脂肪肝与肝纤维化关系的实验观察范建高
作者：曾民德 李继强 陆伦根 谢秀兰 李超群 彭延申 邱德凯
单位：200001上海第二医科大学仁济医院。上海市消化疾病研究所(第一作者现在上海市第一人民医院消化科工作。)
关键词：
中华医学杂志/981012 我们通过建立高脂饮食和(或)酒精、四氯化碳(CCL4)大鼠脂肪肝模型，观察致病因素及其作用时间、肝内脂肪、脂质过氧化物等与胶原蛋白及其主要产生细胞-活化的肝星状细胞(Ito细胞)数量之间的关系,旨在阐明脂肪肝与肝纤维化的关系及其可能机制。
一、材料与方法
1.动物模型的建立：雄性Wistar大鼠40只，随机分为4组。正常组普通饲料喂养；高脂饮食组高脂饲料(普通饲料基础上加1%胆固醇、5%猪油、10%玉米油)喂养;低脂酒精组和高脂酒精组分别为普通饲料或高脂饲料加酒精(60%酒精1.5 ml/100 g体重灌胃,2次/日)喂养。于实验后3个月、6个月每组分别处死2只和8只动物。另有9只大鼠予高脂饲料喂养加40%CCL4中性茶油溶液皮下注射(CCL4组),首剂0.5ml/100g体重,以后0.2ml/100g体重,2次/周,6周后全部处死。常规制备肝匀浆和肝组织石蜡切片及超薄切片。
, http://www.100md.com
2.肝匀浆生化测定：酶法测定肝匀浆甘油三酯(TG)代表肝内脂肪含量，氯胺T法测定羟脯氨酸(HYP)代表肝内胶原蛋白含量，TBA法测定丙二醛(MDA)代表肝内脂质过氧化物含量。
3.病理学检查：肝组织石蜡切片HE染色和van Giesson染色，分别观察脂肪肝和肝纤维化程度。免疫组化ABC染色，以兔抗人溶菌酶(LZ)多抗标记Kupffer细胞,以鼠抗人Desmin(Dm)单抗和α平滑肌肌动蛋白(SMA)单抗分别标记Ito细胞及活化的Ito细胞,取3个阳性最密集的高倍视野计数阳性细胞数，并求其平均值。超薄切片采用透射电镜观察肝脏超微结构。
4.统计学处理：各组间比较采用两样本均数的t检验，各指标间两因素的相关分析以r值表示。
二、结果
1.肝脏病理学变化：至造模结束时，各组动物中仅CCL4组死亡2只大鼠。光镜和电镜显示，正常组肝脏形态学基本正常；高脂饮食组在造模3个月时出现轻度脂肪肝，6个月时脂肪肝进展为中度，免疫组化染色结果与正常组相似。两酒精组在造模3个月时仅出现脂肪肝，6个月时脂肪肝程度加剧,伴中央静脉周围和窦周纤维化,高脂酒精组此变化尤为显著，部分标本伴点片状肝细胞坏死及局部炎细胞浸润；低脂酒精组在造模6个月、高脂酒精组在造模3个月时，Dm、SMA阳性细胞数轻度增多，LZ阳性细胞数基本正常，高脂酒精组在造模6个月时Dm、SMA和LZ阳性细胞数中度增多。CCL4组造模6周即出现严重的肝纤维化，而脂肪肝程度轻重不一，Dm、SMA阳性细胞数显著增多，LZ阳性细胞中度增多。
, 百拇医药
2.肝匀浆TG、HYP、MDA含量变化：高脂饮食和(或)酒精组6个月时及CCL4组6周时，肝匀浆TG、HYP、MDA含量测定结果见表1。与正常组相比，高脂饮食组TG，低脂酒精组、高脂酒精组及CCL4组的TG、HYP、MDA含量均显著增高。高脂酒精组各指标均显著高于低脂酒精组；CCL4组HYP和MDA又显著高于高脂酒精组。
3.肝匀浆TG、MDA及肝组织LZ阳性细胞数分别与HYP含量和SMA阳性细胞数之间的相关分析：各组肝内TG含量与SMA阳性细胞数间均无显著相关；肝内TG含量与HYP含量间仅在低脂酒精组存在正相关(r=0.7966)。各组肝MDA含量与其相应HYP含量及SMA阳性细胞数间均呈正相关(表2)。各组肝组织切片LZ阳性细胞数与SMA阳性细胞数及HYP含量间均无显著相关。
表1 肝匀浆TG、HYP和MDA含量 变化(
±s) 组别
, 百拇医药
鼠数
TG
(mg/g)
HYP
(μg/g)
MDA
(μmol/g)
正常
饮食组
8
19
± 5
31
, 百拇医药
± 4
5.60
±0.32
高脂
饮食组
8
57
± 6
36
± 6
5.90
±0.27
低脂
, 百拇医药
酒精组
8
41
± 9
51
± 8
7.10
±0.38
高脂
酒精组
8
80
± 6
, 百拇医药 96
±10
8.90
±0.31
四氯
化碳组
7
67
±15
178
± 24
10.80
±0.21
, 百拇医药
注：TG：甘油三脂，HYP：羟脯氨酸，MDA：丙二醛，表2同表2 各组内肝MDA与HYP、SMA
阳性细胞数的关系(r值) 组别
鼠数
MDA与
HYP
MDA与
α-SMA
高脂饮食组
8
0.5683
0.4974
低脂酒精组
, http://www.100md.com
8
0.8272
0.7831
高脂酒精组
8
0.7423
0.8073
四氯化碳组
7
0.7744
0.7651
注：α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白
三、讨论
, 百拇医药
本研究通过4种不同的脂肪肝模型病理研究发现，单纯高脂饮食组尽管其脂肪肝程度重于低脂酒精组，但肝内并无胶原纤维沉积，肝胶原蛋白含量基本正常，提示脂肪肝是否合并肝纤维化可能与其病因有关。酒精肝病组即使高脂饮食，造模3个月时也只出现脂肪肝，至6个月时才并存肝纤维化，但尚未发展为肝硬化；而CCL4组造模6周即有脂肪肝和肝纤维化，部分大鼠发生肝硬化，表明致病因素是否导致脂肪肝和肝纤维化、肝硬化主要与其强度及作用时间有关[1]。本研究中各组动物肝脏脂肪含量与SMA阳性细胞数之间均无相关性，肝脏脂肪含量与胶原含量间仅在低脂酒精组存在一定相关性，提示肝内脂肪本身与Ito细胞激活及肝纤维化形成间并无直接联系。在酒精和CCL4性肝损伤中，脂肪肝与肝纤维化可能是同一病因的两种不同的病理学改变。本研究中尽管高脂酒精组和低脂酒精组大鼠每日酒精摄入量相同，但前者肝内脂肪和胶原含量显著高于后者，提示高脂饮食通过增加肝内脂肪含量促进肝纤维化形成[1，2]。本研究还发现,高脂酒精组在肝内脂肪增加的同时，伴MDA含量显著增加。无论低脂酒精组还是高脂酒精组或CCL4组，肝内MDA含量均与活化的Ito细胞数及胶原蛋白含量间呈正相关，提示脂质过氧化反应与酒精、CCL性肝损伤时Ito细胞的激活密切相关，肝内脂肪可能通过加强脂质过氧化反应促进酒精、CCL4等肝纤维化的发生[2，3]。肝组织切片LZ阳性细胞数与活化的Ito细胞数及肝胶原含量间无显著相关性，提示炎症对酒精和CCL4性肝纤维化Ito细胞的激活并非必须。
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本课题为国家自然科学基金资助项目(No:39670339)
参考文献
1 范建高，李继强，曾民德.脂肪肝与肝纤维化的关系及其机制.国外医学消化分册，1997，17：92-95.
2 Tsukamoto H, Matsuoka M, French S. Experimental models of hepatic fibrosis: a review. Sem Liver Dis, 1990, 10：56-65.
3 Tsukamoto H, Rippe R, Niemela O, et al. Roles of oxidative stress in activation of Kupffer and Ito cells in liver fibrogenesis. J Gastroenterol Hepatol, 1995, 10：S50-S53.
(收稿：1997-06-27 修回：1998-07-06), 百拇医药
单位：200001上海第二医科大学仁济医院。上海市消化疾病研究所(第一作者现在上海市第一人民医院消化科工作。)
关键词：
中华医学杂志/981012 我们通过建立高脂饮食和(或)酒精、四氯化碳(CCL4)大鼠脂肪肝模型，观察致病因素及其作用时间、肝内脂肪、脂质过氧化物等与胶原蛋白及其主要产生细胞-活化的肝星状细胞(Ito细胞)数量之间的关系,旨在阐明脂肪肝与肝纤维化的关系及其可能机制。
一、材料与方法
1.动物模型的建立：雄性Wistar大鼠40只，随机分为4组。正常组普通饲料喂养；高脂饮食组高脂饲料(普通饲料基础上加1%胆固醇、5%猪油、10%玉米油)喂养;低脂酒精组和高脂酒精组分别为普通饲料或高脂饲料加酒精(60%酒精1.5 ml/100 g体重灌胃,2次/日)喂养。于实验后3个月、6个月每组分别处死2只和8只动物。另有9只大鼠予高脂饲料喂养加40%CCL4中性茶油溶液皮下注射(CCL4组),首剂0.5ml/100g体重,以后0.2ml/100g体重,2次/周,6周后全部处死。常规制备肝匀浆和肝组织石蜡切片及超薄切片。
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2.肝匀浆生化测定：酶法测定肝匀浆甘油三酯(TG)代表肝内脂肪含量，氯胺T法测定羟脯氨酸(HYP)代表肝内胶原蛋白含量，TBA法测定丙二醛(MDA)代表肝内脂质过氧化物含量。
3.病理学检查：肝组织石蜡切片HE染色和van Giesson染色，分别观察脂肪肝和肝纤维化程度。免疫组化ABC染色，以兔抗人溶菌酶(LZ)多抗标记Kupffer细胞,以鼠抗人Desmin(Dm)单抗和α平滑肌肌动蛋白(SMA)单抗分别标记Ito细胞及活化的Ito细胞,取3个阳性最密集的高倍视野计数阳性细胞数，并求其平均值。超薄切片采用透射电镜观察肝脏超微结构。
4.统计学处理：各组间比较采用两样本均数的t检验，各指标间两因素的相关分析以r值表示。
二、结果
1.肝脏病理学变化：至造模结束时，各组动物中仅CCL4组死亡2只大鼠。光镜和电镜显示，正常组肝脏形态学基本正常；高脂饮食组在造模3个月时出现轻度脂肪肝，6个月时脂肪肝进展为中度，免疫组化染色结果与正常组相似。两酒精组在造模3个月时仅出现脂肪肝，6个月时脂肪肝程度加剧,伴中央静脉周围和窦周纤维化,高脂酒精组此变化尤为显著，部分标本伴点片状肝细胞坏死及局部炎细胞浸润；低脂酒精组在造模6个月、高脂酒精组在造模3个月时，Dm、SMA阳性细胞数轻度增多，LZ阳性细胞数基本正常，高脂酒精组在造模6个月时Dm、SMA和LZ阳性细胞数中度增多。CCL4组造模6周即出现严重的肝纤维化，而脂肪肝程度轻重不一，Dm、SMA阳性细胞数显著增多，LZ阳性细胞中度增多。
, 百拇医药
2.肝匀浆TG、HYP、MDA含量变化：高脂饮食和(或)酒精组6个月时及CCL4组6周时，肝匀浆TG、HYP、MDA含量测定结果见表1。与正常组相比，高脂饮食组TG，低脂酒精组、高脂酒精组及CCL4组的TG、HYP、MDA含量均显著增高。高脂酒精组各指标均显著高于低脂酒精组；CCL4组HYP和MDA又显著高于高脂酒精组。
3.肝匀浆TG、MDA及肝组织LZ阳性细胞数分别与HYP含量和SMA阳性细胞数之间的相关分析：各组肝内TG含量与SMA阳性细胞数间均无显著相关；肝内TG含量与HYP含量间仅在低脂酒精组存在正相关(r=0.7966)。各组肝MDA含量与其相应HYP含量及SMA阳性细胞数间均呈正相关(表2)。各组肝组织切片LZ阳性细胞数与SMA阳性细胞数及HYP含量间均无显著相关。
表1 肝匀浆TG、HYP和MDA含量 变化(
±s) 组别, 百拇医药
鼠数
TG
(mg/g)
HYP
(μg/g)
MDA
(μmol/g)
正常
饮食组
8
19
± 5
31
, 百拇医药
± 4
5.60
±0.32
高脂
饮食组
8
57
± 6
36
± 6
5.90
±0.27
低脂
, 百拇医药
酒精组
8
41
± 9
51
± 8
7.10
±0.38
高脂
酒精组
8
80
± 6
, 百拇医药 96
±10
8.90
±0.31
四氯
化碳组
7
67
±15
178
± 24
10.80
±0.21
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注：TG：甘油三脂，HYP：羟脯氨酸，MDA：丙二醛，表2同表2 各组内肝MDA与HYP、SMA
阳性细胞数的关系(r值) 组别
鼠数
MDA与
HYP
MDA与
α-SMA
高脂饮食组
8
0.5683
0.4974
低脂酒精组
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8
0.8272
0.7831
高脂酒精组
8
0.7423
0.8073
四氯化碳组
7
0.7744
0.7651
注：α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白
三、讨论
, 百拇医药
本研究通过4种不同的脂肪肝模型病理研究发现，单纯高脂饮食组尽管其脂肪肝程度重于低脂酒精组，但肝内并无胶原纤维沉积，肝胶原蛋白含量基本正常，提示脂肪肝是否合并肝纤维化可能与其病因有关。酒精肝病组即使高脂饮食，造模3个月时也只出现脂肪肝，至6个月时才并存肝纤维化，但尚未发展为肝硬化；而CCL4组造模6周即有脂肪肝和肝纤维化，部分大鼠发生肝硬化，表明致病因素是否导致脂肪肝和肝纤维化、肝硬化主要与其强度及作用时间有关[1]。本研究中各组动物肝脏脂肪含量与SMA阳性细胞数之间均无相关性，肝脏脂肪含量与胶原含量间仅在低脂酒精组存在一定相关性，提示肝内脂肪本身与Ito细胞激活及肝纤维化形成间并无直接联系。在酒精和CCL4性肝损伤中，脂肪肝与肝纤维化可能是同一病因的两种不同的病理学改变。本研究中尽管高脂酒精组和低脂酒精组大鼠每日酒精摄入量相同，但前者肝内脂肪和胶原含量显著高于后者，提示高脂饮食通过增加肝内脂肪含量促进肝纤维化形成[1，2]。本研究还发现,高脂酒精组在肝内脂肪增加的同时，伴MDA含量显著增加。无论低脂酒精组还是高脂酒精组或CCL4组，肝内MDA含量均与活化的Ito细胞数及胶原蛋白含量间呈正相关，提示脂质过氧化反应与酒精、CCL性肝损伤时Ito细胞的激活密切相关，肝内脂肪可能通过加强脂质过氧化反应促进酒精、CCL4等肝纤维化的发生[2，3]。肝组织切片LZ阳性细胞数与活化的Ito细胞数及肝胶原含量间无显著相关性，提示炎症对酒精和CCL4性肝纤维化Ito细胞的激活并非必须。
, http://www.100md.com
本课题为国家自然科学基金资助项目(No:39670339)
参考文献
1 范建高，李继强，曾民德.脂肪肝与肝纤维化的关系及其机制.国外医学消化分册，1997，17：92-95.
2 Tsukamoto H, Matsuoka M, French S. Experimental models of hepatic fibrosis: a review. Sem Liver Dis, 1990, 10：56-65.
3 Tsukamoto H, Rippe R, Niemela O, et al. Roles of oxidative stress in activation of Kupffer and Ito cells in liver fibrogenesis. J Gastroenterol Hepatol, 1995, 10：S50-S53.
(收稿：1997-06-27 修回：1998-07-06), 百拇医药