间隙连接Cx32 mRNA、Cx43 mRNA及其蛋白产物在肝细胞肝癌中的表达
作者：马向东 隋延仿 王文亮
单位：马向东 隋延仿 王文亮(第四军医大学病理学教研室，西安 710033)
关键词：间隙连接；肝肿瘤；原位杂交；免疫组织化学；细胞培养
临床与实验病理学杂志990111摘要 目的：探讨间隙连接基因Cx32 mRNA、Cx43 mRNA及其蛋白产物在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)发生的重要意义。方法：应用S-P免疫组织化学法、原位杂交和流式细胞仪分析技术，研究61例HCC、14例正常肝组织以及肝癌细胞系HHCC、SMMC-7721、正常肝细胞系QZG中，Cx32 mRNA、Cx43 mRNA及其蛋白产物的表达规律。结果：Cx32蛋白在HCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ级和正常肝组织中的阳性率分别为55.6%、42.1%、18.2%和92.9%；Cx32蛋白在HHCC、SMMC-7721和QZG中阳性细胞计数率分别为1.9%、1.7%和99.0%。Cx43蛋白在HCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ级和正常肝组织中的阳性率分别为44.4%、26.3%、12.1%和78.6%。Cx43蛋白在HHCC、SMMC-7721和QZG中阳性细胞计数率分别为7.3%、2.3%和99.1%。Cx32、Cx43在HCC各级和正常肝组织中差异有显著性(P<0.01)，在肝癌细胞系HHCC、SMMC-7721和正常肝细胞系QZG中阳性细胞计数率差异有显著性(P<0.01)。原位杂交显示，Cx32 mRNA在HCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ级和正常肝组织的阳性率分别为88.9%、84.2%、87.9%和92.9%；Cx43 mRNA为77.8%、78.6%、78.8%和85.7%，Cx32 mRNA、Cx43 mRNA在HCC各级和正常肝组织中阳性率差异无显著性(P>0.05)。结论：Cx32、Cx43基因在转录后、翻译水平的调控异常，是其蛋白表达降低、导致HCC发生的重要分子机制。
, 百拇医药
中国图书分类号 R735.7；R392 文献标识码 A 文章编号 1001-7399(1999)01-0032-03
Cx32 mRNA、Cx43 mRNA and their protiens in human hepatocellular carcinoma (HCC) tissues and cell lines
Ma Xiangdong, Sui Yanfang, Wang Wenliang
(Dept of Pathol, Fourth Military Medical University, Xian 710033)
ABSTRACT Purpose To investigate the significance and mechanism of Cx32 mRNA, Cx43 mRNA and their proteins in HCC. Methods Cx32 mRNA, Cx43 mRNA and their proteins were detected in 61 cases of HCC and 14 cases of normal liver tissues with S-P immunohistochemical method and in situ hybridization (ISH). They were investigated in 2 HCC cell lines HHCC, SMMC-7721 and 1 normal liver cell line QZG by flowcytometer (FCM). Results In HCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ degrees and normal liver tissues, the detection rates of Cx32 protein were 55.6%, 42.1%, 18.2% and 92.9% respectively. The detection rates of Cx43 protein were 44.4%, 26.3%, 12.1% and 78.6% respectively. In HHCC、SMMC-7721 and QZG cell lines, the positive rates of Cx43 were 1.9%, 1.7% and 99.0%, Cx43 were 7.3%, 2.3% and 99.1% respectively. The positive rates of Cx32 and Cx43 protein had significant difference between HCC and normal liver tissues and cell lines (P<0.01). ISH showed the positive rates of Cx32 mRNA in HCCⅠ, Ⅱ, Ⅲ degrees and normal liver tissues were 88.9%, 84.2%, 87.9% and 92.9% respectively, Cx43 mRNA were 77.8%, 78.6%, 78.8% and 85.7% respectivley. The positive rates of Cx32 mRNA and Cx43 mRNA had no difference between HCC and normal liver tissues (P>0.05). Conclusion The aberrant location of Cx32 and Cx43 proteins could be responsible for HCC, and the possible mechanism might be the defect of Cx gene in post-translational processing.
, 百拇医药
KEY WORDS connexin; liver neoplasms; in situ hybridization; immunohistochemistry; cell culture
间隙连接(gap junction)是相邻细胞间的膜通道结构，由胞膜上的间隙连接蛋白亚单位(connexin, Cx)构成〔1〕。细胞通过它所介导的细胞间连接通讯(gap junction intercellular communication, GJIC)，进行细胞间信息和能量的传递，调控细胞的生长、分化和内环境的稳定，对维持机体的功能维持发挥重要作用，而且多种肿瘤的发生与GJIC功能异常有关〔2〕。笔者对Cx32 mRNA、Cx43 mRNA及其蛋白产物在肝细胞癌(HCC)发生的重要意义进行研究。
1 材料和方法
1.1 标本来源 61例HCC标本及14例正常肝组织标本，均为1996～1997年西京医院病理科手术切除标本，经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。根据WHO病理学诊断标准分为Ⅰ级9例，Ⅱ级19例，Ⅲ级33例。
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1.2 细胞系 人肝癌细胞系HHCC、SMMC-7721及人正常肝细胞系QZG由中国科学院上海细胞生物所提供。用RPMI-1640培养液(美国Gibco)常规培养，含10%热灭活胎牛血清(美国Gibco)、1×105 IU.L-1青霉素、1×105 IU*L-1链霉素。
1.3 免疫组织化学 鼠抗Cx32 mAb(美国Zymed)、鼠抗Cx43 mAb(美国Zymed)、S-P免疫组化试剂盒(美国Zymed)、DAB染色试剂盒(美国Zymed)，S-P免疫组化程序按试剂盒说明操作。以胞质内和胞膜上出现棕黄色颗粒为阳性，根据染色强度和范围分为：阴性(-)：阳性细胞<5%； 阳性(+)：阳性细胞5%～50%；强阳性(++)：阳性细胞>50%。设阴性对照、空白对照。
1.4 探针制备 pGEM3-Cx32质粒(含Cx32 cDNA 1.5 kb)、pSG5-Cx43(含Cx43 cDNA 1.1 kb)质粒由湖南医科大学李桂源教授惠赠。质粒经扩增、提取、纯化后，分别以EcoRⅠ(美国Gibco)、BamHⅠ(美国Gibco)酶切，0.7%琼脂糖凝胶电泳分析，用DNA纯化回收试剂盒(美国Clontech)回收并纯化目的基因片段，地高辛标记和检测试剂盒(德国Boehringr Mannheim)标记探针，均按试剂盒说明操作。
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1.5 mRNA原位杂交 ①组织切片预处理：切片62℃烘烤过夜，脱蜡至水。0.2 ml.L-1DEPC室温10 min，0.2 mol.L-1HCl酸化，5 mg.L-1蛋白酶K 37℃消10 min，0.1 mol.L-1甘氨酸终止，40 g.L-1多聚甲醛固定10 min，乙醇脱水，充分干燥。②杂交：向组织上滴加预杂交液42℃孵育30 min。将杂交液100℃变性10 min，-20℃放置3 min，滴加于组织上，加硅化盖玻片，2×SSC湿盒内42℃杂交过夜。③洗涤、显色：2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、BufferⅠ充分洗涤，正常山羊血清封闭30 min，加Dig-Αp(1∶500)37℃孵育2 h。BufferⅠ洗涤，BufferⅢ平衡组织，NBT/BCIP避光充分显色，BufferⅣ终止反应，脱水、透明、封片。以胞浆内出现蓝色颗粒为阳性。设不加探针的预杂交液代替杂交为空白对照。所有统计数据均经χ2检验。
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1.6 流式细胞仪分析 离心收集106个HHCC、SMMC-7721、QZG细胞，正常山羊血清4℃封闭30 min，分别加入Cx32 mAb(1∶500)、Cx43 mAb(1∶500)，加入无关鼠IgG 为空白对照，加入FITC标记羊抗鼠IgG(1∶100)(美国Jackson)，4℃ 30 min，离心弃上清，PBS洗涤并制成500 μl单细胞悬液，过300目筛网，ELITE ESP流式细胞仪(美国Coulter)进行Cx32、Cx43抗原定量检测。
2 结果
2.1 免疫组织化学结果 Cx32、Cx43蛋白免疫反应阳性棕黄色颗粒，胞质阳性为主，偶见胞膜阳性(图1)。Cx32在正常肝组织中呈强阳性，在HCCⅠ级中阳性染色明显减弱，HCCⅡ级中更弱，Ⅲ级最弱(图2)。Cx43在正常肝组织中呈强阳性(图3)，在HCCⅡ、Ⅲ级中明显减弱(图4)，在癌旁肝中较HCC呈明显阳性。Cx32、Cx43阳性率在HCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ级中呈下降趋势，与正常肝组织中阳性率差异有显著性(P<0.01)(表1)。
, 百拇医药
图1Cx32蛋白在正常肝组织中强阳性。S-P×400
图2Cx32蛋白在HCC中阴性。S-P×400
图3Cx43蛋白在正常肝组织中强阳性。S-P×400
图4Cx43蛋白在HCC中阴性。S-P×400
表1 Cx32、Cx43蛋白在HCC和正常肝组织中阳性率 病理类型
n
Cx32
, 百拇医药
Cx43
+
++
%
+
++
%
HCCⅠ
9
2
3
55.6*
2
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44.4*
HCCⅡ
19
6
2
42.1*
3
2
26.3*
HCCⅢ
33
5
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1
18.2*
4
0
12.1*
正常肝
14
4
9
92.9
4
7
78.6
, 百拇医药
*与正常肝相比，P<0.01
2.2 mRNA原位杂交结果 HCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ级和正常肝中Cx32 mRNA、Cx43 mRNA阳性信号均较强，为弥漫分布的蓝色颗粒，定位于肝细胞的胞质中(图5，6)，Cx32 mRNA、Cx43 mRNA原位杂交阳性率在HCC各级和正常肝差异无显著性(P>0.05)(表2)。
图5Cx32mRNA在HCC中强阳性。ISHH×400
图6Cx32mRNA在正常肝组织中强阳性。ISHH×400
表2 Cx32 mRNA、Cx43 mRNA在HCC和正常肝组织中阳性率 病理类型
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n
Cx32
Cx43
+
%
+
%
HCCⅠ
9
8
88.9*
7
77.8*
, 百拇医药
HCCⅡ
19
16
84.2*
15
78.6*
HCCⅢ
33
29
87.9*
26
78.8*
, 百拇医药
正常肝
14
13
92.9
11
85.7
*与正常肝相比，P<0.01
2.3 流式细胞仪分析结果 HHCC、SMMC-7721、QZG细胞中Cx32、Cx43蛋白阳性细胞计数率比较(表3)。
表3 Cx32、Cx43蛋白阳性细胞计数率 细胞系
阳性细胞计数率(%)
Cx32
, 百拇医药
Cx43
HHCC
1.9*
7.3*
SMMC-7721
1.7*
2.3*
QZG
99.0
99.1
*与QZG比，P<0.01
, 百拇医药
3 讨论
自1986年第一个Cx基因被克隆以来，现已发现该基因家族的13个成员〔3〕。cDNA克隆序列分析证实各成员之间具有高度的同源性，基因结构有一定的保守性，其蛋白产物在各组织中的表达既有组织特异性，又存在交叉现象。
Cx基因的表达对维持细胞正常生长、增殖和分化起重要的调控作用，研究发现人类大多数恶性肿瘤中Cx基因的表达严重受抑，恶性程度与Cx基因的表达呈负相关〔4〕，国内有关Cx在HCC中的研究较少。本研究对国人HCC组织中Cx基因及其蛋白表达规律进行了研究，并结合HCC细胞系中Cx蛋白的研究结果，进一步揭示HCC发生的分子机制。
Cx32、Cx43作为肝组织中主要的Cx蛋白，在正常肝组织中表达水平很高，而在HCC组织中明显降低，且随HCC分化程度降低而降低，Cx32在HCC的阴性与在癌旁肝的阳性表达形成明显对比。
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研究尚未发现Cx基因的突变，将Cx基因转染Cx基因缺陷的恶性肿瘤中，其恶性表型出现逆转，有人认为Cx32基因是第二类非突变的抑癌基因〔5〕。应用Cx32 cDNA、Cx43 cDNA探针进行原位杂交研究发现，虽然Cx32、Cx43蛋白产物在HCC中明显降低，但是Cx32 mRNA、Cx43 mRNA在HCC和正常肝中并没有减弱，Cx32 mRNA、Cx43 mRNA在HCC和正常肝中阳性率差异无显著性。这一发现提示，HCC中Cx32、Cx43蛋白表达降低的原因，很可能是Cx基因在转录后、翻译水平调控的结果，可能并非转录过程的缺陷。翻译后蛋白质的加工—即Cx蛋白磷酸化理论〔6〕，是目前研究较为详细的GJIC调控机制。磷酸化作用可使Cx32蛋白作为功能结构单位，并维持Cx32蛋白的数量，一旦磷酸化不能实现，Cx32蛋白装配成细胞表面功能性间隙连接斑(gap junction plaques)受阻，导致肝细胞间失去广泛通讯，细胞逃避正常生长控制，最终导致HCC的发生。间隙连接基因家族中，Cx32、Cx43是肝组织中具有相对组织特异性表达的基因，在维持正常肝细胞的正常表型和细胞间物质和信息的传递中起着重要的作用，该基因表达的缺失可能是HCC多步骤癌变过程中的重要分子机制之一〔7〕。
, 百拇医药
作者简介：马向东，28岁，女，博士研究生。研究方向：分子肿瘤学
参考文献
1，Kumar NN, Gilula NB. The gap junction communication channel. Cell,1996;84:381～388
2，Holder JW, Elmope E, Barrett JC. Gap junction function and cancer. Cancer Res,1993;53:3475～3485
3，Haefliger JA, Bruzzone R, Jenkins NA et al. Four novel members of the connexin family of gap junction proteins. J Biol Chem, 1992;267:2057～2064
, 百拇医药
4，Yamasaki H. Gap junctional intercellular communication and caricinogenesis. Carcinogenesis, 1990;11:1051～1058
5，Krutovskikh V, Mazzoleni G, Mironov N et al. Altered homologous and heterologous gap-junction intecellular communication in primary human liver tumors associated with aberrant protein localization but not gene mutation of connexin 32. Int J Cancer, 1994;54:87
6，Neveu M, Hully JR, Babcock KL et al. Multiple mechanisms are responsible for altered expression of gap junction genes during oncogenesis in rat liver. J Cell Sci, 1994;107:83～95
8，Tsuda H, Asamoto M, Baba H et al. Cell proliferation and advancement of hepatocarcinogenesis in the rat are associated with a decrease in connexin 32 expression. Carcinogenesis, 1995;16:101～105
(图片见插页第5页)
收稿日期：1998-08-06, 百拇医药
单位：马向东 隋延仿 王文亮(第四军医大学病理学教研室，西安 710033)
关键词：间隙连接；肝肿瘤；原位杂交；免疫组织化学；细胞培养
临床与实验病理学杂志990111摘要 目的：探讨间隙连接基因Cx32 mRNA、Cx43 mRNA及其蛋白产物在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)发生的重要意义。方法：应用S-P免疫组织化学法、原位杂交和流式细胞仪分析技术，研究61例HCC、14例正常肝组织以及肝癌细胞系HHCC、SMMC-7721、正常肝细胞系QZG中，Cx32 mRNA、Cx43 mRNA及其蛋白产物的表达规律。结果：Cx32蛋白在HCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ级和正常肝组织中的阳性率分别为55.6%、42.1%、18.2%和92.9%；Cx32蛋白在HHCC、SMMC-7721和QZG中阳性细胞计数率分别为1.9%、1.7%和99.0%。Cx43蛋白在HCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ级和正常肝组织中的阳性率分别为44.4%、26.3%、12.1%和78.6%。Cx43蛋白在HHCC、SMMC-7721和QZG中阳性细胞计数率分别为7.3%、2.3%和99.1%。Cx32、Cx43在HCC各级和正常肝组织中差异有显著性(P<0.01)，在肝癌细胞系HHCC、SMMC-7721和正常肝细胞系QZG中阳性细胞计数率差异有显著性(P<0.01)。原位杂交显示，Cx32 mRNA在HCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ级和正常肝组织的阳性率分别为88.9%、84.2%、87.9%和92.9%；Cx43 mRNA为77.8%、78.6%、78.8%和85.7%，Cx32 mRNA、Cx43 mRNA在HCC各级和正常肝组织中阳性率差异无显著性(P>0.05)。结论：Cx32、Cx43基因在转录后、翻译水平的调控异常，是其蛋白表达降低、导致HCC发生的重要分子机制。
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中国图书分类号 R735.7；R392 文献标识码 A 文章编号 1001-7399(1999)01-0032-03
Cx32 mRNA、Cx43 mRNA and their protiens in human hepatocellular carcinoma (HCC) tissues and cell lines
Ma Xiangdong, Sui Yanfang, Wang Wenliang
(Dept of Pathol, Fourth Military Medical University, Xian 710033)
ABSTRACT Purpose To investigate the significance and mechanism of Cx32 mRNA, Cx43 mRNA and their proteins in HCC. Methods Cx32 mRNA, Cx43 mRNA and their proteins were detected in 61 cases of HCC and 14 cases of normal liver tissues with S-P immunohistochemical method and in situ hybridization (ISH). They were investigated in 2 HCC cell lines HHCC, SMMC-7721 and 1 normal liver cell line QZG by flowcytometer (FCM). Results In HCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ degrees and normal liver tissues, the detection rates of Cx32 protein were 55.6%, 42.1%, 18.2% and 92.9% respectively. The detection rates of Cx43 protein were 44.4%, 26.3%, 12.1% and 78.6% respectively. In HHCC、SMMC-7721 and QZG cell lines, the positive rates of Cx43 were 1.9%, 1.7% and 99.0%, Cx43 were 7.3%, 2.3% and 99.1% respectively. The positive rates of Cx32 and Cx43 protein had significant difference between HCC and normal liver tissues and cell lines (P<0.01). ISH showed the positive rates of Cx32 mRNA in HCCⅠ, Ⅱ, Ⅲ degrees and normal liver tissues were 88.9%, 84.2%, 87.9% and 92.9% respectively, Cx43 mRNA were 77.8%, 78.6%, 78.8% and 85.7% respectivley. The positive rates of Cx32 mRNA and Cx43 mRNA had no difference between HCC and normal liver tissues (P>0.05). Conclusion The aberrant location of Cx32 and Cx43 proteins could be responsible for HCC, and the possible mechanism might be the defect of Cx gene in post-translational processing.
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KEY WORDS connexin; liver neoplasms; in situ hybridization; immunohistochemistry; cell culture
间隙连接(gap junction)是相邻细胞间的膜通道结构，由胞膜上的间隙连接蛋白亚单位(connexin, Cx)构成〔1〕。细胞通过它所介导的细胞间连接通讯(gap junction intercellular communication, GJIC)，进行细胞间信息和能量的传递，调控细胞的生长、分化和内环境的稳定，对维持机体的功能维持发挥重要作用，而且多种肿瘤的发生与GJIC功能异常有关〔2〕。笔者对Cx32 mRNA、Cx43 mRNA及其蛋白产物在肝细胞癌(HCC)发生的重要意义进行研究。
1 材料和方法
1.1 标本来源 61例HCC标本及14例正常肝组织标本，均为1996～1997年西京医院病理科手术切除标本，经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。根据WHO病理学诊断标准分为Ⅰ级9例，Ⅱ级19例，Ⅲ级33例。
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1.2 细胞系 人肝癌细胞系HHCC、SMMC-7721及人正常肝细胞系QZG由中国科学院上海细胞生物所提供。用RPMI-1640培养液(美国Gibco)常规培养，含10%热灭活胎牛血清(美国Gibco)、1×105 IU.L-1青霉素、1×105 IU*L-1链霉素。
1.3 免疫组织化学 鼠抗Cx32 mAb(美国Zymed)、鼠抗Cx43 mAb(美国Zymed)、S-P免疫组化试剂盒(美国Zymed)、DAB染色试剂盒(美国Zymed)，S-P免疫组化程序按试剂盒说明操作。以胞质内和胞膜上出现棕黄色颗粒为阳性，根据染色强度和范围分为：阴性(-)：阳性细胞<5%； 阳性(+)：阳性细胞5%～50%；强阳性(++)：阳性细胞>50%。设阴性对照、空白对照。
1.4 探针制备 pGEM3-Cx32质粒(含Cx32 cDNA 1.5 kb)、pSG5-Cx43(含Cx43 cDNA 1.1 kb)质粒由湖南医科大学李桂源教授惠赠。质粒经扩增、提取、纯化后，分别以EcoRⅠ(美国Gibco)、BamHⅠ(美国Gibco)酶切，0.7%琼脂糖凝胶电泳分析，用DNA纯化回收试剂盒(美国Clontech)回收并纯化目的基因片段，地高辛标记和检测试剂盒(德国Boehringr Mannheim)标记探针，均按试剂盒说明操作。
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1.5 mRNA原位杂交 ①组织切片预处理：切片62℃烘烤过夜，脱蜡至水。0.2 ml.L-1DEPC室温10 min，0.2 mol.L-1HCl酸化，5 mg.L-1蛋白酶K 37℃消10 min，0.1 mol.L-1甘氨酸终止，40 g.L-1多聚甲醛固定10 min，乙醇脱水，充分干燥。②杂交：向组织上滴加预杂交液42℃孵育30 min。将杂交液100℃变性10 min，-20℃放置3 min，滴加于组织上，加硅化盖玻片，2×SSC湿盒内42℃杂交过夜。③洗涤、显色：2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、BufferⅠ充分洗涤，正常山羊血清封闭30 min，加Dig-Αp(1∶500)37℃孵育2 h。BufferⅠ洗涤，BufferⅢ平衡组织，NBT/BCIP避光充分显色，BufferⅣ终止反应，脱水、透明、封片。以胞浆内出现蓝色颗粒为阳性。设不加探针的预杂交液代替杂交为空白对照。所有统计数据均经χ2检验。
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1.6 流式细胞仪分析 离心收集106个HHCC、SMMC-7721、QZG细胞，正常山羊血清4℃封闭30 min，分别加入Cx32 mAb(1∶500)、Cx43 mAb(1∶500)，加入无关鼠IgG 为空白对照，加入FITC标记羊抗鼠IgG(1∶100)(美国Jackson)，4℃ 30 min，离心弃上清，PBS洗涤并制成500 μl单细胞悬液，过300目筛网，ELITE ESP流式细胞仪(美国Coulter)进行Cx32、Cx43抗原定量检测。
2 结果
2.1 免疫组织化学结果 Cx32、Cx43蛋白免疫反应阳性棕黄色颗粒，胞质阳性为主，偶见胞膜阳性(图1)。Cx32在正常肝组织中呈强阳性，在HCCⅠ级中阳性染色明显减弱，HCCⅡ级中更弱，Ⅲ级最弱(图2)。Cx43在正常肝组织中呈强阳性(图3)，在HCCⅡ、Ⅲ级中明显减弱(图4)，在癌旁肝中较HCC呈明显阳性。Cx32、Cx43阳性率在HCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ级中呈下降趋势，与正常肝组织中阳性率差异有显著性(P<0.01)(表1)。
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图1Cx32蛋白在正常肝组织中强阳性。S-P×400
图2Cx32蛋白在HCC中阴性。S-P×400
图3Cx43蛋白在正常肝组织中强阳性。S-P×400
图4Cx43蛋白在HCC中阴性。S-P×400
表1 Cx32、Cx43蛋白在HCC和正常肝组织中阳性率 病理类型
n
Cx32
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Cx43
+
++
%
+
++
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HCCⅠ
9
2
3
55.6*
2
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44.4*
HCCⅡ
19
6
2
42.1*
3
2
26.3*
HCCⅢ
33
5
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1
18.2*
4
0
12.1*
正常肝
14
4
9
92.9
4
7
78.6
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*与正常肝相比，P<0.01
2.2 mRNA原位杂交结果 HCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ级和正常肝中Cx32 mRNA、Cx43 mRNA阳性信号均较强，为弥漫分布的蓝色颗粒，定位于肝细胞的胞质中(图5，6)，Cx32 mRNA、Cx43 mRNA原位杂交阳性率在HCC各级和正常肝差异无显著性(P>0.05)(表2)。
图5Cx32mRNA在HCC中强阳性。ISHH×400
图6Cx32mRNA在正常肝组织中强阳性。ISHH×400
表2 Cx32 mRNA、Cx43 mRNA在HCC和正常肝组织中阳性率 病理类型
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n
Cx32
Cx43
+
%
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%
HCCⅠ
9
8
88.9*
7
77.8*
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HCCⅡ
19
16
84.2*
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78.6*
HCCⅢ
33
29
87.9*
26
78.8*
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正常肝
14
13
92.9
11
85.7
*与正常肝相比，P<0.01
2.3 流式细胞仪分析结果 HHCC、SMMC-7721、QZG细胞中Cx32、Cx43蛋白阳性细胞计数率比较(表3)。
表3 Cx32、Cx43蛋白阳性细胞计数率 细胞系
阳性细胞计数率(%)
Cx32
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Cx43
HHCC
1.9*
7.3*
SMMC-7721
1.7*
2.3*
QZG
99.0
99.1
*与QZG比，P<0.01
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3 讨论
自1986年第一个Cx基因被克隆以来，现已发现该基因家族的13个成员〔3〕。cDNA克隆序列分析证实各成员之间具有高度的同源性，基因结构有一定的保守性，其蛋白产物在各组织中的表达既有组织特异性，又存在交叉现象。
Cx基因的表达对维持细胞正常生长、增殖和分化起重要的调控作用，研究发现人类大多数恶性肿瘤中Cx基因的表达严重受抑，恶性程度与Cx基因的表达呈负相关〔4〕，国内有关Cx在HCC中的研究较少。本研究对国人HCC组织中Cx基因及其蛋白表达规律进行了研究，并结合HCC细胞系中Cx蛋白的研究结果，进一步揭示HCC发生的分子机制。
Cx32、Cx43作为肝组织中主要的Cx蛋白，在正常肝组织中表达水平很高，而在HCC组织中明显降低，且随HCC分化程度降低而降低，Cx32在HCC的阴性与在癌旁肝的阳性表达形成明显对比。
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研究尚未发现Cx基因的突变，将Cx基因转染Cx基因缺陷的恶性肿瘤中，其恶性表型出现逆转，有人认为Cx32基因是第二类非突变的抑癌基因〔5〕。应用Cx32 cDNA、Cx43 cDNA探针进行原位杂交研究发现，虽然Cx32、Cx43蛋白产物在HCC中明显降低，但是Cx32 mRNA、Cx43 mRNA在HCC和正常肝中并没有减弱，Cx32 mRNA、Cx43 mRNA在HCC和正常肝中阳性率差异无显著性。这一发现提示，HCC中Cx32、Cx43蛋白表达降低的原因，很可能是Cx基因在转录后、翻译水平调控的结果，可能并非转录过程的缺陷。翻译后蛋白质的加工—即Cx蛋白磷酸化理论〔6〕，是目前研究较为详细的GJIC调控机制。磷酸化作用可使Cx32蛋白作为功能结构单位，并维持Cx32蛋白的数量，一旦磷酸化不能实现，Cx32蛋白装配成细胞表面功能性间隙连接斑(gap junction plaques)受阻，导致肝细胞间失去广泛通讯，细胞逃避正常生长控制，最终导致HCC的发生。间隙连接基因家族中，Cx32、Cx43是肝组织中具有相对组织特异性表达的基因，在维持正常肝细胞的正常表型和细胞间物质和信息的传递中起着重要的作用，该基因表达的缺失可能是HCC多步骤癌变过程中的重要分子机制之一〔7〕。
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作者简介：马向东，28岁，女，博士研究生。研究方向：分子肿瘤学
参考文献
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(图片见插页第5页)
收稿日期：1998-08-06, 百拇医药