血管内皮生长因子基因防治兔髂动脉狭窄
作者：张曼 周爱儒 朱国英 陈光慧 叶正茂 汤健
单位：100083北京医科大学生化分子生物学系(张曼、周爱儒)北京医科大学第一医院心内科(朱国英)；北京医科大学心血管研究所(陈光慧、叶正茂、汤健)
关键词：内皮生长因子；基因疗法
中华医学杂志/981008 【摘要】 目的 从基因治疗方面探讨解决经皮血管成型术和其他血管再塑引起的血管内膜损伤，血管狭窄途径。方法 构建了pcDNA3/血管内皮生长因子(VEGF)真核表达载体，通过多聚赖氨酸基因球囊法，将VEGF基因定位导入球囊拉伤的兔髂动脉内壁，应用原位杂交，免疫组织化学，电磁血流量仪，扫描电镜和光镜等方法检测VEGF基因作用效果。结果 VEGF基因组球囊拉伤血管2周时内膜有大量VEGF mRNA和蛋白表达，内膜内皮化范围明显大于空载质粒对照组，内膜与中膜面积之比小于对照组，血流量明显改善。结论 血管内导入VEGF基因，可促进内皮细胞增生，加速损伤内膜的修复，抑制血管内膜平滑肌细胞的增生，防治血管狭窄。
, 百拇医药
Vascular endothelial growth gene therapy for narrowing of rabbit iliac artery
Zhang Man, Zhou Airu, Zhu Guoying, et al. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Beijing Medical University, Beijing 100083
【Abstract】 Objective To study the mechanism of renarrowing and vascular endothelial growth factor (VEGF) gene therapy to prevent the restenosis caused by balloon angioplasty. Methods According to the special function of VEGF that promepts the proliferation of endothelial cell (EC), we constituted an eukaryotic expression vector of pcDNA3/VEGF, and added the pcDNA3/VEGF to the surface of polylysine-balloon. We examined the results of the test by in situ blot, eletromagnetic blood flow mechine, scanning eletromicroscope, and light microscope. Results There was higher expression of VEGF mRNA and iliac artery intima in the VEGF gene group. The extent of endothelialization was larger, the ratio of intima to media (I/M) was smaller, and the blood flow was more sufficient than in the vector control group. Conclusion VEGF gene local delivery could stimulate the proliferation of EC, accelerate the endothelialization of injury-artery, and inhibite the proliferation of smooth muscle cell (SMC).
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【Key words】 Endothelial growth factor Gene therapy
(Natl Med J China, 1998, 78：749-752)
血管成型术(percutaneous transluminal angioplasty，PTA)6个月内有35%～45%的病人发生再狭窄[1]。目前对再狭窄尚无有效的防治方法，严重地限制了PTA的使用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一种血管内皮细胞特异性的促丝裂原。应用VEGF的特异丝裂原作用，促进损伤内皮的迅速增生，加速损伤内膜内皮化，进而抑制血管平滑肌细胞增殖，作为防治血管再狭窄的新策略。1996年美国FDA批准VEGF基因为应用于心血管临床的治疗基因[2]。本实验应用多聚赖氨酸基因球囊，将VEGF基因真核表达质粒转移致球囊拉伤血管内膜，观察血管内膜的增生和血流量情况，且对血管壁细胞的变化和血管内膜内皮化程度作了连续观察。以达到在内膜损伤早期防治血管再狭窄的目的。
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材料与方法
一、材料
1.pcDNA3/VEGF121的构建，质粒的提取、纯化及鉴定：将本室克隆的550 bp的人VEGF基因经BamH1和EcoR1酶切后重组在质粒PSK中形成PSK/VEGF121，再从PSK/VEGF121切取VEGF121 cDNA构建于pcDNA3真核表达质粒内(pcDNA3购自美国Invitrogen公司)，形成pcDNA3/VEGF121，其中目的基因可编码121个氨基酸的VEGF121，含有信号肽序列，其上游有巨细胞病毒启动子，下游有多聚腺苷酸尾。将pcDNA3/VEGF转化大肠杆菌(DH5)，扩增，减变性大量提取质粒，用聚乙二醇8 000纯化方法，A260/A280的比值在1.8以上，酶切鉴定[3]。
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2.基因球囊的制备：PTA导管球囊涂抹0.1%的多聚赖氨酸30 μl，反复吹干，再将pcDNA3空载体和pcDNA3/VEGF121各 300 μg(30 μl)。分别反复涂于球囊表面，吹干待用。上述过程均在无菌条件下进行。
二、方法
动物模型的制备及分组：健康家兔32只，雌雄不限，体重2.2～2.5 kg，仰位固定于手术台上，手术前常规处理，逐层2%盐酸利多卡因局部麻醉，沿股动脉走向作纵切口，钝性分离股动脉，结扎远侧端，将股动脉剪一小口，逆行插入PTA球囊导管(2F)，插入深度为5 cm，向球囊内注入生理盐水使其膨胀，并维持压力在405 kPa，缓慢回拉导管平切口处，抽出囊内液，使压力降为零，再将导管送入，反复3次，退出导管。(1) 空载质粒组：将涂多聚赖氨酸的球囊导管(2F)上携带300 μg的pcDNA3质粒，经原途径插入髂动脉，使球囊膨胀，压力在405kPa，维持20分钟，降压退出。(2) VEGF基因组：将涂有多聚赖氨酸的球囊导管(2F)表面携带300 μg的pcDNA3/VEGF，以上述同样方法导入髂动脉，退出导管。结扎动脉切口，缝合皮肤，精心饲养。
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三、统计学处理
两组间比较用t检验，3组间比较用方差分析，数据以均数±标准差表示。
结果
一、损伤内膜的内皮化程度
扫描电镜观察，正常血管内膜表面光滑，内皮细胞形状规则，呈梭型，沿血流方向排列(图1～3)。兔髂动脉拉伤后2周，空载质粒组血管表面粗糙，白细胞和红细胞粘附，血小板毯状聚集和微血栓形成。血管内膜大量纤维沉积，未见正常内皮细胞(图4～6)。VEGF基因处理组血管内膜内皮细胞呈岛状分布，形状较正常内皮细胞饱满，处于增殖活跃期，似铺路石状，血管内膜较空载质粒组光滑(图7～9)。
图1～3 扫描电镜显示正常血管内膜表面光滑，内皮细胞呈梭形，沿血流方向排列(1×42、2×1100、3×2500).图4～6空载质粒组内膜粗糙，有血小板，白细胞和红细胞粘附(4×1400、5×2000、6×2200).图7～9VEGF基因组内皮细胞呈岛状分布，较饱满，基本沿血流方向排列(7×97、8×2000、9×2500)
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图10 球囊拉伤后2周(A、B)和4周(C、D)，VEGF基因组(B、D)内膜增厚程度明显薄于空载质粒组(A、C) HE×40
图11 球囊拉伤2周VEGF基因组血管内膜有VEGF mRNA高表达.左：空载质粒组；右：VEGF基因组，紫棕色为阳性反应
二、血管内膜的增殖
1.内膜与中膜面积之比(I/M)：Leica Q550 IW图像分析系统分析血管内膜与中膜面积之比。VEGF基因组血管I/M之比明显低于空载质粒组，2周时分别为0.33±0.16和0.58±0.14(P<0.01)；4周时分别为0.52±0.20和1.15±0.25(P<0.01)。
2.光镜下内膜增生情况：球囊拉伤后2周和4周，标本石蜡包埋，切片，HE染色，VEGF基因组血管内膜厚度明显薄于空载质粒组，相差显著。而中膜厚度基本一致，无明显变化(图10)。
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三、血流量变化和VEGF mRNA的表达
血流量变化见附表。原位杂交显示，手术后2周VEGF基因组血管内膜有VEGF mRNA的高表达，紫棕色为阳性反应(图11)。
附表 兔髂动脉球囊拉伤后2周和4周的血流量
百分比(
±s,%) 组别
动物数
2周
4周
空载质粒组
6
65±12
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23±10
VEGF基因组
6
81± 8*
74± 8*
注：两组比较* P<0.01讨论
防治血管内膜增厚所致的血管腔狭窄是临床急待解决的难题，针对血管平滑肌细胞的增生，以往的研究主要应用直接抑制血管平滑肌细胞增殖的方法，如反义癌基因和正义抑癌基因的导入等，但由于血管平滑肌细胞增殖已经是血管形成再狭窄的较晚期反应。因此，其应用也受到一定限制。近年研究证明，内皮细胞损伤是内膜增厚的始动因素。因此，加快内皮细胞的修复，增加损伤内膜的内皮化，是治疗因内膜增厚而至管腔狭窄的有效方法。在正常的血管内膜，小量的内皮细胞损伤，恢复很快，大约在48小时内即开始，7～14天完全恢复正常[4]。然而，当内膜损伤较大时则内皮的再生非常慢。当内膜尚未内皮化时，即已经被修复的增殖平滑肌细胞和细胞外基质堆积，使内膜增厚，出现血管狭窄[5]。血管内膜内皮细胞层的完整对保持血管壁的正常结构和功能极其重要，并与血管狭窄密切相关，内皮细胞损伤面积决定着新生内膜增厚的程度，内皮细胞最后覆盖区内膜增生最厚，损伤后内皮化的速度对最终形成再狭窄有关键作用[6]。因此，应用内皮细胞丝裂原VEGF，促进拉伤内膜的内皮化，是防治血管再狭窄的新策略。我们将pcDNA3/VEGF的真核表达质粒定位导入局部血管，原位杂交显示局部血管内壁有VEGF mRNA的高表达。球囊拉伤2周，VEGF基因治疗组血管内皮化程度明显好于空载质粒组，内皮细胞较正常内皮细胞饱满，基本沿血流方向排列，对照组血管内膜粗糙，有红细胞，白细胞，血小板粘附。说明VEGF可明显促进拉伤血管内皮细胞的增殖，加速内膜的内皮化，内膜与中膜面积之比和光镜结果均证明，VEGF基因组可明显降低拉伤血管内膜的增生，血流量明显改善，说明VEGF基因导入血管局部可以通过加快血管内膜内皮细胞的增生，达到抑制狭窄的目的。
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本课题为国家教委博士点基金、国家自然科学基金、国家“863”计划基金资助项目。
参考文献
1 Holmes DR, Schwartz RS, Webster MW. Coronary restenosis: what have we learned from angiography? J Am Coll Cardiol, 1991, 17(suppl)：14B-22B.
2 Isner JM, Walsh K, Rosenfield K. Arterial gene therapy for restenosis. Human Gene Therapy, 1996, 7：989-1011.
3 周爱儒，郑为，邢得志，等.分子搭桥术基因治疗闭塞性血管病的实验研究.中华医学杂志，1996，76：662-666.
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4 Fishman JA, Collazzo RE, Karnovsky MJ. Amorphologic and permeabiliti study of luminal smooth muscle cells after arterial injury in the rat. Lab Invest, 1975, 32：339-345.
5 Clowes AW, Collszzo RE, Karnovsky MJ. A morphologic and permibilitistudy of luminal smooth muscle cells after arterial injury in the rat. Lab Invest, 1978, 39：141-149.
6 Liu MW, Roubin GS, King SB. Restenosis after coronary angioplasty potentialbiologic determinants and role initial hyperplasia. Circulation, 1989, 79：1374-1384.
(收稿：1997-11-07 修回：1998-05-27), http://www.100md.com
单位：100083北京医科大学生化分子生物学系(张曼、周爱儒)北京医科大学第一医院心内科(朱国英)；北京医科大学心血管研究所(陈光慧、叶正茂、汤健)
关键词：内皮生长因子；基因疗法
中华医学杂志/981008 【摘要】 目的 从基因治疗方面探讨解决经皮血管成型术和其他血管再塑引起的血管内膜损伤，血管狭窄途径。方法 构建了pcDNA3/血管内皮生长因子(VEGF)真核表达载体，通过多聚赖氨酸基因球囊法，将VEGF基因定位导入球囊拉伤的兔髂动脉内壁，应用原位杂交，免疫组织化学，电磁血流量仪，扫描电镜和光镜等方法检测VEGF基因作用效果。结果 VEGF基因组球囊拉伤血管2周时内膜有大量VEGF mRNA和蛋白表达，内膜内皮化范围明显大于空载质粒对照组，内膜与中膜面积之比小于对照组，血流量明显改善。结论 血管内导入VEGF基因，可促进内皮细胞增生，加速损伤内膜的修复，抑制血管内膜平滑肌细胞的增生，防治血管狭窄。
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Vascular endothelial growth gene therapy for narrowing of rabbit iliac artery
Zhang Man, Zhou Airu, Zhu Guoying, et al. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Beijing Medical University, Beijing 100083
【Abstract】 Objective To study the mechanism of renarrowing and vascular endothelial growth factor (VEGF) gene therapy to prevent the restenosis caused by balloon angioplasty. Methods According to the special function of VEGF that promepts the proliferation of endothelial cell (EC), we constituted an eukaryotic expression vector of pcDNA3/VEGF, and added the pcDNA3/VEGF to the surface of polylysine-balloon. We examined the results of the test by in situ blot, eletromagnetic blood flow mechine, scanning eletromicroscope, and light microscope. Results There was higher expression of VEGF mRNA and iliac artery intima in the VEGF gene group. The extent of endothelialization was larger, the ratio of intima to media (I/M) was smaller, and the blood flow was more sufficient than in the vector control group. Conclusion VEGF gene local delivery could stimulate the proliferation of EC, accelerate the endothelialization of injury-artery, and inhibite the proliferation of smooth muscle cell (SMC).
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【Key words】 Endothelial growth factor Gene therapy
(Natl Med J China, 1998, 78：749-752)
血管成型术(percutaneous transluminal angioplasty，PTA)6个月内有35%～45%的病人发生再狭窄[1]。目前对再狭窄尚无有效的防治方法，严重地限制了PTA的使用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一种血管内皮细胞特异性的促丝裂原。应用VEGF的特异丝裂原作用，促进损伤内皮的迅速增生，加速损伤内膜内皮化，进而抑制血管平滑肌细胞增殖，作为防治血管再狭窄的新策略。1996年美国FDA批准VEGF基因为应用于心血管临床的治疗基因[2]。本实验应用多聚赖氨酸基因球囊，将VEGF基因真核表达质粒转移致球囊拉伤血管内膜，观察血管内膜的增生和血流量情况，且对血管壁细胞的变化和血管内膜内皮化程度作了连续观察。以达到在内膜损伤早期防治血管再狭窄的目的。
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材料与方法
一、材料
1.pcDNA3/VEGF121的构建，质粒的提取、纯化及鉴定：将本室克隆的550 bp的人VEGF基因经BamH1和EcoR1酶切后重组在质粒PSK中形成PSK/VEGF121，再从PSK/VEGF121切取VEGF121 cDNA构建于pcDNA3真核表达质粒内(pcDNA3购自美国Invitrogen公司)，形成pcDNA3/VEGF121，其中目的基因可编码121个氨基酸的VEGF121，含有信号肽序列，其上游有巨细胞病毒启动子，下游有多聚腺苷酸尾。将pcDNA3/VEGF转化大肠杆菌(DH5)，扩增，减变性大量提取质粒，用聚乙二醇8 000纯化方法，A260/A280的比值在1.8以上，酶切鉴定[3]。
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2.基因球囊的制备：PTA导管球囊涂抹0.1%的多聚赖氨酸30 μl，反复吹干，再将pcDNA3空载体和pcDNA3/VEGF121各 300 μg(30 μl)。分别反复涂于球囊表面，吹干待用。上述过程均在无菌条件下进行。
二、方法
动物模型的制备及分组：健康家兔32只，雌雄不限，体重2.2～2.5 kg，仰位固定于手术台上，手术前常规处理，逐层2%盐酸利多卡因局部麻醉，沿股动脉走向作纵切口，钝性分离股动脉，结扎远侧端，将股动脉剪一小口，逆行插入PTA球囊导管(2F)，插入深度为5 cm，向球囊内注入生理盐水使其膨胀，并维持压力在405 kPa，缓慢回拉导管平切口处，抽出囊内液，使压力降为零，再将导管送入，反复3次，退出导管。(1) 空载质粒组：将涂多聚赖氨酸的球囊导管(2F)上携带300 μg的pcDNA3质粒，经原途径插入髂动脉，使球囊膨胀，压力在405kPa，维持20分钟，降压退出。(2) VEGF基因组：将涂有多聚赖氨酸的球囊导管(2F)表面携带300 μg的pcDNA3/VEGF，以上述同样方法导入髂动脉，退出导管。结扎动脉切口，缝合皮肤，精心饲养。
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三、统计学处理
两组间比较用t检验，3组间比较用方差分析，数据以均数±标准差表示。
结果
一、损伤内膜的内皮化程度
扫描电镜观察，正常血管内膜表面光滑，内皮细胞形状规则，呈梭型，沿血流方向排列(图1～3)。兔髂动脉拉伤后2周，空载质粒组血管表面粗糙，白细胞和红细胞粘附，血小板毯状聚集和微血栓形成。血管内膜大量纤维沉积，未见正常内皮细胞(图4～6)。VEGF基因处理组血管内膜内皮细胞呈岛状分布，形状较正常内皮细胞饱满，处于增殖活跃期，似铺路石状，血管内膜较空载质粒组光滑(图7～9)。
图1～3 扫描电镜显示正常血管内膜表面光滑，内皮细胞呈梭形，沿血流方向排列(1×42、2×1100、3×2500).图4～6空载质粒组内膜粗糙，有血小板，白细胞和红细胞粘附(4×1400、5×2000、6×2200).图7～9VEGF基因组内皮细胞呈岛状分布，较饱满，基本沿血流方向排列(7×97、8×2000、9×2500)
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图10 球囊拉伤后2周(A、B)和4周(C、D)，VEGF基因组(B、D)内膜增厚程度明显薄于空载质粒组(A、C) HE×40
图11 球囊拉伤2周VEGF基因组血管内膜有VEGF mRNA高表达.左：空载质粒组；右：VEGF基因组，紫棕色为阳性反应
二、血管内膜的增殖
1.内膜与中膜面积之比(I/M)：Leica Q550 IW图像分析系统分析血管内膜与中膜面积之比。VEGF基因组血管I/M之比明显低于空载质粒组，2周时分别为0.33±0.16和0.58±0.14(P<0.01)；4周时分别为0.52±0.20和1.15±0.25(P<0.01)。
2.光镜下内膜增生情况：球囊拉伤后2周和4周，标本石蜡包埋，切片，HE染色，VEGF基因组血管内膜厚度明显薄于空载质粒组，相差显著。而中膜厚度基本一致，无明显变化(图10)。
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三、血流量变化和VEGF mRNA的表达
血流量变化见附表。原位杂交显示，手术后2周VEGF基因组血管内膜有VEGF mRNA的高表达，紫棕色为阳性反应(图11)。
附表 兔髂动脉球囊拉伤后2周和4周的血流量
百分比(
±s,%) 组别动物数
2周
4周
空载质粒组
6
65±12
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23±10
VEGF基因组
6
81± 8*
74± 8*
注：两组比较* P<0.01讨论
防治血管内膜增厚所致的血管腔狭窄是临床急待解决的难题，针对血管平滑肌细胞的增生，以往的研究主要应用直接抑制血管平滑肌细胞增殖的方法，如反义癌基因和正义抑癌基因的导入等，但由于血管平滑肌细胞增殖已经是血管形成再狭窄的较晚期反应。因此，其应用也受到一定限制。近年研究证明，内皮细胞损伤是内膜增厚的始动因素。因此，加快内皮细胞的修复，增加损伤内膜的内皮化，是治疗因内膜增厚而至管腔狭窄的有效方法。在正常的血管内膜，小量的内皮细胞损伤，恢复很快，大约在48小时内即开始，7～14天完全恢复正常[4]。然而，当内膜损伤较大时则内皮的再生非常慢。当内膜尚未内皮化时，即已经被修复的增殖平滑肌细胞和细胞外基质堆积，使内膜增厚，出现血管狭窄[5]。血管内膜内皮细胞层的完整对保持血管壁的正常结构和功能极其重要，并与血管狭窄密切相关，内皮细胞损伤面积决定着新生内膜增厚的程度，内皮细胞最后覆盖区内膜增生最厚，损伤后内皮化的速度对最终形成再狭窄有关键作用[6]。因此，应用内皮细胞丝裂原VEGF，促进拉伤内膜的内皮化，是防治血管再狭窄的新策略。我们将pcDNA3/VEGF的真核表达质粒定位导入局部血管，原位杂交显示局部血管内壁有VEGF mRNA的高表达。球囊拉伤2周，VEGF基因治疗组血管内皮化程度明显好于空载质粒组，内皮细胞较正常内皮细胞饱满，基本沿血流方向排列，对照组血管内膜粗糙，有红细胞，白细胞，血小板粘附。说明VEGF可明显促进拉伤血管内皮细胞的增殖，加速内膜的内皮化，内膜与中膜面积之比和光镜结果均证明，VEGF基因组可明显降低拉伤血管内膜的增生，血流量明显改善，说明VEGF基因导入血管局部可以通过加快血管内膜内皮细胞的增生，达到抑制狭窄的目的。
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本课题为国家教委博士点基金、国家自然科学基金、国家“863”计划基金资助项目。
参考文献
1 Holmes DR, Schwartz RS, Webster MW. Coronary restenosis: what have we learned from angiography? J Am Coll Cardiol, 1991, 17(suppl)：14B-22B.
2 Isner JM, Walsh K, Rosenfield K. Arterial gene therapy for restenosis. Human Gene Therapy, 1996, 7：989-1011.
3 周爱儒，郑为，邢得志，等.分子搭桥术基因治疗闭塞性血管病的实验研究.中华医学杂志，1996，76：662-666.
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4 Fishman JA, Collazzo RE, Karnovsky MJ. Amorphologic and permeabiliti study of luminal smooth muscle cells after arterial injury in the rat. Lab Invest, 1975, 32：339-345.
5 Clowes AW, Collszzo RE, Karnovsky MJ. A morphologic and permibilitistudy of luminal smooth muscle cells after arterial injury in the rat. Lab Invest, 1978, 39：141-149.
6 Liu MW, Roubin GS, King SB. Restenosis after coronary angioplasty potentialbiologic determinants and role initial hyperplasia. Circulation, 1989, 79：1374-1384.
(收稿：1997-11-07 修回：1998-05-27), http://www.100md.com