. J Clin Microbiol, 1995;33(4):855-859
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4 Docherty L, Adams MR, Patel P, McFadden J. The magnetic immuno-polymerase chain reaction assay for the detection of Campylobacter in milk and poultry. Lett Appl Microbiol, 1996;22(3):288-292
5 Oyofo BA, Thornton SA, Burr DH, Trust TJ, Pavlovskis OR, Guerry P. Specific detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coliby using polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1992;30(10):2613-2619
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