视黄酸对胃癌细胞MGc80-3体内外转移能力的影响*
作者：陈玉强1，2 吴 乔1 陈正明1 苏文金1 陈 福1
单位：1厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室 福建省厦门市 361005；2解放军174医院 福建省厦门市 361003
关键词：胃肿瘤；视黄酸；肿瘤转移；肿瘤细胞，培养的
华人消化杂志981015
Effects of retinoic acid on metastatic ability of gastric cancer cells MGc80-3 in vivo and in vitro*
CHEN Yu-Qiang1,2, WU Qiao1, CHEN Zheng-Ming1, SU Wen-Jin1 and CHEN Fu1
, http://www.100md.com
1The State Lab for Tumor Cell Engineering of Xiamen University, Xiamen 361005, Fujian Province, China
2Chinese PLA 174 Hospital, Xiamen 361003, Fujian Province, China
Subject headings stomach neoplasms; retinoic acid; neoplasm metastasis; tumor cells, cultured
Abstract
AIM To investigate the effects of retinoic acid on metaststic ability of gastric cancer cells MGc80-3.
, 百拇医药
METHODS MGc80-3 cells were treated with 10-6mol/L all-trans retinoic acid (ATRA). MGc80-3 cells＇ adhesive ability to amnion was measured, by using fresh amnion as adhesive object. The activity of β-glucuronidase (β-G) was assayed using phenolphthalein mono-β-glucosiduroronic acid as substrate. The changes of ultrastructure were observed by SEM and TEM. The expression of nm23 gene in mRNA level was detected by Northern blot and analysed by Fluor-STM multilmager and Multi-Analyst System (Bio-Rad). Furthermore, MGc80-3 cells＇ metastatic ability in vivo was investigated on the model of human gastric cancer with liver metastasis in nude mice.
, 百拇医药
RESULTS After MGc80-3 cells were treated with ATRA, the adhesive ability to amnion was suppressed remarkablly, although statistically it was enhanced in significantly in early stage. β-G activity was decreased both introcellularly and extrocelluarly. The inhibition rates were 41.35% and 37.19%, respectively. Microvilli were shortened, even disappeared and filaments strengthened, arranged around nuclei more orderly and polarizably. The expression of nm23 gene in mRNA level was decreased obviously, the inhibition rate being 50%. The tumorigenesis rate in spleen was decreased by 16.7%, tumor growth and local metastasis was inhibited, liver metastatic rate was decreased by 33.3%. The number of metastatic tumors, which were concentrated in the swelling liver of untreated nude mice, was decreased by 94%.
, 百拇医药
CONCLUSION Retinoic acid can effectively suppress the metastatic ability of gastric cancer cells in vivo and in vitro.
中国图书资料分类号 R735.2
摘 要
目的 观察视黄酸(ATRA)对胃癌细胞体内外转移能力的影响.
方法 以10-6mol/L全反式ATRA处理胃癌细胞株MGc80-3. 用新鲜羊膜作为细胞粘附对象，观察MGc80-3细胞的粘附能力. 以酚酞β-葡糖醛酸苷钠盐为底物，测定β-葡糖醛酸酶(β-G)活性. 扫描电镜和透射电镜观察细胞超微结构的变化. 以Northern blot测定nm23基因mRNA的表达水平. 利用已建立的人胃癌裸小鼠肝转移模型进一步在体内观察ATRA对胃癌细胞转移能力的作用.
, http://www.100md.com
结果 经ATRA处理后胃癌细胞的粘附能力在早期有所升高，但没有统计学意义；处理80d后，细胞粘附于羊膜的能力显著下降. ATRA既能有效降低细胞内β-G的活性，也能抑制细胞向外分泌β-G，抑制率分别为41.35%和37.19%. 经ATRA处理后细胞微绒毛缩短、甚至消失，细胞表面呈泡状突起；微丝增多，排列整齐，呈极性分布于细胞核两端. 在ATRA处理的细胞中，nm23基因的mRNA表达水平明显降低，抑制率为50%. ATRA能使脾包膜下移植瘤的成瘤率降低16.7%，抑制脾移植瘤的生长和脾内肿瘤转移；并能显著抑制移植瘤的肝转移，使裸鼠的肝转移率降低33.3%，转移瘤数的抑制率达94%. 对照组裸鼠肝脏的转移灶呈栗粒样密集分布，平均肝脏重量明显大于处理组.
结论 视黄酸能有效抑制胃癌细胞MGc80-3的体内外转移能力.
0 引言
肿瘤转移是肿瘤患者死亡的主要原因之一，控制转移是决定预后的关键因素. 研究表明，肿瘤转移是一个多步骤、多阶段、多基因的复杂过程，与细胞粘附因子、运动因子、基质降解酶、信号传导系统以及转移相关基因等密切相关[1，2]. 目前临床上还缺乏有效的抗肿瘤转移药物. 近来报道视黄酸除诱导肿瘤细胞分化外，还能抑制肿瘤侵袭和转移[3，4]，对肿瘤转移的多个环节都有作用. 我们在证实全反式视黄酸(ATRA)对胃癌细胞MGc80-3生长具有明显抑制作用的基础上，进一步在体内外研究ATRA对MGc80-3侵袭和转移能力的影响.
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1 材料和方法
1.1 材料 ATRA购自Sigma公司，用1∶1无水乙醇/DMSO配成10-2mol/L储存液，最后以培养液稀释至终浓度10-6mol/L. 胃癌细胞株MGc80-3由本校抗癌中心提供，细胞在含100mL/L小牛血清、105U/L青霉素和0.1g/L链霉素的RPMI-1640(Gibco产品)培养液，37℃ 50mL/L CO2的培养箱中培养. 实验动物：(6～8)周龄的Balb/c裸小鼠(SPF级，本校抗癌中心提供，合格证号：医动字第23-007,1995-05-10)在无特定病原体的层流架(SEL-1型，上海西普-必凯实验动物有限公司)内饲养. 室内恒温、恒湿、定期消毒，在无菌操作下定期更换笼具、垫料、饮用水和标准饲料(上海西普-必凯实验动物有限公司生产的耐高压颗粒饲料).
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 细胞粘附试验 在无菌条件下从足月产新鲜胎盘(解放军174医院妇儿科提供)中剥离羊膜，PBS冲洗后，用0.25mol/L NH4OH浸泡2h，刮去羊膜上残余的上皮细胞，PBS冲洗后，保存于RPMI-1640培养液中. 消化细胞，取2mL(5×107细胞/L)细胞悬液加入用24孔板改制的Boyden模型[5]上室(下室先注满培养液)，37℃，50mL/L CO2下分别培养细胞2h,4h,6h后弃培养液，消化、收集粘附于羊膜上的细胞，计数并计算细胞粘附率.
1.2.2 β-G活性测定 ATRA处理细胞12d，以2mL(5×107细胞/L)细胞悬液加入24孔板，48h后收集上清并反复冻融裂解细胞. 以酚酞β-葡糖醛酸苷钠盐(Sigma)为底物，于pH 4.5，37℃，保温18h，释放的酚酞在pH 10.2呈粉红色，于Bio-Rad3550酶标仪上测定A(OD值，540nm).
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1.2.3 电镜观察 ATRA处理细胞10d后，按常规方法制备样品，分别在S-520扫描电镜和JEM-100CX/Ⅱ型透射电镜下观察.
1.2.4 Northern blot ATRA处理细胞24h，用硫氰酸胍-氯化铯离心法提取细胞总RNA，以α-32P-dCTP和α-32P-dATP(北京亚辉生物工程公司)标记nm23 cDNA探针(北京天象人公司)，按常规方法进行Northern blot. 用Fluor-STM multilmager和Multi-analyst系统(Bio-Rad)定量分析结果.
1.2.5 转移能力的测定 选裸小鼠12只，皮下注射含5g/L四氯化碳的橄榄油0.1mL. 次日，裸小鼠腹腔内注射0.2mL6.25g/L硫贲妥钠(上海新亚制药厂)，10min后，取左肋缘下切口，750mL/L酒精消毒术野3次，逐层进腹. 取出脾脏，于脾包膜下注入0.05mL(含1.25×106个细胞)细胞悬液. 压迫止血后逐层关腹. 随机将裸小鼠分成两组. 处理组隔天通过胃管灌入0.7mg ATRA. 对照组用不含ATRA的溶液同样处理. 术后6wk处死裸鼠，并解剖、拍照.
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统计学处理 实验结果行t检验.
2 结果
2.1 ATRA对胃癌细胞粘附率的影响 经ATRA处理后MGc80-3细胞的粘附能力在早期有所升高，但没有统计学意义；处理80d后，细胞粘附于羊膜的能力显著下降(表1).
2.2 ATRA对胃癌细胞β-G活性的影响 ATRA既能有效降低MGc80-3细胞内β-G的活性，也能抑制细胞向外分泌β-G(表2).
表1 ATRA对胃癌细胞粘附率的影响 处理天数
粘附细胞数(×103/孔)
2h
4h
, 百拇医药
6h
0
18.8±4.3
29.2±3.5
40.3±4.5
5
21.4±3.7
30.7±3.2
42.4±5.3
10
20.3±3.8
28.8±5.0
, 百拇医药 42.0±7.6
30
20.3±4.3
27.8±6.0
38.0±4.0
80
9.8±2.4a
12.2±2.1a
17.8±3.3b
aP<0.05，bP<0.01，vs 对照组.
表2 ATRA对胃癌细胞β-G活性的影响
, 百拇医药
对照组
处理组
抑制率(%)
细胞
0.474±0.005
0.278±0.009b
41.4
培养液
0.121±0.004
0.076±0.004b
37.2
bP<0.01，vs 对照组.
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2.3 ATRA对胃癌细胞超微结构的影响 MGc80-3细胞表面微绒毛丰富，呈放射状；细胞内微丝少见. 经ATRA处理后细胞微绒毛缩短、甚至消失，细胞表面呈泡状突起；微丝增多，排列整齐，呈极性分布于细胞核两端(图1～4).
2.4 ATRA对nm23 mRNA表达的影响 经ATRA处理后MGc80-3细胞中nm23基因的mRNA表达水平明显降低(图5)，定量分析表明基因表达水平下降为50%(图6).
2.5 ATRA对胃癌细胞在裸小鼠中转移能力的作用ATRA能使脾包膜下移植瘤的成瘤率降低16.7%，并抑制脾移植瘤的生长和脾内肿瘤转移；能显著抑制移植瘤的肝转移，使裸鼠的肝转移率降低33.3%，转移瘤数的抑制率达94%. 对照组裸鼠肝脏的转移灶呈栗粒样密集分布，平均肝脏重量明显大于处理组(表3).
, 百拇医药
图1 MGc80-3细胞微绒毛丰富，呈放射状 扫描电镜 图2 ATRA处理后MGc80-3细胞微绒毛缩短或消失，表面呈泡状突起 扫描电镜
图3 MGc80-3细胞内微丝(↑)少见 透射电镜 图4 ATRA处理后MGc80-3细胞微丝(↑)排列整齐，呈极性分布于核两端 透射电镜
图5 ATRA对nm23 mRNA表达的影响. 图6 nm23基因表达水平的定量分析.
表3 ATRA对胃癌细胞裸小鼠肝转移模型的作用 组别
成瘤率
脾瘤数
平均脾重
肝转移率
, 百拇医药
肝瘤数
平均肝重
对照组
100.0%(6/6)
13
1.60±0.97
83.3%
(5/6)
134
3.15±1.03
处理组
83.3%(5/6)
5
, 百拇医药
0.44±0.49a
50.0%
(3/6)
8
1.65±0.25b
aP<0.05，bP<0.01，vs 对照组.
3 讨论
细胞粘附能力对胚胎发育和维持正常组织的结构功能至关重要，细胞转化时细胞粘附能力发生异常而出现侵袭转移能力. 一般认为肿瘤细胞的同质性粘附降低，异质性粘附增强. Santos et al[6]用cisRA处理人前列腺癌细胞株LNCaP发现细胞对层粘连蛋白(LN)、纤维粘连蛋白(FN)和Ⅳ型胶元的粘附能力下降. 本研究表明，ATRA处理MGc80-3的早期，细胞粘附羊膜的能力有所增强，但无统计学意义. 处理80d后细胞的粘附能力显著下降(表1). 说明ATRA能抑制MGc80-3细胞的异质性粘附，但这可能是一晚期事件或在对转移的抑制中不起主要作用. 微绒毛的功能与细胞粘附能力密切相关，电镜下看到ATRA处理后MGc80-3细胞的微绒毛缩短、甚至消失，细胞表面呈泡状突起(图2)，这与细胞粘附能力的改变相符. 此外，细胞超微结构的改变还表现为微丝增多，呈极性分布，提示ATRA使处于解聚形式的微丝产生聚合并重新排列，从而影响细胞的运动. nm23基因对细胞骨架的形成和稳定有着重要作用，是一种转移相关基因[7]，多数研究表明nm23的表达水平与细胞转移能力呈负相关，但也有相反的报道，我们的Northern blot结果说明，ATRA在抑制胃癌细胞转移、使侵袭能力下降的同时，nm23基因的mRNA表达也下降，两者呈正相关.
, 百拇医药
癌细胞侵袭、转移时必须穿越细胞外基质(ECM). 当癌细胞与ECM粘附后，首先要对ECM进行酶的降解，细胞才能移动. β-葡糖醛酸酶是粗面内质网合成的一种糖苷酶，能催化蛋白聚糖β-糖苷链的分解，破坏基底膜而促进肿瘤的侵袭和转移. 这种酶在转移能力高的低分化癌中表达水平升高[5]. 本结果表明ATRA能抑制MGc80-3细胞β-葡糖醛酸酶的活性，而且能减少细胞向外分泌β-葡糖醛酸酶而降低其侵袭力.
我们应用胃癌裸小鼠肝转移模型[8]进一步研究ATRA在体内对胃癌细胞转移的抑制作用. 术前先给裸鼠皮下注射CCl4，造成肝脏损害，再生中的肝细胞可分泌细胞生长因子等，以促进转移的细胞在肝脏中生长. 裸小鼠经灌入ATRA后，胃癌细胞脾包膜下移植瘤的成瘤率降低16.7%，脾移植瘤的生长受到抑制和脾内肿瘤转移数减少；ATRA还能显著抑制癌细胞的肝转移，使裸鼠的肝转移率降低33.3%，转移瘤数的抑制率达94%. 说明ATRA能显著抑制MGc80-3细胞的实验性肝转移.
, 百拇医药
以上结果表明，ATRA能有效抑制胃癌细胞的转移侵袭能力，其可能机制是：①抑制胃癌细胞的生长、降低其致瘤性；②影响细胞的运动、粘附及对基质的降解；③改变细胞内与转移相关基因的表达.
陈玉强，男，1963-10-15生，福建省莆田市人，汉族. 1985年第二军医大学本科毕业，1991年第二军医大学硕士，1995年厦门大学生物系博士研究生，普通外科主治医师，主要从事胃癌诊断和治疗的研究，发表论文8篇.
*福建省自然科学基金资助，No.C96002.
通讯作者 陈玉强，361005，福建省厦门市，厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室.
*Supported by the Natural Science Foundation of Fujian Province
, http://www.100md.com
Correspondence to:CHEN Yu-Qiang, The State Lab for Tumor Cell Engineering of Xiamen University, Xiamen 361005, Fujian Province, China
Tel. +86*592*2185361
收稿日期 1998-07-07
4 参考文献
1 Cilenti L, Toniato E, Ruggiero P, Fusco C, Farina AR, Tiberio A et al. Transcriptional modulation of the human intercellular adhesion molecule gene Ⅰ(ICAM-1) by retinoic acid in melanoma cells. Exp Cell Res, 1995;218(1):263-270
, 百拇医药
2 Wu Q, Li Y, Liu R. Inhibition of trans-retinoic acid-resistant human breast cancer cell growth by retinoid X receptor-selective retinoids. Mol Cell Biol, 1997;17(11):6598-6608
3 Ryuto M, Jimi S, Ono M, Natio S, Nakayama Y, Yamada Y et al. All-trans-retinoic acid-dependent inhibition of E-cadherin-based cell adhesion with concomitant dephosphorylation of beta-catenin in metastatic human renal carcinoma. Japanese J Cancer Res, 1997;88(10):982-991
, 百拇医药
4 Byers S, Pishvaian M, Crockett C, Peer C, Tozeren A, Sporn M et al. Retiniods increase cell-cell adhesion strength, beta-catenin protein stability, and localization to the cell membrane in a breast cancer cell line: a role for serine kinase activity. Endocrinology, 1996;137(8):3265-3273
5 冯树，宋今丹. 大肠癌细胞分泌的β-葡萄糖醛酸苷酶与其侵袭力关系的研究. 细胞生物学杂志，1996；18(4)：183-184
6 Santos CLS, Giorgi RR, Frochtengarten F, Elias MCQB, Chammas R, Brentani RR. Regulation of vitronectin receptor expression by retinoic acid on human melanoma cells. Int J Clin Lab Res, 1994;24(3):148-153
7 Hsu JW, Hsu SL, Chu JJ, Liu MC, Chiang CD. Increased NM23: MTS1 ratio inversely correlated with metastasis behaviour in human lung squamous cell carcinoma. Anticancer Res, 1997;17(1A):407-411
8 杨善民，陈福，张长弓，顾星星，陈美玉. 人胃癌裸小鼠肝转移模型的建立. 中华肿瘤杂志，1993；15(3)：195-197, 百拇医药(陈玉强1，2 吴 乔1 陈正明1 苏文金1 陈 福1)
单位：1厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室 福建省厦门市 361005；2解放军174医院 福建省厦门市 361003
关键词：胃肿瘤；视黄酸；肿瘤转移；肿瘤细胞，培养的
华人消化杂志981015
Effects of retinoic acid on metastatic ability of gastric cancer cells MGc80-3 in vivo and in vitro*
CHEN Yu-Qiang1,2, WU Qiao1, CHEN Zheng-Ming1, SU Wen-Jin1 and CHEN Fu1
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1The State Lab for Tumor Cell Engineering of Xiamen University, Xiamen 361005, Fujian Province, China
2Chinese PLA 174 Hospital, Xiamen 361003, Fujian Province, China
Subject headings stomach neoplasms; retinoic acid; neoplasm metastasis; tumor cells, cultured
Abstract
AIM To investigate the effects of retinoic acid on metaststic ability of gastric cancer cells MGc80-3.
, 百拇医药
METHODS MGc80-3 cells were treated with 10-6mol/L all-trans retinoic acid (ATRA). MGc80-3 cells＇ adhesive ability to amnion was measured, by using fresh amnion as adhesive object. The activity of β-glucuronidase (β-G) was assayed using phenolphthalein mono-β-glucosiduroronic acid as substrate. The changes of ultrastructure were observed by SEM and TEM. The expression of nm23 gene in mRNA level was detected by Northern blot and analysed by Fluor-STM multilmager and Multi-Analyst System (Bio-Rad). Furthermore, MGc80-3 cells＇ metastatic ability in vivo was investigated on the model of human gastric cancer with liver metastasis in nude mice.
, 百拇医药
RESULTS After MGc80-3 cells were treated with ATRA, the adhesive ability to amnion was suppressed remarkablly, although statistically it was enhanced in significantly in early stage. β-G activity was decreased both introcellularly and extrocelluarly. The inhibition rates were 41.35% and 37.19%, respectively. Microvilli were shortened, even disappeared and filaments strengthened, arranged around nuclei more orderly and polarizably. The expression of nm23 gene in mRNA level was decreased obviously, the inhibition rate being 50%. The tumorigenesis rate in spleen was decreased by 16.7%, tumor growth and local metastasis was inhibited, liver metastatic rate was decreased by 33.3%. The number of metastatic tumors, which were concentrated in the swelling liver of untreated nude mice, was decreased by 94%.
, 百拇医药
CONCLUSION Retinoic acid can effectively suppress the metastatic ability of gastric cancer cells in vivo and in vitro.
中国图书资料分类号 R735.2
摘 要
目的 观察视黄酸(ATRA)对胃癌细胞体内外转移能力的影响.
方法 以10-6mol/L全反式ATRA处理胃癌细胞株MGc80-3. 用新鲜羊膜作为细胞粘附对象，观察MGc80-3细胞的粘附能力. 以酚酞β-葡糖醛酸苷钠盐为底物，测定β-葡糖醛酸酶(β-G)活性. 扫描电镜和透射电镜观察细胞超微结构的变化. 以Northern blot测定nm23基因mRNA的表达水平. 利用已建立的人胃癌裸小鼠肝转移模型进一步在体内观察ATRA对胃癌细胞转移能力的作用.
, http://www.100md.com
结果 经ATRA处理后胃癌细胞的粘附能力在早期有所升高，但没有统计学意义；处理80d后，细胞粘附于羊膜的能力显著下降. ATRA既能有效降低细胞内β-G的活性，也能抑制细胞向外分泌β-G，抑制率分别为41.35%和37.19%. 经ATRA处理后细胞微绒毛缩短、甚至消失，细胞表面呈泡状突起；微丝增多，排列整齐，呈极性分布于细胞核两端. 在ATRA处理的细胞中，nm23基因的mRNA表达水平明显降低，抑制率为50%. ATRA能使脾包膜下移植瘤的成瘤率降低16.7%，抑制脾移植瘤的生长和脾内肿瘤转移；并能显著抑制移植瘤的肝转移，使裸鼠的肝转移率降低33.3%，转移瘤数的抑制率达94%. 对照组裸鼠肝脏的转移灶呈栗粒样密集分布，平均肝脏重量明显大于处理组.
结论 视黄酸能有效抑制胃癌细胞MGc80-3的体内外转移能力.
0 引言
肿瘤转移是肿瘤患者死亡的主要原因之一，控制转移是决定预后的关键因素. 研究表明，肿瘤转移是一个多步骤、多阶段、多基因的复杂过程，与细胞粘附因子、运动因子、基质降解酶、信号传导系统以及转移相关基因等密切相关[1，2]. 目前临床上还缺乏有效的抗肿瘤转移药物. 近来报道视黄酸除诱导肿瘤细胞分化外，还能抑制肿瘤侵袭和转移[3，4]，对肿瘤转移的多个环节都有作用. 我们在证实全反式视黄酸(ATRA)对胃癌细胞MGc80-3生长具有明显抑制作用的基础上，进一步在体内外研究ATRA对MGc80-3侵袭和转移能力的影响.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 ATRA购自Sigma公司，用1∶1无水乙醇/DMSO配成10-2mol/L储存液，最后以培养液稀释至终浓度10-6mol/L. 胃癌细胞株MGc80-3由本校抗癌中心提供，细胞在含100mL/L小牛血清、105U/L青霉素和0.1g/L链霉素的RPMI-1640(Gibco产品)培养液，37℃ 50mL/L CO2的培养箱中培养. 实验动物：(6～8)周龄的Balb/c裸小鼠(SPF级，本校抗癌中心提供，合格证号：医动字第23-007,1995-05-10)在无特定病原体的层流架(SEL-1型，上海西普-必凯实验动物有限公司)内饲养. 室内恒温、恒湿、定期消毒，在无菌操作下定期更换笼具、垫料、饮用水和标准饲料(上海西普-必凯实验动物有限公司生产的耐高压颗粒饲料).
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 细胞粘附试验 在无菌条件下从足月产新鲜胎盘(解放军174医院妇儿科提供)中剥离羊膜，PBS冲洗后，用0.25mol/L NH4OH浸泡2h，刮去羊膜上残余的上皮细胞，PBS冲洗后，保存于RPMI-1640培养液中. 消化细胞，取2mL(5×107细胞/L)细胞悬液加入用24孔板改制的Boyden模型[5]上室(下室先注满培养液)，37℃，50mL/L CO2下分别培养细胞2h,4h,6h后弃培养液，消化、收集粘附于羊膜上的细胞，计数并计算细胞粘附率.
1.2.2 β-G活性测定 ATRA处理细胞12d，以2mL(5×107细胞/L)细胞悬液加入24孔板，48h后收集上清并反复冻融裂解细胞. 以酚酞β-葡糖醛酸苷钠盐(Sigma)为底物，于pH 4.5，37℃，保温18h，释放的酚酞在pH 10.2呈粉红色，于Bio-Rad3550酶标仪上测定A(OD值，540nm).
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1.2.3 电镜观察 ATRA处理细胞10d后，按常规方法制备样品，分别在S-520扫描电镜和JEM-100CX/Ⅱ型透射电镜下观察.
1.2.4 Northern blot ATRA处理细胞24h，用硫氰酸胍-氯化铯离心法提取细胞总RNA，以α-32P-dCTP和α-32P-dATP(北京亚辉生物工程公司)标记nm23 cDNA探针(北京天象人公司)，按常规方法进行Northern blot. 用Fluor-STM multilmager和Multi-analyst系统(Bio-Rad)定量分析结果.
1.2.5 转移能力的测定 选裸小鼠12只，皮下注射含5g/L四氯化碳的橄榄油0.1mL. 次日，裸小鼠腹腔内注射0.2mL6.25g/L硫贲妥钠(上海新亚制药厂)，10min后，取左肋缘下切口，750mL/L酒精消毒术野3次，逐层进腹. 取出脾脏，于脾包膜下注入0.05mL(含1.25×106个细胞)细胞悬液. 压迫止血后逐层关腹. 随机将裸小鼠分成两组. 处理组隔天通过胃管灌入0.7mg ATRA. 对照组用不含ATRA的溶液同样处理. 术后6wk处死裸鼠，并解剖、拍照.
, http://www.100md.com
统计学处理 实验结果行t检验.
2 结果
2.1 ATRA对胃癌细胞粘附率的影响 经ATRA处理后MGc80-3细胞的粘附能力在早期有所升高，但没有统计学意义；处理80d后，细胞粘附于羊膜的能力显著下降(表1).
2.2 ATRA对胃癌细胞β-G活性的影响 ATRA既能有效降低MGc80-3细胞内β-G的活性，也能抑制细胞向外分泌β-G(表2).
表1 ATRA对胃癌细胞粘附率的影响 处理天数
粘附细胞数(×103/孔)
2h
4h
, 百拇医药
6h
0
18.8±4.3
29.2±3.5
40.3±4.5
5
21.4±3.7
30.7±3.2
42.4±5.3
10
20.3±3.8
28.8±5.0
, 百拇医药 42.0±7.6
30
20.3±4.3
27.8±6.0
38.0±4.0
80
9.8±2.4a
12.2±2.1a
17.8±3.3b
aP<0.05，bP<0.01，vs 对照组.
表2 ATRA对胃癌细胞β-G活性的影响
, 百拇医药
对照组
处理组
抑制率(%)
细胞
0.474±0.005
0.278±0.009b
41.4
培养液
0.121±0.004
0.076±0.004b
37.2
bP<0.01，vs 对照组.
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2.3 ATRA对胃癌细胞超微结构的影响 MGc80-3细胞表面微绒毛丰富，呈放射状；细胞内微丝少见. 经ATRA处理后细胞微绒毛缩短、甚至消失，细胞表面呈泡状突起；微丝增多，排列整齐，呈极性分布于细胞核两端(图1～4).
2.4 ATRA对nm23 mRNA表达的影响 经ATRA处理后MGc80-3细胞中nm23基因的mRNA表达水平明显降低(图5)，定量分析表明基因表达水平下降为50%(图6).
2.5 ATRA对胃癌细胞在裸小鼠中转移能力的作用ATRA能使脾包膜下移植瘤的成瘤率降低16.7%，并抑制脾移植瘤的生长和脾内肿瘤转移；能显著抑制移植瘤的肝转移，使裸鼠的肝转移率降低33.3%，转移瘤数的抑制率达94%. 对照组裸鼠肝脏的转移灶呈栗粒样密集分布，平均肝脏重量明显大于处理组(表3).
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图1 MGc80-3细胞微绒毛丰富，呈放射状 扫描电镜 图2 ATRA处理后MGc80-3细胞微绒毛缩短或消失，表面呈泡状突起 扫描电镜
图3 MGc80-3细胞内微丝(↑)少见 透射电镜 图4 ATRA处理后MGc80-3细胞微丝(↑)排列整齐，呈极性分布于核两端 透射电镜
图5 ATRA对nm23 mRNA表达的影响. 图6 nm23基因表达水平的定量分析.
表3 ATRA对胃癌细胞裸小鼠肝转移模型的作用 组别
成瘤率
脾瘤数
平均脾重
肝转移率
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肝瘤数
平均肝重
对照组
100.0%(6/6)
13
1.60±0.97
83.3%
(5/6)
134
3.15±1.03
处理组
83.3%(5/6)
5
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0.44±0.49a
50.0%
(3/6)
8
1.65±0.25b
aP<0.05，bP<0.01，vs 对照组.
3 讨论
细胞粘附能力对胚胎发育和维持正常组织的结构功能至关重要，细胞转化时细胞粘附能力发生异常而出现侵袭转移能力. 一般认为肿瘤细胞的同质性粘附降低，异质性粘附增强. Santos et al[6]用cisRA处理人前列腺癌细胞株LNCaP发现细胞对层粘连蛋白(LN)、纤维粘连蛋白(FN)和Ⅳ型胶元的粘附能力下降. 本研究表明，ATRA处理MGc80-3的早期，细胞粘附羊膜的能力有所增强，但无统计学意义. 处理80d后细胞的粘附能力显著下降(表1). 说明ATRA能抑制MGc80-3细胞的异质性粘附，但这可能是一晚期事件或在对转移的抑制中不起主要作用. 微绒毛的功能与细胞粘附能力密切相关，电镜下看到ATRA处理后MGc80-3细胞的微绒毛缩短、甚至消失，细胞表面呈泡状突起(图2)，这与细胞粘附能力的改变相符. 此外，细胞超微结构的改变还表现为微丝增多，呈极性分布，提示ATRA使处于解聚形式的微丝产生聚合并重新排列，从而影响细胞的运动. nm23基因对细胞骨架的形成和稳定有着重要作用，是一种转移相关基因[7]，多数研究表明nm23的表达水平与细胞转移能力呈负相关，但也有相反的报道，我们的Northern blot结果说明，ATRA在抑制胃癌细胞转移、使侵袭能力下降的同时，nm23基因的mRNA表达也下降，两者呈正相关.
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癌细胞侵袭、转移时必须穿越细胞外基质(ECM). 当癌细胞与ECM粘附后，首先要对ECM进行酶的降解，细胞才能移动. β-葡糖醛酸酶是粗面内质网合成的一种糖苷酶，能催化蛋白聚糖β-糖苷链的分解，破坏基底膜而促进肿瘤的侵袭和转移. 这种酶在转移能力高的低分化癌中表达水平升高[5]. 本结果表明ATRA能抑制MGc80-3细胞β-葡糖醛酸酶的活性，而且能减少细胞向外分泌β-葡糖醛酸酶而降低其侵袭力.
我们应用胃癌裸小鼠肝转移模型[8]进一步研究ATRA在体内对胃癌细胞转移的抑制作用. 术前先给裸鼠皮下注射CCl4，造成肝脏损害，再生中的肝细胞可分泌细胞生长因子等，以促进转移的细胞在肝脏中生长. 裸小鼠经灌入ATRA后，胃癌细胞脾包膜下移植瘤的成瘤率降低16.7%，脾移植瘤的生长受到抑制和脾内肿瘤转移数减少；ATRA还能显著抑制癌细胞的肝转移，使裸鼠的肝转移率降低33.3%，转移瘤数的抑制率达94%. 说明ATRA能显著抑制MGc80-3细胞的实验性肝转移.
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以上结果表明，ATRA能有效抑制胃癌细胞的转移侵袭能力，其可能机制是：①抑制胃癌细胞的生长、降低其致瘤性；②影响细胞的运动、粘附及对基质的降解；③改变细胞内与转移相关基因的表达.
陈玉强，男，1963-10-15生，福建省莆田市人，汉族. 1985年第二军医大学本科毕业，1991年第二军医大学硕士，1995年厦门大学生物系博士研究生，普通外科主治医师，主要从事胃癌诊断和治疗的研究，发表论文8篇.
*福建省自然科学基金资助，No.C96002.
通讯作者 陈玉强，361005，福建省厦门市，厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室.
*Supported by the Natural Science Foundation of Fujian Province
, http://www.100md.com
Correspondence to:CHEN Yu-Qiang, The State Lab for Tumor Cell Engineering of Xiamen University, Xiamen 361005, Fujian Province, China
Tel. +86*592*2185361
收稿日期 1998-07-07
4 参考文献
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3 Ryuto M, Jimi S, Ono M, Natio S, Nakayama Y, Yamada Y et al. All-trans-retinoic acid-dependent inhibition of E-cadherin-based cell adhesion with concomitant dephosphorylation of beta-catenin in metastatic human renal carcinoma. Japanese J Cancer Res, 1997;88(10):982-991
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7 Hsu JW, Hsu SL, Chu JJ, Liu MC, Chiang CD. Increased NM23: MTS1 ratio inversely correlated with metastasis behaviour in human lung squamous cell carcinoma. Anticancer Res, 1997;17(1A):407-411
8 杨善民，陈福，张长弓，顾星星，陈美玉. 人胃癌裸小鼠肝转移模型的建立. 中华肿瘤杂志，1993；15(3)：195-197, 百拇医药(陈玉强1，2 吴 乔1 陈正明1 苏文金1 陈 福1)