低密度脂蛋白受体基因AvaⅡ位点多态性及其与血清胆固醇水平的关系
作者：郑芳 周新 崔天盆 徐红
单位：430071 武汉，湖北医科大学附属第二医院检验科(郑芳、周新、崔天盆)；湖北省恩施州医院检验科(徐红)
关键词：
中华医学杂志981111 已知低密度脂蛋白受体(LDL-R)基因突变会导致个体患家族性高胆固醇血症(FH)[1]。为探讨LDL-R基因AvaⅡ位点多态性对人群中血清胆固醇水平的影响，我们对LDL-R基因多态性与胆固醇水平的关系进行了研究。
一、对象与方法
1.对象：(1)正常血脂组81例，总胆固醇(TC)<5.20 mmol/L，甘油三酯(TG)<1.70 mmol/L，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)<3.12 mmol/L，HDL-C>1.04 mmol/L，Lp(a)<300 mg/L。随机选自体检健康者。男44例，女37例，年龄21～86岁，平均50岁。(2)高脂血症组51例(TC>5.72 mmol/L，TG>1.70 mmol/L，LDL-C>3.64 mmol/L，Lp(a)>300 mg/L)，均为本院门诊及住院患者，男23例，女28例，年龄30～82岁，平均56岁。
, 百拇医药
2.方法：用改良碘化钠法[2]提取基因组DNA。参照文献[3]设计2对引物，序列分别为P1：5′GTCATCTTCCTTGCTGCCTGTTTAG3′和P2：5′GGTTCCACAAGGAGGTTTCAAGGTT3′。PCR反应条件为：预变性，95 ℃5分钟，然后按95 ℃变性1分钟，68 ℃退火2分钟，72 ℃延伸1分钟循环28次。末次循环后72 ℃延伸5分钟。取10 μl扩增产物，加入2 μl 10×buffer，7 μl无菌双蒸水，10 U/μl的AvaⅡ限制性内切酶1 μl。37 ℃消化3小时左右。酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定，以复华小分子量Marker为DNA片段长度标准物。并对各研究对象进行血脂、脂蛋白的测定。
3.统计学处理：基因频率采用基因计数法计算；采用方差分析和卡方检验的方法进行组间基因频率和血清脂质的比较。
二、结果
, 百拇医药
1.LDL-R基因外显子13的AvaⅡ酶切片段：本研究所得LDL-R基因13外显子AvaⅡ酶切片段有3种，分子量分别为228 bp、141 bp、87 bp。等位基因如有AvaⅡ酶切位点，得到141 bp和87 bp的酶切片段(等位基因+)；无AvaⅡ酶切位点的等位基因只能得到一条228 bp的带(等位基因-)，则基因型有3种：-/-、+/-及+/+(附图)。
M.DNA分子量标准；1.扩增产物 ；2.-/-纯合子；3.+/-杂合子；4.+/+纯合子
附图 LDL-R基因外显子B AvaⅡ RFCP
2.血脂正常者LDL-R基因外显子13 AvaⅡ多态性分析：对81名血脂正常者的LDL-R基因AvaⅡ多态性分析结果及据此计算出的等位基因频率(表1)。
, 百拇医药
表1 血脂正常人LDL-R基因外显子13 AvaⅡ基因型分布及等位基因频率(例数) 组别
性别
男
女
基因型分布
-/-
21
25
+/-
20
11
+/+
, http://www.100md.com 4
0
等位基因频率
-
62(0.689)
61(0.847)
+
28(0.311)
11(0.153)
注：括号内为百分比
3.高胆固醇血症患者LDL-R基因外显子13 AvaⅡ多态性分析：对51例高胆固醇血症患者LDL-R基因外显子13 AvaⅡ多态性分析结果，据此计算出的等位基因频率(表2)。
, 百拇医药
表2 高胆固醇血症患者LDL-R基因外显子13 AvaⅡ基因型分布及等位基因频率(例数) 组别
性别
男
女
基因型分布
-/-
10
8
+/-
11
19
+/+
, 百拇医药 2
1
等位基因频率
-
31(0.674)
35(0.625)
+
15(0.326)
21(0.375)
注：括号内为百分比
4.LDL-R基因AvaⅡ多态性与血清脂质的关系：正常血脂者TC、LDL-C的均值在+/+、+/-及-/-基因型个体中存在渐降的趋势，但没有统计学意义(表3)。
, 百拇医药
表3 血脂正常人LDL-R基因型与血清脂质的关系(mmol/L,
±s) 基因
型
例
数
TC
TG
HDL-C
LDL-C
+/+
4
4.5±0.4
, 百拇医药
1.04±0.24
1.19±0.11
2.9±0.3
+/-
31
4.2±0.8
1.15±0.36
1.20±0.36
2.4±0.7
-/-
46
4.1±0.7
, 百拇医药
1.11±0.56
1.20±0.31
2.4±0.7
高胆固醇血症患者TC、LDL-C的均值在+/+、+/-及-/-基因型个体中也有类似趋势，且具有统计学意义(P<0.05)(表4)。表4 高胆固醇血症患者LDL-R基因型与血清脂质的关系(mmol/L,±S) 基因
型
例
数
TC**
TG
, 百拇医药
HDL-C
LDL-C*
+/+
3
8.1±1.0
3.4±1.1
1.23±0.44
5.3±1.1
+/-
30
6.8±0.9
2.4±1.2
, http://www.100md.com
1.14±0.28
4.8±1.1
-/-
18
6.4±0.4
1.9±0.8
1.33±0.43
3.9±1.3
注：* F=3.99，P<0.05，**F=6.91，P<0.01
比较正常血脂组和高胆固醇血症组LDL-R等位基因相对频率，发现高脂血症组的+等位基因频率(0.353)高于正常血脂组(0.24)，差异有显著意义(χ2=3.87，P<0.05)。
, http://www.100md.com
三、讨论
本结果表明，LDL-R基因酶切多态性和人群中血清胆固醇水平差异显著有关系。其中+等位基因和高TC、LDL-C水平有关系；-等位基因和低TC、LDL-C水平有关系。在高胆固醇血症组和正常血脂组中，TC、LDL-C水平按LDL-R基因型由-/-、+/-向+/+基因型变化而递增。在高胆固醇血症组中有统计学意义，在正常血脂组中无统计学意义。而且高胆固醇血症组的+等位基因频率明显高于对照组。本研究提示，在LDL-R基因方面，国人可能有优于西方人的遗传背景。
本课题为湖北省科技攻关重点课题资助项目
参考文献
1 周新主编.动脉粥样硬化与生物化学检验.武汉：湖北科学技术出版社.1997.274-276.
2 Loparev VN, Cantas MA, Monken CE, et al. An efficient and simple method of DNA extraction from whole blood and cell line to identify infectious agents. J Vird Methods, 1990, 34:105-106.
3 Ahn YI, Ilyas Kamboh M, Aston CE, et al. Role of common genetic polymorphisms in the LDL receptor gene in affecting plasma cholesterol levels in the general population. Arterioscler Thromb, 1994, 14:663-670.
(收稿：1998-04-16 修回：1998-07-30), 百拇医药
单位：430071 武汉，湖北医科大学附属第二医院检验科(郑芳、周新、崔天盆)；湖北省恩施州医院检验科(徐红)
关键词：
中华医学杂志981111 已知低密度脂蛋白受体(LDL-R)基因突变会导致个体患家族性高胆固醇血症(FH)[1]。为探讨LDL-R基因AvaⅡ位点多态性对人群中血清胆固醇水平的影响，我们对LDL-R基因多态性与胆固醇水平的关系进行了研究。
一、对象与方法
1.对象：(1)正常血脂组81例，总胆固醇(TC)<5.20 mmol/L，甘油三酯(TG)<1.70 mmol/L，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)<3.12 mmol/L，HDL-C>1.04 mmol/L，Lp(a)<300 mg/L。随机选自体检健康者。男44例，女37例，年龄21～86岁，平均50岁。(2)高脂血症组51例(TC>5.72 mmol/L，TG>1.70 mmol/L，LDL-C>3.64 mmol/L，Lp(a)>300 mg/L)，均为本院门诊及住院患者，男23例，女28例，年龄30～82岁，平均56岁。
, 百拇医药
2.方法：用改良碘化钠法[2]提取基因组DNA。参照文献[3]设计2对引物，序列分别为P1：5′GTCATCTTCCTTGCTGCCTGTTTAG3′和P2：5′GGTTCCACAAGGAGGTTTCAAGGTT3′。PCR反应条件为：预变性，95 ℃5分钟，然后按95 ℃变性1分钟，68 ℃退火2分钟，72 ℃延伸1分钟循环28次。末次循环后72 ℃延伸5分钟。取10 μl扩增产物，加入2 μl 10×buffer，7 μl无菌双蒸水，10 U/μl的AvaⅡ限制性内切酶1 μl。37 ℃消化3小时左右。酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定，以复华小分子量Marker为DNA片段长度标准物。并对各研究对象进行血脂、脂蛋白的测定。
3.统计学处理：基因频率采用基因计数法计算；采用方差分析和卡方检验的方法进行组间基因频率和血清脂质的比较。
二、结果
, 百拇医药
1.LDL-R基因外显子13的AvaⅡ酶切片段：本研究所得LDL-R基因13外显子AvaⅡ酶切片段有3种，分子量分别为228 bp、141 bp、87 bp。等位基因如有AvaⅡ酶切位点，得到141 bp和87 bp的酶切片段(等位基因+)；无AvaⅡ酶切位点的等位基因只能得到一条228 bp的带(等位基因-)，则基因型有3种：-/-、+/-及+/+(附图)。
M.DNA分子量标准；1.扩增产物 ；2.-/-纯合子；3.+/-杂合子；4.+/+纯合子
附图 LDL-R基因外显子B AvaⅡ RFCP
2.血脂正常者LDL-R基因外显子13 AvaⅡ多态性分析：对81名血脂正常者的LDL-R基因AvaⅡ多态性分析结果及据此计算出的等位基因频率(表1)。
, 百拇医药
表1 血脂正常人LDL-R基因外显子13 AvaⅡ基因型分布及等位基因频率(例数) 组别
性别
男
女
基因型分布
-/-
21
25
+/-
20
11
+/+
, http://www.100md.com 4
0
等位基因频率
-
62(0.689)
61(0.847)
+
28(0.311)
11(0.153)
注：括号内为百分比
3.高胆固醇血症患者LDL-R基因外显子13 AvaⅡ多态性分析：对51例高胆固醇血症患者LDL-R基因外显子13 AvaⅡ多态性分析结果，据此计算出的等位基因频率(表2)。
, 百拇医药
表2 高胆固醇血症患者LDL-R基因外显子13 AvaⅡ基因型分布及等位基因频率(例数) 组别
性别
男
女
基因型分布
-/-
10
8
+/-
11
19
+/+
, 百拇医药 2
1
等位基因频率
-
31(0.674)
35(0.625)
+
15(0.326)
21(0.375)
注：括号内为百分比
4.LDL-R基因AvaⅡ多态性与血清脂质的关系：正常血脂者TC、LDL-C的均值在+/+、+/-及-/-基因型个体中存在渐降的趋势，但没有统计学意义(表3)。
, 百拇医药
表3 血脂正常人LDL-R基因型与血清脂质的关系(mmol/L,
±s) 基因型
例
数
TC
TG
HDL-C
LDL-C
+/+
4
4.5±0.4
, 百拇医药
1.04±0.24
1.19±0.11
2.9±0.3
+/-
31
4.2±0.8
1.15±0.36
1.20±0.36
2.4±0.7
-/-
46
4.1±0.7
, 百拇医药
1.11±0.56
1.20±0.31
2.4±0.7
高胆固醇血症患者TC、LDL-C的均值在+/+、+/-及-/-基因型个体中也有类似趋势，且具有统计学意义(P<0.05)(表4)。表4 高胆固醇血症患者LDL-R基因型与血清脂质的关系(mmol/L,
±S) 基因型
例
数
TC**
TG
, 百拇医药
HDL-C
LDL-C*
+/+
3
8.1±1.0
3.4±1.1
1.23±0.44
5.3±1.1
+/-
30
6.8±0.9
2.4±1.2
, http://www.100md.com
1.14±0.28
4.8±1.1
-/-
18
6.4±0.4
1.9±0.8
1.33±0.43
3.9±1.3
注：* F=3.99，P<0.05，**F=6.91，P<0.01
比较正常血脂组和高胆固醇血症组LDL-R等位基因相对频率，发现高脂血症组的+等位基因频率(0.353)高于正常血脂组(0.24)，差异有显著意义(χ2=3.87，P<0.05)。
, http://www.100md.com
三、讨论
本结果表明，LDL-R基因酶切多态性和人群中血清胆固醇水平差异显著有关系。其中+等位基因和高TC、LDL-C水平有关系；-等位基因和低TC、LDL-C水平有关系。在高胆固醇血症组和正常血脂组中，TC、LDL-C水平按LDL-R基因型由-/-、+/-向+/+基因型变化而递增。在高胆固醇血症组中有统计学意义，在正常血脂组中无统计学意义。而且高胆固醇血症组的+等位基因频率明显高于对照组。本研究提示，在LDL-R基因方面，国人可能有优于西方人的遗传背景。
本课题为湖北省科技攻关重点课题资助项目
参考文献
1 周新主编.动脉粥样硬化与生物化学检验.武汉：湖北科学技术出版社.1997.274-276.
2 Loparev VN, Cantas MA, Monken CE, et al. An efficient and simple method of DNA extraction from whole blood and cell line to identify infectious agents. J Vird Methods, 1990, 34:105-106.
3 Ahn YI, Ilyas Kamboh M, Aston CE, et al. Role of common genetic polymorphisms in the LDL receptor gene in affecting plasma cholesterol levels in the general population. Arterioscler Thromb, 1994, 14:663-670.
(收稿：1998-04-16 修回：1998-07-30), 百拇医药