人肝癌裸鼠转移模型中纤溶酶原激活物抑制剂变化与肝癌生物学特性
作者：郑起 汤钊猷 薛琼
单位：200032 上海医科大学中山医院肝癌研究所(郑起 现在上海市第六人民医院普外科，200233)
关键词：纤溶酶原激活物抑制物1；肝肿瘤；淋巴细胞，肿瘤浸润；肿瘤转移
中华外科杂志981116 【摘要】 目的 研究纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)与肝细胞癌(HCC)生物学特性的关系。 方法 构建LCI-D20人肝细胞癌裸鼠转移模型(肝癌转移模型)40例，用PAI-1试剂盒和PAI-1单抗分别做酶活性检测和免疫组化，观测肝癌转移模型发展过程中PAI-1的变化。 结果 肝癌转移模型从肿瘤发生早期(2周)至晚期(5周),血浆PAI-1从6.2±1.8 Au/ml增至15.4±0.7 Au/ml,P<0.05。肿瘤组织中PAI-1从0.4±0.1 Au/mg增至0.8±0.3 Au/mg；血浆中PAI-1改变与肿瘤大小和AFP变化相关(r=0.9648和r=0.9544，P<0.05和P<0.05)。 结论 肝癌转移模型肿瘤组织及血浆中PAI-1随HCC病程进展逐步升高。PAI-1与HCC肿瘤增长和AFP升高有良好的相关性。PAI-1与HCC侵袭性及预后密切相关。
, http://www.100md.com
Changes of PAI-1 and biological behaviour of human hepatocellular carcinoma in metastatic model of nude mice Zheng Qi, Tang Zhaoyou, Xue Qiong. Liver Cancer Institute,Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032.
【Abstract】 Objective To study the relationship between plasminogen activator inhibitor type-1 (PAI-1) and biological behaviour of hepatocellular carcinoma (HCC). Method 40 nude mice with LCI-D20 metastatic modes of human HCC (MMHCC) were established. The change of PAI-1 was determined by PAI-1 kit and immunohistochemistry with monoclonal antibody against PAI-1 in MMHCC progression. Result Following MMHCC progression from early to advanced stage, PAI-1 increased from 6.2±1.8 Au/ml to 15.4±0.7 Au/ml in plasma (P<0.05), from 0.4±0.1 Au/mg to 0.8±0.3 Au/mg in extract (P<0.05).The correlation between PAI-1 and tumor size and AFP level was strong (r=0.9648 and r=0.9544, P<0.05 and P<0.05). Conclusion PAI-1 was increased gradually following tumor progression in MMHCC. PAI-1 correlated with tumor size and AFP level. PAI-1 related well with the invasiveness and prognosis of HCC.
, 百拇医药
【Key words】 Plasminogen activator inhibitor 1 Liver neoplasms Lymphocytes,tumor-infiltrating Neoplasm metastasis
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)和许多恶性肿瘤一样，尽管肿瘤切除能提高患者生存期，但转移复发率高仍然是HCC疗效不佳的重要原因。研究表明，纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor type-1, PAI-1) 在一些恶性肿瘤中有过量表达并与肿瘤侵袭生物学特性密切相关。本研究目的是检测LCI-D20人肝细胞癌裸鼠转移模型(简称：肝癌转移模型)中PAI-1的变化，研究PAI-1与HCC浸润转移及预后的关系。
材料与方法
1.实验动物及分组：取上海医科大学肝癌研究所肝癌转移模型裸鼠作为癌株供体，中国科学院上海分院药物研究所BALB/CA 4周龄裸小鼠作为肝癌转移模型受体，构建肝癌转移模型40只，随机分成4组，每组10只。分别于肿瘤移植术后2、3、4和5周解剖相应组别的裸鼠。另取正常裸鼠10只做血浆对照组。
, 百拇医药
2.实验方法：检测各组血清AFP值，分别留取各组血浆和组织样品(肝肿瘤、腹壁浸润灶和肺组织)，组织样品分别做成蜡块和-70℃冻存。取冻存组织0.5g加入0.5 ml裂解液做成匀浆，低温离心取上清液待测。取人肝血管瘤瘤周组织作正常肝组织对照。蜡块组织常规病理检查，用PAI-1单抗免疫组化ABC法检测组织切片中PAI-1的表达。用PAI-1试剂盒(上海医科大学分子遗传学研究室提供)检测血浆和肿瘤组织匀浆中PAI-1水平。用BIO-RAD 3550-UV酶标仪测定，获血浆PAI-1值(Au/ml)，组织匀浆用Hratree法蛋白定量得PAI-1值(Au/mg)。
3.统计方法：用SAS6.11软件统计处理, 方差分析，相关性分析，t检验和卡方检验。
结果
各组一般资料见表1。
表1 肝癌转移模型分组一般资料(
±s) 分 组
, 百拇医药
例数
接种体重
(g)
解剖体重
(g)
肿瘤大小
(cm)
腹壁浸润
(例)
肝内转移
(例)
肺部转移
(例)
, 百拇医药
血清AFP
(ng/ml)
对照组
10…
24.7±1.1…………
0.0±0
2周组
10
20.6±1.3
24.1±2.2
0.4±0.1
0
0
, 百拇医药
0
19.3±14.8
3周组
10
20.1±1.3
24.0±1.1
0.9±0.3
5
2
0
182.7±178.9
4周组
10
, 百拇医药
20.5±1.5
24.0±2.7
2.1±0.5
9
7
7
419.9±250.4
5周组
7
20.4±1.4
21.1±1.3
3.2±0.2
7
, 百拇医药
7
7
1 047.3±282.7
1.肝癌转移模型基本特征：肝肿瘤在2周内生长缓慢，2周组肿瘤大小为0.4±0.1 cm，AFP为19.3±14.8 ng/ml。3周后肿瘤生长和血清AFP升高呈直线递增，开始出现肿瘤转移。4周时腹壁浸润、肝内转移和肺转移率分别为90%、70%和70%。第5周时各项指标达最高峰，肿瘤平均3.2±0.2 cm，AFP平均为1047.3±282.7 ng/ml，肿瘤局部浸润和远处转移率达100%，宿主出现血性腹水和明显消瘦等恶病质表现，5周组病死率明显增加。
2.血浆中PAI-1检测结果：对照组PAI-1平均值是6.5±2.7 Au/ml，肝癌转移模型表现为肿瘤移植后最初2周PAI-1在正常范围。从第3周起，随着肿瘤的快速增大和肿瘤浸润转移率的增加，PAI-1也随之逐渐增高，在肿瘤晚期(第5周)达15.4±0.7 Au/ml(表2)。第3、4和5周组与第2周组比较差异均有显著性意义，P<0.05。血浆PAI-1变化与AFP和肿瘤大小的变化有良好相关性，相关系数分别为r=0.9544和r=0.9648(P<0.05和P<0.05)。
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3.肿瘤组织中PAI-1变化：组织匀浆中PAI-1变化与血浆中的表现相似(表2)，肿瘤早期PAI-1与正常肝组织无明显区别，肿瘤晚期PAI-1明显升高，其中第2周与第5周组比较为0.4±0.1比0.8±0.3 Au/mg，P<0.05。肿瘤晚期腹壁浸润灶中PAI-1与初期腹壁浸润灶比较也明显升高，第4周与第5周比较为0.3±0.01 Au/mg比0.8±0.3 Au/mg，P<0.05。
表2 肝癌转移模型不同阶段PAI-1变化(±s) 分 组
例数
血浆PAI-1(Au/ml)
组织PAI-1(Au/mg)
对照组
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10
6.5±2.7
0.4±0.1
2周组
10
6.2±1.8
0.4±0.1
3周组
10
9.8±1.8*△
0.5±0.1*△
4周组
, 百拇医药
10
11.4±2.3*△
0.5±0.1*△
5周组
7
15.4±0.7*△★
0.8±0.3*△★
注*与对照组比；△与2周组比；★5周组与各组比，P<0.05。 4.免疫组化结果：以细胞膜染色阳性为标准，肿瘤组织PAI-1阳性率明显高于癌周和正常肝组织，58例肿瘤组织(包括37例原发癌灶和21例腹壁转移灶)中PAI-1阳性率为44.8%(26/58)，癌周组织为8.6%(5/58)，两组比较，P<0.001。其中第2周组癌组织PAI-1阳性为0，第3周组和第4周组分别为53.3%(8/15)和57.9%(11/19)，而第5周高达71.4%(10/14)，第3、4和5周与2周组比较差异有显著性意义，P<0.05。
, 百拇医药
讨论
肝癌转移模型展现了HCC发生发展的基本特征，具有较稳定的高转移特性[1]。本研究利用该模型观察分析了PAI-1在HCC进展过程中的变化，结果发现，肝癌转移模型血浆和肿瘤组织中PAI-1随着肿瘤增大和AFP的升高以及肿瘤浸润转移和宿主病死率的增加而逐步升高，在肿瘤晚期达到一个较高水平。提示PAI-1与HCC病程发展及浸润转移密切相关。
研究表明，尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator, uPA)介导的纤维蛋白溶解与肿瘤浸润转移时细胞外基质降解密切相关[2]，作为uPA抑制剂的PAI-1在此过程中的作用并不清楚。有研究发现uPA高表达的恶性肿瘤PAI-1的表达也明显升高，PAI-1的升高与恶性肿瘤浸润转移和预后密切相关[3]；并提示PAI-1对恶性肿瘤侵袭性有重要的调节作用。这种调节作用的可能途径是：PAI-1与uPA及其受体(uPAR)结合形成复合物，肿瘤细胞对复合物产生内吞效应，使uPA在溶酶体中降解，而uPAR被再循环至细胞表面，此过程可调节uPA分泌的变化，调节uPAR在细胞表面的表达，为此PAI-1有促进肿瘤细胞表面纤溶酶激活机制产生功能性循环的作用[4]。
, 百拇医药
Keeton等报道,在恶性脑肿瘤中PAI-1表达明显升高，用原位杂交法发现PAI-1 mRNA主要位于肿瘤组织血管内皮细胞。Grondahl-Hansen也报道PAI-1与肿瘤血管生成有关，并认为PAI-1是肿瘤血管生成的生化标志物[3]。我们发现PAI-1与肿瘤大小有良好的相关性，免疫组化结果也表明在肿瘤血管内皮细胞有PAI-1表达，提示PAI-1可能与肿瘤增长时的血管生成或血管增生有关。
文献报道高水平的PAI-1与恶性肿瘤预后较差有关。有作者认为PAI-1的升高是肿瘤扩散的标志[5]。这与我们肝癌转移模型晚期PAI-1明显升高的结果是一致的。实验还表明PAI-1与AFP有良好的相关性，提示PAI-1对HCC临床诊断和预测预后有参考价值。
本课题受美国中华医学基金会基金及上海市领先专业基金资助
参考文献
, http://www.100md.com
1 孙方宪，汤钊猷，刘康达，等.裸鼠人肝癌原位移植转移模型的生长特性及转移潜能.中华医学杂志，1995, 75：673-675.
2 Dano K, Andreason PA, Grondahl-Hansen J, et al. Plasminogen activators, tissue degradation, and cancer. Adv Cancer Res, 1985,44:139-266.
3 Grondahl-Hansen J, Christensen IJ, Rosenquist C, et al. High levels of urokinase-type plasminogen activitor and its inhibitor PAI-1 in cytosolic exstacts of breast carcinomas are associated with poor prognosis. Cancer Res, 1993,53:2513-2521.
, 百拇医药
4 Mohanam S, Sawaya RE, Yamamoto M, et al. Proteolysis and invasiveness of brain tumor: Role of urokinase-type plasminogen activator receptor. J Neuro Oncology, 1994,22:153-160.
5 Kuhn W, Pache L, Schmalfeldt B, et al. Urokinase(uPA) and PAI-1 predict survival in advanced ovarian cancer patients (FIGO III) after radical surgery and platinum-based chemotherapy. Gynecologic Oncology, 1994,55:401-409.
(收稿：1997-09-30 修回：1998-06-20), 百拇医药
单位：200032 上海医科大学中山医院肝癌研究所(郑起 现在上海市第六人民医院普外科，200233)
关键词：纤溶酶原激活物抑制物1；肝肿瘤；淋巴细胞，肿瘤浸润；肿瘤转移
中华外科杂志981116 【摘要】 目的 研究纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)与肝细胞癌(HCC)生物学特性的关系。 方法 构建LCI-D20人肝细胞癌裸鼠转移模型(肝癌转移模型)40例，用PAI-1试剂盒和PAI-1单抗分别做酶活性检测和免疫组化，观测肝癌转移模型发展过程中PAI-1的变化。 结果 肝癌转移模型从肿瘤发生早期(2周)至晚期(5周),血浆PAI-1从6.2±1.8 Au/ml增至15.4±0.7 Au/ml,P<0.05。肿瘤组织中PAI-1从0.4±0.1 Au/mg增至0.8±0.3 Au/mg；血浆中PAI-1改变与肿瘤大小和AFP变化相关(r=0.9648和r=0.9544，P<0.05和P<0.05)。 结论 肝癌转移模型肿瘤组织及血浆中PAI-1随HCC病程进展逐步升高。PAI-1与HCC肿瘤增长和AFP升高有良好的相关性。PAI-1与HCC侵袭性及预后密切相关。
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Changes of PAI-1 and biological behaviour of human hepatocellular carcinoma in metastatic model of nude mice Zheng Qi, Tang Zhaoyou, Xue Qiong. Liver Cancer Institute,Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032.
【Abstract】 Objective To study the relationship between plasminogen activator inhibitor type-1 (PAI-1) and biological behaviour of hepatocellular carcinoma (HCC). Method 40 nude mice with LCI-D20 metastatic modes of human HCC (MMHCC) were established. The change of PAI-1 was determined by PAI-1 kit and immunohistochemistry with monoclonal antibody against PAI-1 in MMHCC progression. Result Following MMHCC progression from early to advanced stage, PAI-1 increased from 6.2±1.8 Au/ml to 15.4±0.7 Au/ml in plasma (P<0.05), from 0.4±0.1 Au/mg to 0.8±0.3 Au/mg in extract (P<0.05).The correlation between PAI-1 and tumor size and AFP level was strong (r=0.9648 and r=0.9544, P<0.05 and P<0.05). Conclusion PAI-1 was increased gradually following tumor progression in MMHCC. PAI-1 correlated with tumor size and AFP level. PAI-1 related well with the invasiveness and prognosis of HCC.
, 百拇医药
【Key words】 Plasminogen activator inhibitor 1 Liver neoplasms Lymphocytes,tumor-infiltrating Neoplasm metastasis
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)和许多恶性肿瘤一样，尽管肿瘤切除能提高患者生存期，但转移复发率高仍然是HCC疗效不佳的重要原因。研究表明，纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor type-1, PAI-1) 在一些恶性肿瘤中有过量表达并与肿瘤侵袭生物学特性密切相关。本研究目的是检测LCI-D20人肝细胞癌裸鼠转移模型(简称：肝癌转移模型)中PAI-1的变化，研究PAI-1与HCC浸润转移及预后的关系。
材料与方法
1.实验动物及分组：取上海医科大学肝癌研究所肝癌转移模型裸鼠作为癌株供体，中国科学院上海分院药物研究所BALB/CA 4周龄裸小鼠作为肝癌转移模型受体，构建肝癌转移模型40只，随机分成4组，每组10只。分别于肿瘤移植术后2、3、4和5周解剖相应组别的裸鼠。另取正常裸鼠10只做血浆对照组。
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2.实验方法：检测各组血清AFP值，分别留取各组血浆和组织样品(肝肿瘤、腹壁浸润灶和肺组织)，组织样品分别做成蜡块和-70℃冻存。取冻存组织0.5g加入0.5 ml裂解液做成匀浆，低温离心取上清液待测。取人肝血管瘤瘤周组织作正常肝组织对照。蜡块组织常规病理检查，用PAI-1单抗免疫组化ABC法检测组织切片中PAI-1的表达。用PAI-1试剂盒(上海医科大学分子遗传学研究室提供)检测血浆和肿瘤组织匀浆中PAI-1水平。用BIO-RAD 3550-UV酶标仪测定，获血浆PAI-1值(Au/ml)，组织匀浆用Hratree法蛋白定量得PAI-1值(Au/mg)。
3.统计方法：用SAS6.11软件统计处理, 方差分析，相关性分析，t检验和卡方检验。
结果
各组一般资料见表1。
表1 肝癌转移模型分组一般资料(
±s) 分 组, 百拇医药
例数
接种体重
(g)
解剖体重
(g)
肿瘤大小
(cm)
腹壁浸润
(例)
肝内转移
(例)
肺部转移
(例)
, 百拇医药
血清AFP
(ng/ml)
对照组
10…
24.7±1.1…………
0.0±0
2周组
10
20.6±1.3
24.1±2.2
0.4±0.1
0
0
, 百拇医药
0
19.3±14.8
3周组
10
20.1±1.3
24.0±1.1
0.9±0.3
5
2
0
182.7±178.9
4周组
10
, 百拇医药
20.5±1.5
24.0±2.7
2.1±0.5
9
7
7
419.9±250.4
5周组
7
20.4±1.4
21.1±1.3
3.2±0.2
7
, 百拇医药
7
7
1 047.3±282.7
1.肝癌转移模型基本特征：肝肿瘤在2周内生长缓慢，2周组肿瘤大小为0.4±0.1 cm，AFP为19.3±14.8 ng/ml。3周后肿瘤生长和血清AFP升高呈直线递增，开始出现肿瘤转移。4周时腹壁浸润、肝内转移和肺转移率分别为90%、70%和70%。第5周时各项指标达最高峰，肿瘤平均3.2±0.2 cm，AFP平均为1047.3±282.7 ng/ml，肿瘤局部浸润和远处转移率达100%，宿主出现血性腹水和明显消瘦等恶病质表现，5周组病死率明显增加。
2.血浆中PAI-1检测结果：对照组PAI-1平均值是6.5±2.7 Au/ml，肝癌转移模型表现为肿瘤移植后最初2周PAI-1在正常范围。从第3周起，随着肿瘤的快速增大和肿瘤浸润转移率的增加，PAI-1也随之逐渐增高，在肿瘤晚期(第5周)达15.4±0.7 Au/ml(表2)。第3、4和5周组与第2周组比较差异均有显著性意义，P<0.05。血浆PAI-1变化与AFP和肿瘤大小的变化有良好相关性，相关系数分别为r=0.9544和r=0.9648(P<0.05和P<0.05)。
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3.肿瘤组织中PAI-1变化：组织匀浆中PAI-1变化与血浆中的表现相似(表2)，肿瘤早期PAI-1与正常肝组织无明显区别，肿瘤晚期PAI-1明显升高，其中第2周与第5周组比较为0.4±0.1比0.8±0.3 Au/mg，P<0.05。肿瘤晚期腹壁浸润灶中PAI-1与初期腹壁浸润灶比较也明显升高，第4周与第5周比较为0.3±0.01 Au/mg比0.8±0.3 Au/mg，P<0.05。
表2 肝癌转移模型不同阶段PAI-1变化(
±s) 分 组例数
血浆PAI-1(Au/ml)
组织PAI-1(Au/mg)
对照组
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10
6.5±2.7
0.4±0.1
2周组
10
6.2±1.8
0.4±0.1
3周组
10
9.8±1.8*△
0.5±0.1*△
4周组
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10
11.4±2.3*△
0.5±0.1*△
5周组
7
15.4±0.7*△★
0.8±0.3*△★
注*与对照组比；△与2周组比；★5周组与各组比，P<0.05。 4.免疫组化结果：以细胞膜染色阳性为标准，肿瘤组织PAI-1阳性率明显高于癌周和正常肝组织，58例肿瘤组织(包括37例原发癌灶和21例腹壁转移灶)中PAI-1阳性率为44.8%(26/58)，癌周组织为8.6%(5/58)，两组比较，P<0.001。其中第2周组癌组织PAI-1阳性为0，第3周组和第4周组分别为53.3%(8/15)和57.9%(11/19)，而第5周高达71.4%(10/14)，第3、4和5周与2周组比较差异有显著性意义，P<0.05。
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讨论
肝癌转移模型展现了HCC发生发展的基本特征，具有较稳定的高转移特性[1]。本研究利用该模型观察分析了PAI-1在HCC进展过程中的变化，结果发现，肝癌转移模型血浆和肿瘤组织中PAI-1随着肿瘤增大和AFP的升高以及肿瘤浸润转移和宿主病死率的增加而逐步升高，在肿瘤晚期达到一个较高水平。提示PAI-1与HCC病程发展及浸润转移密切相关。
研究表明，尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator, uPA)介导的纤维蛋白溶解与肿瘤浸润转移时细胞外基质降解密切相关[2]，作为uPA抑制剂的PAI-1在此过程中的作用并不清楚。有研究发现uPA高表达的恶性肿瘤PAI-1的表达也明显升高，PAI-1的升高与恶性肿瘤浸润转移和预后密切相关[3]；并提示PAI-1对恶性肿瘤侵袭性有重要的调节作用。这种调节作用的可能途径是：PAI-1与uPA及其受体(uPAR)结合形成复合物，肿瘤细胞对复合物产生内吞效应，使uPA在溶酶体中降解，而uPAR被再循环至细胞表面，此过程可调节uPA分泌的变化，调节uPAR在细胞表面的表达，为此PAI-1有促进肿瘤细胞表面纤溶酶激活机制产生功能性循环的作用[4]。
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Keeton等报道,在恶性脑肿瘤中PAI-1表达明显升高，用原位杂交法发现PAI-1 mRNA主要位于肿瘤组织血管内皮细胞。Grondahl-Hansen也报道PAI-1与肿瘤血管生成有关，并认为PAI-1是肿瘤血管生成的生化标志物[3]。我们发现PAI-1与肿瘤大小有良好的相关性，免疫组化结果也表明在肿瘤血管内皮细胞有PAI-1表达，提示PAI-1可能与肿瘤增长时的血管生成或血管增生有关。
文献报道高水平的PAI-1与恶性肿瘤预后较差有关。有作者认为PAI-1的升高是肿瘤扩散的标志[5]。这与我们肝癌转移模型晚期PAI-1明显升高的结果是一致的。实验还表明PAI-1与AFP有良好的相关性，提示PAI-1对HCC临床诊断和预测预后有参考价值。
本课题受美国中华医学基金会基金及上海市领先专业基金资助
参考文献
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1 孙方宪，汤钊猷，刘康达，等.裸鼠人肝癌原位移植转移模型的生长特性及转移潜能.中华医学杂志，1995, 75：673-675.
2 Dano K, Andreason PA, Grondahl-Hansen J, et al. Plasminogen activators, tissue degradation, and cancer. Adv Cancer Res, 1985,44:139-266.
3 Grondahl-Hansen J, Christensen IJ, Rosenquist C, et al. High levels of urokinase-type plasminogen activitor and its inhibitor PAI-1 in cytosolic exstacts of breast carcinomas are associated with poor prognosis. Cancer Res, 1993,53:2513-2521.
, 百拇医药
4 Mohanam S, Sawaya RE, Yamamoto M, et al. Proteolysis and invasiveness of brain tumor: Role of urokinase-type plasminogen activator receptor. J Neuro Oncology, 1994,22:153-160.
5 Kuhn W, Pache L, Schmalfeldt B, et al. Urokinase(uPA) and PAI-1 predict survival in advanced ovarian cancer patients (FIGO III) after radical surgery and platinum-based chemotherapy. Gynecologic Oncology, 1994,55:401-409.
(收稿：1997-09-30 修回：1998-06-20), 百拇医药