肝细胞癌P53，Bcl-2蛋白的表达和细胞凋亡*
作者：彭晓谋 彭文伟 陈 青 姚集鲁
单位：中山医科大学附属第三医院传染科 广东省广州市 510630
关键词：肝肿瘤；细胞凋亡；P53蛋白；Bcl-2蛋白；免疫组织化学
华人消化杂志981003 Apoptosis, Bcl-2 and P53 protein expressions in tissues from hepatocellular carcinoma*
PENG Xiao-Mou, PENG Wen-Wei, CHEN Qing and YAO Ji-Lu
Department of Infectious Diseases, Third Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Subject headings liver neoplasms; apoptosis; P53 protein; Bcl-2 protein; immunohistochemistry
Abstract
AIM To investigate apoptosis in HCC, and its relation to the expression of Bcl-2 and P53 protein.
METHODS In situ method was used to detect apoptosis. IHC was used to detect the expression of Bcl-2 and P53 proteins. Double staining was used to demonstrate the relationship between apoptosis and the expression of Bcl-2 or P53 protein.
, 百拇医药
RESULTS Apoptotic indexes were 3.63±1.96 and 10.63±3.64 (per 1000 cells) respectively in cancerous tissues and pericancerous tissues of 70 HCC cases. Positive rates of the expressions of Bcl-2 and mutant type P53 proteins were 22.9% and 42.9% respectively. Bcl-2 proteins mainly expressed in pericancerous tissues, and down-regulated apoptosis of hepatocyte. Mutant type P53 proteins, however, mainly expressed in cancerous tissues, and down-regulated apoptosis of cancer cells.
, http://www.100md.com
CONCLUSION Apoptosis of HCC cancer cells was weakened. The overexpressions of mutant type P53 proteins might be the main cause of it. Bcl-2 proteins might play an important role in maintaining the liver function of HCC patients.
中国图书资料分类号 R735.7
摘 要
目的 探讨肝细胞癌(HCC)中细胞凋亡情况及其与P53和Bcl-2蛋白表达的关系.
方法 细胞凋亡采用原位细胞凋亡检测法P53和Bcl-2蛋白表达采用免疫组化方法. 细胞凋亡与P53，Bcl-2蛋白表达的关系采用双标记法进行检测.
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结果 HCC 70例，癌组织和癌周组织中细胞凋亡指数(1000个细胞中)分别为3.6±2.0和10.6±3.6. Bcl-2和突变型P53蛋白检出率分别为22.9%和42.9%. Bcl-2主要表达在癌周组织中，抑制肝细胞凋亡；而P53则仅表达在癌组织，抑制癌细胞凋亡. 双染色显示细胞凋亡与P53或Bcl-2不同时在一个细胞中表达.
结论 HCC癌细胞凋亡减弱. 突变型P53蛋白是癌细胞凋亡减弱的主要原因，而Bcl-2则可能在维持HCC的肝脏功能方面具有重要作用.
0 引言
细胞凋亡(apoptosis)的异常参与了许多肿瘤的发生、发展过程[1]. p53和bcl-2基因在调节细胞凋亡过程中起重要作用[2，3]. 我国肝细胞癌(HCC)中p53基因的突变率达35%～50%[4,5]. HCC组织中P53蛋白表达的检出率为40%～60%. P53蛋白表达主要是由于基因突变而引起P53蛋白的T1/2延长造成的[6]. 然而，p53基因突变、突变型蛋白表达与细胞凋亡关系以及在HCC的发病机制的作用尚不清楚. 为此，我们将结合其拮抗基因bcl-2基因一起研究，对HCC组织和癌周组织中的细胞凋亡及其与P53，Bcl-2蛋白表达的关系作进一步研究.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 HCC手术切除标本70例，收集于本校附属一医院和肿瘤医院. 由有经验的病理专业人员小心分离出癌组织和癌周组织分别进行石蜡包埋切片. 原位细胞凋亡试剂盒(in situ cell death detection kit, AP)系德国BM公司产品. P53和Bcl-2 mAb及标记链霉亲合素生物素(LSAB)检测试剂盒均为Dako公司产品.
1.2 方法 ①原位细胞凋亡检测：石蜡组织切片常规脱蜡至水，经20mg/L蛋白酶K于37℃消化30min，PBS洗涤2次后，参照试剂盒加50μL TUNEL反应液于37℃孵育60min；PBS洗涤3次，加50μL转换-AP液于37℃孵育30min；PBS洗涤3次后，加50μL NBT/BCIP 底物于室温下显色10min；清洗后常规封片. 镜检：观察20个不同高倍视野，每视野计算250个细胞核，并据细胞总数和阳性细胞数计算出凋亡指数，以每1000个细胞中的阳性细胞数表示. ②免疫组织化学检测Bcl-2和P53蛋白：脱蜡组织切片先用10g/L胰蛋白酶消化20min，再经封闭液封闭30min，于30g/L H2O2中作用5min去除内源性过氧化物酶，加Bcl-2，P53 mAb或阴性对照于37℃孵育30min； TBS洗涤3次后，参照LSAB试剂盒进行操作，着色细胞数>1%者判断为阳性. ③细胞凋亡和免疫组化双标记染色：先进行Bcl-2或P53蛋白的免疫组化检测至DAB显色，再行蛋白酶K消化和原位细胞凋亡检测. 镜检：观察凋亡细胞本身及周围细胞表达Bcl-2或P53蛋白的情况.
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2 结果
2.1 细胞凋亡检测 凋亡细胞核被染成深紫色、致密(图1)癌组织中，凋亡细胞散在分布，个别表现为大片状. 癌周组织中，凋亡细胞主要为近汇管区的肝细胞，呈单个散在分布. 癌组织和癌周组织的细胞凋亡指数见表1.
2.2 免疫组织化学检测 P53蛋白阳性信号主要在癌细胞的胞核. 阳性细胞呈弥漫或片状分布. 典型的结果见图2A. Bcl-2蛋白主要在癌周组织中检出，以胞质型合并核膜型为主，呈弥漫或片状分布. 癌组织中为散在分布. 典型的结果见图2B. P53和Bcl-2蛋白在癌组织或癌周组织中的检出情况详见表2. P53和Bcl-2蛋白表达与细胞凋亡的关系见表2.
2.3 细胞凋亡和免疫组化双标记染色 同一份标本中可见凋亡与P53和Bcl-2表达. 但凋亡细胞均不表达P53或Bcl-2蛋白，典型的双标记染色结果见图2C.
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图1 HCC癌周组织中细胞凋亡的情况. A ×250倍；B ×625倍；C ×1000倍
图2 HCC癌周组织中P53，Bcl-2蛋白表达及其与细胞凋亡的关系. A ×1000倍；B ×625倍；C ×625倍
表1 癌组织和癌周组织中细胞凋亡和P53,Bcl-2蛋白表达情况(n=70) 组织
P53蛋白阳性(%)
Bcl-2蛋白阳性(%)
凋亡指数
癌
42.9b
1.4b
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3.6±2.0b
癌周
0.0
22.9
10.6±3.6
bP<0.01，vs 癌周组织.
表2 癌组织和癌周组织中P53及Bcl-2蛋白表达与细胞凋亡的关系 凋亡指数
P53蛋白
Bcl-2蛋白
-(n=40)
+(n=30)
, 百拇医药
-(n=54)
+(n=16)
CT
4.3±2.1
2.8±1.1b
3.8±2.0
3.0±1.7
PCT
10.1±3.0
10.8±4.0
11.4±4.1
8.2±2.8c
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bP<0.01, cP<0.05，vs 阴性组.
3 讨论
HCC是我国重要的恶性肿瘤. 然而，HCC的发病机制，特别是分子机制目前尚不清楚. 凋亡(apoptosis)在个体发育过程和成年人的组织生长过程中均具有重要性. 凋亡减弱是肿瘤的重要发生机制[1]. 我们发现HCC细胞凋亡指数显著低于癌周肝组织(P<0.01). 这一点可能是HCC恶性程度特别高的细胞水平机制. 由于p53基因在HCC中常表现为突变和杂合性丢失[4-7]，因而被广泛认为与HCC的发生机制密切相关. 野生型p53基因产物能抑制细胞由G1期进入S期而抑制细胞生长、启动细胞凋亡的作用. 突变型p53基因产物则失去上述作用，且获得对抗其他凋亡诱导剂的作用，如放射、抗肿瘤药物等[8，9]. 我们发现，采用IHC方法检测HCC中P53蛋白的阳性率为42.9%. P53蛋白阳性者的癌细胞凋亡指数均显著降低(P<0.01). 双染色显示，细胞凋亡与P53蛋白不同时在一个细胞中出现. 野生型P53蛋白的T1/2非常短，在细胞内的水平极低，IHC检测的P53蛋白主要为突变型P53蛋白. 因此，上述结果提示，HCC中p53基因的突变率较高，其突变型产物的抑制作用是HCC癌细胞凋亡减弱的重要分子机制. 这点与Zhao et al[3]研究显示的P53蛋白表达与细胞凋亡正相关的结论相反，其原因尚不清楚. 可能与标本差异和本研究检测的主要为突变型P53蛋白等有关.
, 百拇医药
bcl-2原癌基因能延长细胞的寿命，从而抑制凋亡的发生[10]. 我们发现，bcl-2基因表达的检出率较p53基因低，主要表达在癌周组织中，抑制癌周组织中 的肝细胞凋亡. 提示bcl-2基因在维持部分HCC患者的肝功能方面有重要作用.
彭晓谋，男，1963-10-28生，湖南省茶陵县人，汉族. 1985年湖南医科大学本科毕业，1988年湖南医科大学硕士，1996年中山医科大学博士，讲师，主要从事病毒性肝炎的实验研究工作，发表论文13篇.
*美国中华医学基金会(CMB)部分资助，Grant No.93-582.
通讯作者 彭晓谋，510630，中山医科大学附属第三医院传染科，广东省广州市石牌岗顶.
*Supported by the China Medical Board (CMB) of New York, Grant No.93-582.
, 百拇医药
Correspondence to:Dr. PENG Xiao-Mou, Department of Infectious Diseases, Third Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
Tel. +86*20*85516867， Fax. +86*20*87536401
收稿日期 1998-06-06
4 参考文献
1 Ameisen JC. Programmed cell death (apoptosis) and cell survival regulation: relevance to aids and cancer. AIDS, 1994;8(6):1197-1212
, http://www.100md.com
2 Terada T, Nakanuma Y. Expression of apoptosis, proliferating cell nuclear antigen, and apoptosis-related antigens (Bcl-2, C-myc, Fas, Lewis(y) and P53) in human cholangiocarcinomas and hepatocellular carcinomas. Pathol Int, 1996;46(10):764-770
3 Zhao M, Zimmermann A. Apoptosis in human hepatocellular carcinoma and in liver cell dysplasia is correlated with P53 protein immunoreactivity. J Clin Pathol, 1997;50(5):394-400
4 彭晓谋，彭文伟，周元平. 肝细胞癌患者中p53基因的突变研究. 中山医科大学学报，1997；18(4)：245-247
, 百拇医药
5 Hsu IC, Metcalf RA, Sun T, Welsh JA, Wang NJ, Harris CC. Mutational hotspot in the p53 gene in human hepatocellular carcinoma. Nature, 1991;350(6317):427-428
6 彭晓谋，彭文伟，姚集鲁. p53基因密码子249突变致肝细胞癌的机理研究. 胃肠病学和肝病学杂志，1997；6(3)：206-209
7 Hayashi H, Sugio K, Matsumata T, Adachi E, Takenaka K, Sugimachi K. The clinical significance of p53 gene mutation in hepatocellular carcinomas from Japan. Hepatology, 1995;22(6):1702-1707
, 百拇医药
8 EI-Deiry WS, Tokino T, Velculescu VE, Levy DB, Parsons R, Trent JM et al. WAF1, a potential mediator of P53 tumor suppression. Cell, 1993;75(3):817-825
9 Bardeesy N, Beckwith JB, Pelletier J. Clonal expansion and attenuated apoptosis in Wilms＇ tumors associated with p53 gene mutations. Cancer Res, 1995;55(1):215-219
10 Korsmeyer S. Bcl-2 initiates a new category of oncogenes: regulators of cell death. Blood, 1992;80(3):879-886, 百拇医药
单位：中山医科大学附属第三医院传染科 广东省广州市 510630
关键词：肝肿瘤；细胞凋亡；P53蛋白；Bcl-2蛋白；免疫组织化学
华人消化杂志981003 Apoptosis, Bcl-2 and P53 protein expressions in tissues from hepatocellular carcinoma*
PENG Xiao-Mou, PENG Wen-Wei, CHEN Qing and YAO Ji-Lu
Department of Infectious Diseases, Third Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Subject headings liver neoplasms; apoptosis; P53 protein; Bcl-2 protein; immunohistochemistry
Abstract
AIM To investigate apoptosis in HCC, and its relation to the expression of Bcl-2 and P53 protein.
METHODS In situ method was used to detect apoptosis. IHC was used to detect the expression of Bcl-2 and P53 proteins. Double staining was used to demonstrate the relationship between apoptosis and the expression of Bcl-2 or P53 protein.
, 百拇医药
RESULTS Apoptotic indexes were 3.63±1.96 and 10.63±3.64 (per 1000 cells) respectively in cancerous tissues and pericancerous tissues of 70 HCC cases. Positive rates of the expressions of Bcl-2 and mutant type P53 proteins were 22.9% and 42.9% respectively. Bcl-2 proteins mainly expressed in pericancerous tissues, and down-regulated apoptosis of hepatocyte. Mutant type P53 proteins, however, mainly expressed in cancerous tissues, and down-regulated apoptosis of cancer cells.
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CONCLUSION Apoptosis of HCC cancer cells was weakened. The overexpressions of mutant type P53 proteins might be the main cause of it. Bcl-2 proteins might play an important role in maintaining the liver function of HCC patients.
中国图书资料分类号 R735.7
摘 要
目的 探讨肝细胞癌(HCC)中细胞凋亡情况及其与P53和Bcl-2蛋白表达的关系.
方法 细胞凋亡采用原位细胞凋亡检测法P53和Bcl-2蛋白表达采用免疫组化方法. 细胞凋亡与P53，Bcl-2蛋白表达的关系采用双标记法进行检测.
, http://www.100md.com
结果 HCC 70例，癌组织和癌周组织中细胞凋亡指数(1000个细胞中)分别为3.6±2.0和10.6±3.6. Bcl-2和突变型P53蛋白检出率分别为22.9%和42.9%. Bcl-2主要表达在癌周组织中，抑制肝细胞凋亡；而P53则仅表达在癌组织，抑制癌细胞凋亡. 双染色显示细胞凋亡与P53或Bcl-2不同时在一个细胞中表达.
结论 HCC癌细胞凋亡减弱. 突变型P53蛋白是癌细胞凋亡减弱的主要原因，而Bcl-2则可能在维持HCC的肝脏功能方面具有重要作用.
0 引言
细胞凋亡(apoptosis)的异常参与了许多肿瘤的发生、发展过程[1]. p53和bcl-2基因在调节细胞凋亡过程中起重要作用[2，3]. 我国肝细胞癌(HCC)中p53基因的突变率达35%～50%[4,5]. HCC组织中P53蛋白表达的检出率为40%～60%. P53蛋白表达主要是由于基因突变而引起P53蛋白的T1/2延长造成的[6]. 然而，p53基因突变、突变型蛋白表达与细胞凋亡关系以及在HCC的发病机制的作用尚不清楚. 为此，我们将结合其拮抗基因bcl-2基因一起研究，对HCC组织和癌周组织中的细胞凋亡及其与P53，Bcl-2蛋白表达的关系作进一步研究.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 HCC手术切除标本70例，收集于本校附属一医院和肿瘤医院. 由有经验的病理专业人员小心分离出癌组织和癌周组织分别进行石蜡包埋切片. 原位细胞凋亡试剂盒(in situ cell death detection kit, AP)系德国BM公司产品. P53和Bcl-2 mAb及标记链霉亲合素生物素(LSAB)检测试剂盒均为Dako公司产品.
1.2 方法 ①原位细胞凋亡检测：石蜡组织切片常规脱蜡至水，经20mg/L蛋白酶K于37℃消化30min，PBS洗涤2次后，参照试剂盒加50μL TUNEL反应液于37℃孵育60min；PBS洗涤3次，加50μL转换-AP液于37℃孵育30min；PBS洗涤3次后，加50μL NBT/BCIP 底物于室温下显色10min；清洗后常规封片. 镜检：观察20个不同高倍视野，每视野计算250个细胞核，并据细胞总数和阳性细胞数计算出凋亡指数，以每1000个细胞中的阳性细胞数表示. ②免疫组织化学检测Bcl-2和P53蛋白：脱蜡组织切片先用10g/L胰蛋白酶消化20min，再经封闭液封闭30min，于30g/L H2O2中作用5min去除内源性过氧化物酶，加Bcl-2，P53 mAb或阴性对照于37℃孵育30min； TBS洗涤3次后，参照LSAB试剂盒进行操作，着色细胞数>1%者判断为阳性. ③细胞凋亡和免疫组化双标记染色：先进行Bcl-2或P53蛋白的免疫组化检测至DAB显色，再行蛋白酶K消化和原位细胞凋亡检测. 镜检：观察凋亡细胞本身及周围细胞表达Bcl-2或P53蛋白的情况.
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2 结果
2.1 细胞凋亡检测 凋亡细胞核被染成深紫色、致密(图1)癌组织中，凋亡细胞散在分布，个别表现为大片状. 癌周组织中，凋亡细胞主要为近汇管区的肝细胞，呈单个散在分布. 癌组织和癌周组织的细胞凋亡指数见表1.
2.2 免疫组织化学检测 P53蛋白阳性信号主要在癌细胞的胞核. 阳性细胞呈弥漫或片状分布. 典型的结果见图2A. Bcl-2蛋白主要在癌周组织中检出，以胞质型合并核膜型为主，呈弥漫或片状分布. 癌组织中为散在分布. 典型的结果见图2B. P53和Bcl-2蛋白在癌组织或癌周组织中的检出情况详见表2. P53和Bcl-2蛋白表达与细胞凋亡的关系见表2.
2.3 细胞凋亡和免疫组化双标记染色 同一份标本中可见凋亡与P53和Bcl-2表达. 但凋亡细胞均不表达P53或Bcl-2蛋白，典型的双标记染色结果见图2C.
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图1 HCC癌周组织中细胞凋亡的情况. A ×250倍；B ×625倍；C ×1000倍
图2 HCC癌周组织中P53，Bcl-2蛋白表达及其与细胞凋亡的关系. A ×1000倍；B ×625倍；C ×625倍
表1 癌组织和癌周组织中细胞凋亡和P53,Bcl-2蛋白表达情况(n=70) 组织
P53蛋白阳性(%)
Bcl-2蛋白阳性(%)
凋亡指数
癌
42.9b
1.4b
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3.6±2.0b
癌周
0.0
22.9
10.6±3.6
bP<0.01，vs 癌周组织.
表2 癌组织和癌周组织中P53及Bcl-2蛋白表达与细胞凋亡的关系 凋亡指数
P53蛋白
Bcl-2蛋白
-(n=40)
+(n=30)
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-(n=54)
+(n=16)
CT
4.3±2.1
2.8±1.1b
3.8±2.0
3.0±1.7
PCT
10.1±3.0
10.8±4.0
11.4±4.1
8.2±2.8c
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bP<0.01, cP<0.05，vs 阴性组.
3 讨论
HCC是我国重要的恶性肿瘤. 然而，HCC的发病机制，特别是分子机制目前尚不清楚. 凋亡(apoptosis)在个体发育过程和成年人的组织生长过程中均具有重要性. 凋亡减弱是肿瘤的重要发生机制[1]. 我们发现HCC细胞凋亡指数显著低于癌周肝组织(P<0.01). 这一点可能是HCC恶性程度特别高的细胞水平机制. 由于p53基因在HCC中常表现为突变和杂合性丢失[4-7]，因而被广泛认为与HCC的发生机制密切相关. 野生型p53基因产物能抑制细胞由G1期进入S期而抑制细胞生长、启动细胞凋亡的作用. 突变型p53基因产物则失去上述作用，且获得对抗其他凋亡诱导剂的作用，如放射、抗肿瘤药物等[8，9]. 我们发现，采用IHC方法检测HCC中P53蛋白的阳性率为42.9%. P53蛋白阳性者的癌细胞凋亡指数均显著降低(P<0.01). 双染色显示，细胞凋亡与P53蛋白不同时在一个细胞中出现. 野生型P53蛋白的T1/2非常短，在细胞内的水平极低，IHC检测的P53蛋白主要为突变型P53蛋白. 因此，上述结果提示，HCC中p53基因的突变率较高，其突变型产物的抑制作用是HCC癌细胞凋亡减弱的重要分子机制. 这点与Zhao et al[3]研究显示的P53蛋白表达与细胞凋亡正相关的结论相反，其原因尚不清楚. 可能与标本差异和本研究检测的主要为突变型P53蛋白等有关.
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bcl-2原癌基因能延长细胞的寿命，从而抑制凋亡的发生[10]. 我们发现，bcl-2基因表达的检出率较p53基因低，主要表达在癌周组织中，抑制癌周组织中 的肝细胞凋亡. 提示bcl-2基因在维持部分HCC患者的肝功能方面有重要作用.
彭晓谋，男，1963-10-28生，湖南省茶陵县人，汉族. 1985年湖南医科大学本科毕业，1988年湖南医科大学硕士，1996年中山医科大学博士，讲师，主要从事病毒性肝炎的实验研究工作，发表论文13篇.
*美国中华医学基金会(CMB)部分资助，Grant No.93-582.
通讯作者 彭晓谋，510630，中山医科大学附属第三医院传染科，广东省广州市石牌岗顶.
*Supported by the China Medical Board (CMB) of New York, Grant No.93-582.
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Correspondence to:Dr. PENG Xiao-Mou, Department of Infectious Diseases, Third Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
Tel. +86*20*85516867， Fax. +86*20*87536401
收稿日期 1998-06-06
4 参考文献
1 Ameisen JC. Programmed cell death (apoptosis) and cell survival regulation: relevance to aids and cancer. AIDS, 1994;8(6):1197-1212
, http://www.100md.com
2 Terada T, Nakanuma Y. Expression of apoptosis, proliferating cell nuclear antigen, and apoptosis-related antigens (Bcl-2, C-myc, Fas, Lewis(y) and P53) in human cholangiocarcinomas and hepatocellular carcinomas. Pathol Int, 1996;46(10):764-770
3 Zhao M, Zimmermann A. Apoptosis in human hepatocellular carcinoma and in liver cell dysplasia is correlated with P53 protein immunoreactivity. J Clin Pathol, 1997;50(5):394-400
4 彭晓谋，彭文伟，周元平. 肝细胞癌患者中p53基因的突变研究. 中山医科大学学报，1997；18(4)：245-247
, 百拇医药
5 Hsu IC, Metcalf RA, Sun T, Welsh JA, Wang NJ, Harris CC. Mutational hotspot in the p53 gene in human hepatocellular carcinoma. Nature, 1991;350(6317):427-428
6 彭晓谋，彭文伟，姚集鲁. p53基因密码子249突变致肝细胞癌的机理研究. 胃肠病学和肝病学杂志，1997；6(3)：206-209
7 Hayashi H, Sugio K, Matsumata T, Adachi E, Takenaka K, Sugimachi K. The clinical significance of p53 gene mutation in hepatocellular carcinomas from Japan. Hepatology, 1995;22(6):1702-1707
, 百拇医药
8 EI-Deiry WS, Tokino T, Velculescu VE, Levy DB, Parsons R, Trent JM et al. WAF1, a potential mediator of P53 tumor suppression. Cell, 1993;75(3):817-825
9 Bardeesy N, Beckwith JB, Pelletier J. Clonal expansion and attenuated apoptosis in Wilms＇ tumors associated with p53 gene mutations. Cancer Res, 1995;55(1):215-219
10 Korsmeyer S. Bcl-2 initiates a new category of oncogenes: regulators of cell death. Blood, 1992;80(3):879-886, 百拇医药