透明质酸对CNE-2Z裸鼠移植瘤毛细淋巴管形成的影响
作者：廖新波 张钦明 唐慰萍 莫梅英
单位：廖新波 张钦明 唐慰萍 莫梅英(广东医学院病理学教研室，湛江 524023)
关键词：透明质酸；肿瘤细胞；培养的；淋巴组织；图像解释；计算机辅助；小鼠；裸
临床与实验病理学杂志990116摘要 目的：研究透明质酸(hyaluronic acid, HA)对CNE-2Z裸鼠移植瘤组织内毛细淋巴管形成的影响。方法：将CNE-2Z接种到裸鼠皮下并注射HA(每次300 μg/周，共1 800 μg)，取移植瘤作冰冻切片、组织化学染色和常规HE染色，光镜下观察癌组织内毛细淋巴管的形态和分布，并用图像分析技术对癌间质面积进行定量测量。结果：实验组部分癌组织内见毛细淋巴管存在，其余部分癌组织及对照组所有癌组织切片均未见毛细淋巴管；癌组织坏死明显，甚至在毛细血管旁的癌组织，坏死亦明显；两组间癌间质面积差异无显著性(P>0.05)。结论：透明质酸可促进鼻咽癌组织内毛细淋巴管形成，癌组织坏死与癌组织缺乏淋巴循环有关，透明质酸对癌间质形成无明显促进作用。
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中国图书分类号 R914.3； R73； R332 文献标识 A 文章编号 1001-7399(1999)01-0047-03
Effect of hyaluronic acid on angiogenesis of lymph capillaries in CNE-2Z xenograft
Liao Xinbo, Zhang Qinming, Tang Weiping et al
(Dept of Pathol, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023)
ABSTRACT Purpose To study the effect of hyaluronic acid (HA) on the formation of lymph capillaries in CNE-2Z xenograft. Methods CNE-2Z cells were implanted into the subdermal layer of the nude mice, and HA (300 μg per time, the total 1 800μg) was injected in same location. The xenogaft was frozen and cut in a cryostate for histochemical stain and routine HE stain. Under light microscope, the morphology and distribution of lymph capillaries in carcinoma tissues were observed. The area of carcinoma interstitial tissues were measured by image analysis technique. Results The lymph capillaries were found in part of carcinoma tissues in experimental group, no lymph capillaries were seen in other carcinoma tissues in experimental group and all carcinoma tissues in the control group. The obvious necrosis of carcinoma tissues was occoured, even the carcinoma tissues beside blood capillaries. There was no difference (P>0.05) of the area of carcinoma interstitium between the subject and control groups. Conclusion HA can promote the formation of the lymph capillaries in nasopharyngeal carcinoma. Necrosis of carcinoma tissues is relative to lack of lymph circles in carcinoma. There is no effect of HA on the formation of carcinoma interstitium.
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KEY WODRS hyaluronic acid; tumor cells, cultured; lymphoid tissue; image interpretation, computer-assisted; mice, nude
恶性肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤新血管形成，如无血管形成，则实体肿瘤生长到最大直径为1～2 cm时可不发生浸润和转移，甚至实体瘤亦会因无血管形成而坏死。一般认为肿瘤本身不形成新生的毛细淋巴管〔1，2〕，我们以前的实验已发现人胃癌组织内有毛细淋巴管新生，但缺乏有效的淋巴循环〔3～5〕。肿瘤坏死除与缺血有关外，是否还与肿瘤缺乏淋巴循环有关。Ryan〔6〕认为血管形成的概念不应限于血管，也应包括淋巴管。透明质酸(hyaluronic acid, HA)为细胞外基质，在肿瘤血管形成过程中有重要作用〔7，8〕。本实验旨在将人低分化鼻咽癌细胞系CNE-2Z接种于裸鼠皮下，并注射透明质酸，观察透明质酸对肿瘤毛细淋巴管形成的影响。
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1 材料和方法
1.1 材料 CNE-2Z癌细胞由本研究室提供，透明质酸、RPMI 1640培养液、腺苷5′-磷酸、四咪唑等均为美国Sigma公司产品，顺丁烯二酸为上海试剂三厂产品。
1.2 细胞培养 将冷藏CNE-2Z细胞复苏，置入含15%小牛血清的RPMI 1640培养液(加青霉素1.0×104 U.L-1和链霉素100 mg.L-1)中，在含有5% CO2的培养箱内培养，待细胞长满瓶后用胰酶消化脱壁，调成1×109个.L-1备用。
1.3 裸鼠皮下接种CNE-2Z癌细胞 取6只裸鼠(NIH品系，1月龄，♀兼用)分成对照组和实验组。取上述癌细胞0.3 ml于裸鼠背部两侧皮下接种，一只为两个点，共12个点，对照组动物仅注射癌细胞(用RPMI 1640液配制)，实验组动物注射癌细胞加透明质酸(用含1 000 mg.L-1 HA的RPMI 1640液配制)，以后每周实验组每只动物注射1 000 mg.L-1透明质酸0.3 ml(移植瘤周围)，对照组注射RPMI 1640液0.3 ml，连续观察5周。5周后处死动物，取移植瘤组织做冰冻切片和常规石蜡切片。
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1.4 组化染色 参照文献〔9，10〕将Wachstern标准液中醋酸缓冲液改为顺丁烯二酸缓冲液(pH 7.2)，在标准液中加碱性磷酸酶活性抑制剂四咪唑。
1.5 癌间质面积测量 参照文献〔11〕进行。通过图像分析系统(同济清平公司产品)摄取癌组织HE染色图像，用软盘转入激光共聚焦显微镜硬盘下，在File菜单下调用图像文件，在area下进行面积测量。所得数据用北京万道公司Sdat软件作t检验。
2 结果
2.1 HE切片观察 癌组织的实质和间质广泛性坏死(图1)伴出血，间质水肿明显，癌组织与正常间质交界处毛细血管明显扩张、充血，但其周围的癌细胞坏死亦明显；对照组和实验组肿瘤周围见明显的纤维结缔组织包裹，癌组织浸润其间，癌细胞周围间质水肿明显，癌组织的周围包膜处组织间隙明显扩张、水肿。对照组有2个、实验组有1个动物发生腋窝淋巴结转移，癌细胞浸润边缘窦，髓窦未见癌细胞。
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2.2 酶组织化学染色 对照组所有癌组织切片均未见呈褐色的毛细淋巴管，而实验组却有2个注射部位的癌组织切片显示有毛细淋巴管，呈褐色，部分呈条索状，部分管腔开放，呈垂直状由周围正常间质长入癌组织内，提示癌组织内缺乏淋巴循环，但有毛细淋巴管新生。
2.3 癌间质面积测量 对照组与实验组癌组织间质面积分别为26 964.97±206.25 μm2， 37 033.95±173.02 μm2，两者相比差异无显著性(P=0.061)。
3 讨论
本研究结果显示癌组织广泛性坏死。一般认为癌组织坏死与缺血有关，但在毛细血管明显扩张充血处癌组织坏死也明显，这说明癌组织坏死除与血供相对不足有关外，还有其他因素参与。实验结果显示癌间质明显水肿，癌组织周围正常间质亦明显水肿，在对照组癌组织及大部分实验组癌组织内均未见毛细淋巴管，这表明癌组织内因缺乏淋巴循环，导致间质水肿，压迫癌细胞或毛细血管，致使癌组织发生缺血性坏死。癌间质及癌组织周围间质水肿的发生是各种因素共同作用的结果，其中最重要的因素可能是肿瘤区血管通透性增高，而瘤体内又缺乏有效的淋巴循环，即缺少有解剖学功能的淋巴网络，淋巴引流相对不足〔12，13〕，大量增加的癌间质内液体使肿瘤内液压升高，并从肿瘤中心向周围传导，以及间质内高浓度的蛋白质和乳酸盐引起渗透压升高的结果〔14〕。
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恶性肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤新血管形成，本研究结果也显示癌组织中央坏死明显与癌组织缺血有关。引起肿瘤血管形成的因素很多，其中包括HA〔7〕。HA在血管形成过程中有双重作用，高分子HA抑制血管形成。而HA于降解产物3～10个寡糖单位可刺激血管形成，这些寡糖HA于体外作用内皮细胞，可刺激其生长和迁移。在许多侵袭性肿瘤组织内，血管形成发生于邻近新生结缔组织的区域，该处富有HA。HA诱导血管形成的作用可能与内皮细胞表面CD44结合诱导信号传导有关。Ryan〔6〕认为血管形成的概念不应限于血管，也应包括淋巴管。Ryan认为内皮细胞的增殖是多潜能的，毛细淋巴管内皮细胞的增殖所需的条件比血管内皮细胞更低。在病理情况下，很多所谓的血管实际上是淋巴管。他们通过对内皮细胞的组织培养，发现那些不具备健康血管内皮特征的大而薄的内皮细胞，是淋巴管源性的内皮细胞。我们的实验结果显示对照组所有癌组织切片均未见毛细淋巴管，实验组有2个注射部位的癌组织切片显示较多呈褐色的毛细淋巴管，部分呈条索状，部分呈管腔开放，呈垂直状由周围正常间质长入癌组织内，表明HA可促进毛细淋巴管新生。因而证实了我们以前的实验推断〔3，4〕。
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HA可诱导肿瘤新血管形成〔7〕，新生的毛细血管具有较高的通透性，大量血浆蛋白渗出可诱导间质增生。本研究结果显示癌间质面积两组间差异无显著性，说明HA对癌间质形成无明显促进作用，癌间质形成不是单一因素作用的结果。
基金项目：广东省卫生厅科研基金资助项目(No A1997337)
作者简介：廖新波，男，33岁，硕士，讲师，主要从事肿瘤转移机制的研究
唐慰萍，女，60岁，硕士，教授，硕士生导师
参考文献
1，Zeidman I, Buss JM. Experiment studies on the spread of cancer in lymphatic system. 1. Effectiveness of the lymph node as a barreir the passage of embolic tumor cells. Cancer Res, 1954;14:403
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2，林志宏.喉淋巴管分布与超微结构观察.中华耳鼻咽喉科杂志，1990；25(2)：275
3，Liao XB, Tang WP, Zhang QM et al. Morphological analysis of the lymph vessels and capillaries in gastric carcinoma. China Natl J New Gastroenterol, 1997;3(2):90
4，廖新波，唐慰萍，张钦明等.胃癌组织内淋巴管的形态计量学研究.临床与实验病理学杂志，1997；13(1)：380
5，廖新波，唐慰萍，赵颖海等.胃癌及胃壁组织内淋巴管改变的初步研究.中国组织化学与细胞化学杂志，1996；5(1)：67
6，Ryan TJ. Distinguishing lymphatics from blood vessels in normal and diseased skin. Lymphology, 1987;20(4):179
, 百拇医药
7，廖新波，张钦明，唐慰萍等.透明质酸对CNE-2Z癌细胞裸鼠移植瘤VEGF及flk-1表达的影响.广东医学院学报，1998；15(1～2)：7
8，Rooney P, Kumar S, Ponting J et al. The role of hyaluronaon in tumor neovascularization. Int J Cancer, 1995;60(5):632
9，廖新波，唐慰萍，赵颖海等.5′-核苷酸酶碱性磷酸酶双重染色法在毛细淋巴管研究中的应用.中国组织化学与细胞化学杂志，1996；5(2)：184
10，Kato S. Histochemical localization of 5′-nucleotidase in the lymphatic endothelium. Acta Histochem Cytochem, 1990;23(5):613
, 百拇医药
11，廖新波，孙 宁，唐慰萍.鼻咽癌凋亡细胞核DNA与胞质微丝形态结构的激光共聚焦显微镜观察.广东医学院学报，1996；14(3)：219
12，Werner JA, Schunke M, Rudert H et al. Description and clinical importance of the lymphatics of the vocal fold. Otolaryng Head and Neck Surg, 1990;102(1):13
13，Boucher Y, Jain RK. Microvascular pressure is the principal driving force intersititial hypertention in solid tumor: implications for vascular callapse. Cancer Res, 1992;52(18):5 110
14，李蜀光，毛祖彝.恶性肿瘤间质内液压增高.国外医学口腔医学分册，1993；20(6)：335
收稿日期：1998-03-13, 百拇医药
单位：廖新波 张钦明 唐慰萍 莫梅英(广东医学院病理学教研室，湛江 524023)
关键词：透明质酸；肿瘤细胞；培养的；淋巴组织；图像解释；计算机辅助；小鼠；裸
临床与实验病理学杂志990116摘要 目的：研究透明质酸(hyaluronic acid, HA)对CNE-2Z裸鼠移植瘤组织内毛细淋巴管形成的影响。方法：将CNE-2Z接种到裸鼠皮下并注射HA(每次300 μg/周，共1 800 μg)，取移植瘤作冰冻切片、组织化学染色和常规HE染色，光镜下观察癌组织内毛细淋巴管的形态和分布，并用图像分析技术对癌间质面积进行定量测量。结果：实验组部分癌组织内见毛细淋巴管存在，其余部分癌组织及对照组所有癌组织切片均未见毛细淋巴管；癌组织坏死明显，甚至在毛细血管旁的癌组织，坏死亦明显；两组间癌间质面积差异无显著性(P>0.05)。结论：透明质酸可促进鼻咽癌组织内毛细淋巴管形成，癌组织坏死与癌组织缺乏淋巴循环有关，透明质酸对癌间质形成无明显促进作用。
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中国图书分类号 R914.3； R73； R332 文献标识 A 文章编号 1001-7399(1999)01-0047-03
Effect of hyaluronic acid on angiogenesis of lymph capillaries in CNE-2Z xenograft
Liao Xinbo, Zhang Qinming, Tang Weiping et al
(Dept of Pathol, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023)
ABSTRACT Purpose To study the effect of hyaluronic acid (HA) on the formation of lymph capillaries in CNE-2Z xenograft. Methods CNE-2Z cells were implanted into the subdermal layer of the nude mice, and HA (300 μg per time, the total 1 800μg) was injected in same location. The xenogaft was frozen and cut in a cryostate for histochemical stain and routine HE stain. Under light microscope, the morphology and distribution of lymph capillaries in carcinoma tissues were observed. The area of carcinoma interstitial tissues were measured by image analysis technique. Results The lymph capillaries were found in part of carcinoma tissues in experimental group, no lymph capillaries were seen in other carcinoma tissues in experimental group and all carcinoma tissues in the control group. The obvious necrosis of carcinoma tissues was occoured, even the carcinoma tissues beside blood capillaries. There was no difference (P>0.05) of the area of carcinoma interstitium between the subject and control groups. Conclusion HA can promote the formation of the lymph capillaries in nasopharyngeal carcinoma. Necrosis of carcinoma tissues is relative to lack of lymph circles in carcinoma. There is no effect of HA on the formation of carcinoma interstitium.
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KEY WODRS hyaluronic acid; tumor cells, cultured; lymphoid tissue; image interpretation, computer-assisted; mice, nude
恶性肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤新血管形成，如无血管形成，则实体肿瘤生长到最大直径为1～2 cm时可不发生浸润和转移，甚至实体瘤亦会因无血管形成而坏死。一般认为肿瘤本身不形成新生的毛细淋巴管〔1，2〕，我们以前的实验已发现人胃癌组织内有毛细淋巴管新生，但缺乏有效的淋巴循环〔3～5〕。肿瘤坏死除与缺血有关外，是否还与肿瘤缺乏淋巴循环有关。Ryan〔6〕认为血管形成的概念不应限于血管，也应包括淋巴管。透明质酸(hyaluronic acid, HA)为细胞外基质，在肿瘤血管形成过程中有重要作用〔7，8〕。本实验旨在将人低分化鼻咽癌细胞系CNE-2Z接种于裸鼠皮下，并注射透明质酸，观察透明质酸对肿瘤毛细淋巴管形成的影响。
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1 材料和方法
1.1 材料 CNE-2Z癌细胞由本研究室提供，透明质酸、RPMI 1640培养液、腺苷5′-磷酸、四咪唑等均为美国Sigma公司产品，顺丁烯二酸为上海试剂三厂产品。
1.2 细胞培养 将冷藏CNE-2Z细胞复苏，置入含15%小牛血清的RPMI 1640培养液(加青霉素1.0×104 U.L-1和链霉素100 mg.L-1)中，在含有5% CO2的培养箱内培养，待细胞长满瓶后用胰酶消化脱壁，调成1×109个.L-1备用。
1.3 裸鼠皮下接种CNE-2Z癌细胞 取6只裸鼠(NIH品系，1月龄，♀兼用)分成对照组和实验组。取上述癌细胞0.3 ml于裸鼠背部两侧皮下接种，一只为两个点，共12个点，对照组动物仅注射癌细胞(用RPMI 1640液配制)，实验组动物注射癌细胞加透明质酸(用含1 000 mg.L-1 HA的RPMI 1640液配制)，以后每周实验组每只动物注射1 000 mg.L-1透明质酸0.3 ml(移植瘤周围)，对照组注射RPMI 1640液0.3 ml，连续观察5周。5周后处死动物，取移植瘤组织做冰冻切片和常规石蜡切片。
, 百拇医药
1.4 组化染色 参照文献〔9，10〕将Wachstern标准液中醋酸缓冲液改为顺丁烯二酸缓冲液(pH 7.2)，在标准液中加碱性磷酸酶活性抑制剂四咪唑。
1.5 癌间质面积测量 参照文献〔11〕进行。通过图像分析系统(同济清平公司产品)摄取癌组织HE染色图像，用软盘转入激光共聚焦显微镜硬盘下，在File菜单下调用图像文件，在area下进行面积测量。所得数据用北京万道公司Sdat软件作t检验。
2 结果
2.1 HE切片观察 癌组织的实质和间质广泛性坏死(图1)伴出血，间质水肿明显，癌组织与正常间质交界处毛细血管明显扩张、充血，但其周围的癌细胞坏死亦明显；对照组和实验组肿瘤周围见明显的纤维结缔组织包裹，癌组织浸润其间，癌细胞周围间质水肿明显，癌组织的周围包膜处组织间隙明显扩张、水肿。对照组有2个、实验组有1个动物发生腋窝淋巴结转移，癌细胞浸润边缘窦，髓窦未见癌细胞。
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2.2 酶组织化学染色 对照组所有癌组织切片均未见呈褐色的毛细淋巴管，而实验组却有2个注射部位的癌组织切片显示有毛细淋巴管，呈褐色，部分呈条索状，部分管腔开放，呈垂直状由周围正常间质长入癌组织内，提示癌组织内缺乏淋巴循环，但有毛细淋巴管新生。
2.3 癌间质面积测量 对照组与实验组癌组织间质面积分别为26 964.97±206.25 μm2， 37 033.95±173.02 μm2，两者相比差异无显著性(P=0.061)。
3 讨论
本研究结果显示癌组织广泛性坏死。一般认为癌组织坏死与缺血有关，但在毛细血管明显扩张充血处癌组织坏死也明显，这说明癌组织坏死除与血供相对不足有关外，还有其他因素参与。实验结果显示癌间质明显水肿，癌组织周围正常间质亦明显水肿，在对照组癌组织及大部分实验组癌组织内均未见毛细淋巴管，这表明癌组织内因缺乏淋巴循环，导致间质水肿，压迫癌细胞或毛细血管，致使癌组织发生缺血性坏死。癌间质及癌组织周围间质水肿的发生是各种因素共同作用的结果，其中最重要的因素可能是肿瘤区血管通透性增高，而瘤体内又缺乏有效的淋巴循环，即缺少有解剖学功能的淋巴网络，淋巴引流相对不足〔12，13〕，大量增加的癌间质内液体使肿瘤内液压升高，并从肿瘤中心向周围传导，以及间质内高浓度的蛋白质和乳酸盐引起渗透压升高的结果〔14〕。
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恶性肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤新血管形成，本研究结果也显示癌组织中央坏死明显与癌组织缺血有关。引起肿瘤血管形成的因素很多，其中包括HA〔7〕。HA在血管形成过程中有双重作用，高分子HA抑制血管形成。而HA于降解产物3～10个寡糖单位可刺激血管形成，这些寡糖HA于体外作用内皮细胞，可刺激其生长和迁移。在许多侵袭性肿瘤组织内，血管形成发生于邻近新生结缔组织的区域，该处富有HA。HA诱导血管形成的作用可能与内皮细胞表面CD44结合诱导信号传导有关。Ryan〔6〕认为血管形成的概念不应限于血管，也应包括淋巴管。Ryan认为内皮细胞的增殖是多潜能的，毛细淋巴管内皮细胞的增殖所需的条件比血管内皮细胞更低。在病理情况下，很多所谓的血管实际上是淋巴管。他们通过对内皮细胞的组织培养，发现那些不具备健康血管内皮特征的大而薄的内皮细胞，是淋巴管源性的内皮细胞。我们的实验结果显示对照组所有癌组织切片均未见毛细淋巴管，实验组有2个注射部位的癌组织切片显示较多呈褐色的毛细淋巴管，部分呈条索状，部分呈管腔开放，呈垂直状由周围正常间质长入癌组织内，表明HA可促进毛细淋巴管新生。因而证实了我们以前的实验推断〔3，4〕。
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HA可诱导肿瘤新血管形成〔7〕，新生的毛细血管具有较高的通透性，大量血浆蛋白渗出可诱导间质增生。本研究结果显示癌间质面积两组间差异无显著性，说明HA对癌间质形成无明显促进作用，癌间质形成不是单一因素作用的结果。
基金项目：广东省卫生厅科研基金资助项目(No A1997337)
作者简介：廖新波，男，33岁，硕士，讲师，主要从事肿瘤转移机制的研究
唐慰萍，女，60岁，硕士，教授，硕士生导师
参考文献
1，Zeidman I, Buss JM. Experiment studies on the spread of cancer in lymphatic system. 1. Effectiveness of the lymph node as a barreir the passage of embolic tumor cells. Cancer Res, 1954;14:403
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2，林志宏.喉淋巴管分布与超微结构观察.中华耳鼻咽喉科杂志，1990；25(2)：275
3，Liao XB, Tang WP, Zhang QM et al. Morphological analysis of the lymph vessels and capillaries in gastric carcinoma. China Natl J New Gastroenterol, 1997;3(2):90
4，廖新波，唐慰萍，张钦明等.胃癌组织内淋巴管的形态计量学研究.临床与实验病理学杂志，1997；13(1)：380
5，廖新波，唐慰萍，赵颖海等.胃癌及胃壁组织内淋巴管改变的初步研究.中国组织化学与细胞化学杂志，1996；5(1)：67
6，Ryan TJ. Distinguishing lymphatics from blood vessels in normal and diseased skin. Lymphology, 1987;20(4):179
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7，廖新波，张钦明，唐慰萍等.透明质酸对CNE-2Z癌细胞裸鼠移植瘤VEGF及flk-1表达的影响.广东医学院学报，1998；15(1～2)：7
8，Rooney P, Kumar S, Ponting J et al. The role of hyaluronaon in tumor neovascularization. Int J Cancer, 1995;60(5):632
9，廖新波，唐慰萍，赵颖海等.5′-核苷酸酶碱性磷酸酶双重染色法在毛细淋巴管研究中的应用.中国组织化学与细胞化学杂志，1996；5(2)：184
10，Kato S. Histochemical localization of 5′-nucleotidase in the lymphatic endothelium. Acta Histochem Cytochem, 1990;23(5):613
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11，廖新波，孙 宁，唐慰萍.鼻咽癌凋亡细胞核DNA与胞质微丝形态结构的激光共聚焦显微镜观察.广东医学院学报，1996；14(3)：219
12，Werner JA, Schunke M, Rudert H et al. Description and clinical importance of the lymphatics of the vocal fold. Otolaryng Head and Neck Surg, 1990;102(1):13
13，Boucher Y, Jain RK. Microvascular pressure is the principal driving force intersititial hypertention in solid tumor: implications for vascular callapse. Cancer Res, 1992;52(18):5 110
14，李蜀光，毛祖彝.恶性肿瘤间质内液压增高.国外医学口腔医学分册，1993；20(6)：335
收稿日期：1998-03-13, 百拇医药