应用趋骨荧光素标记体外培养骨组织
作者：邓廉夫 徐荣辉 柴本甫 齐 进
单位：邓廉夫 徐荣辉 柴本甫 齐 进(上海市伤骨科研究所，上海 200025)
关键词：四环素标记；骨组织；形态计量学；体外培养
临床与实验病理学杂志990131
中国图书分类号 R336
文献标识码 A 文章编号 1001-7399(1999)01-0081-02
趋骨性荧光素-四环素标记技术，在活体内骨组织计量学研究及临床检验中得到了较为广泛的应用〔1〕，但必需在取材前48 h给药。由于这种限制，为急症手术获得的或临时决定对骨组织作计量学测定的标本带来困难。为弥补这一缺陷，本研究以体外培养细胞新骨形成的趋骨荧光标记实验为依据〔2，3〕，对家兔新鲜密质骨(胫骨)和松质骨(髂骨)，在体外应用四环素作组织培养标记，藉以探讨体外骨组织荧光标记应用的可能性。
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1 材料与方法
实验用健康新西兰家兔12只，体重3～3.5 kg,♀、
不拘。
1.1 体外培养骨组织的四环素荧光标记 随机取9只动物，用戊巴比妥钠静脉麻醉，在无菌条件下取其双侧髂骨(1.0 cm×0.6 cm)和双侧胫骨骨干中段(长1 cm)的骨组织标本，生理盐水漂洗后，放入含四环素的最小基础培养液(MEM)的试管内(四环素浓度为0.05 g*L-1)，将试管插入转鼓(转鼓的转速为10 r*h-1)，置38℃、5% CO2培养箱内培养，培养时间分别3、6和24 h；换新鲜MEM培养液(不含四环素)，继续作旋转培养1 h。培养结束后，标本经生理盐水漂洗、丙酮固定、脱水、脱脂。松质骨(髂骨)标本用低温塑料包埋法〔4〕制成10 μm厚的不脱钙连续切片；密质骨(胫骨)用甲基丙烯酸甲酯(MMA)包埋法〔5〕制成100 μm厚的不脱钙骨连续切片，DPX封固，落射荧光显微镜观察。
, 百拇医药
1.2 体内骨组织的四环素荧光标记 3只动物按常规方法肌肉注射四环素(0.05 g*kg-1体重)，48 h后处死，取双侧髂骨(1.0 cm×0.6 cm)和双侧胫骨骨干中段(长1 cm)的骨组织标本，按上述同样方法制成不脱钙连续切片，落射荧光显微镜观察，作为阳性对照。
2 结果
体外培养的松质骨和密质骨标本，经四环素标记3 h，其切片几乎没有荧光显示；经四环素荧光标记6 h，呈较弱的荧光反应，其强度低于阳性对照组标本的荧光反应。
体外培养的松质骨标本，经四环素标记24 h，自表面向中央达2.3 mm厚的连续切片中，在骨小梁边缘和哈氏管四周的新生骨组织均显示强金黄色荧光，其荧光强度与对照组相似，甚至更强(图1)；深于2.3 mm的切片，其荧光强度呈逐渐减弱，至3 mm处荧光强度明显减弱。体外培养的密质骨标本，经四环素标记24 h，骨外膜处新生骨组织显示金黄色荧光反应，骨内膜处新生骨组织亦显示金黄色荧光，荧光反应可深达距内膜缘3.6 mm的区域，荧光强度与阳性对照组相似(图2)；随着距骨膜缘距离的增加，其荧光强度减弱，但在哈氏管处仍可见新生骨组织的金黄色荧光环(图3)，哈氏系统所显示的荧光强度与其在密质骨中的位置有关，近骨内、外膜和两断端其荧光较强。
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图1体外培养髂骨四环素荧光标记24h后，哈氏管四周的新生骨组织显示强金黄色荧光。×72.5
图2体外培养胫骨四环素标记24h后，骨外膜、骨内膜处的新生骨组织所显示的金黄色荧光。×72.5
3 讨论
由于四环素的醌氧(quinone qxygen)具有与游离Ca2+的螯合的特性。因此，活体新生骨组织或骨组织的新钙化区经四环素标记后能显示特殊的金黄色荧光，应用一种或多种趋骨性荧光素间隔给药，能评估骨改建的速度。因该方法简便易行、结果可靠而广泛应用于骨形态计量学及代谢性骨病的研究〔1〕。
作者以往应用趋骨荧光素标记技术，检测体外培养的成骨细胞样细胞或成纤维细胞样细胞的新骨形成状况，发现在培养体系内，由成骨细胞样细胞或成纤维细胞样细胞形成的骨结节和骨小梁样组织可被四环素标记，与活体内一样，新生骨组织在荧光显微镜下呈现金黄色荧光〔2，3〕。本实验进一步发现这一技术同样可用于体外培养条件下的骨组织器官，在新骨发生处与体内一样，呈现强金黄色荧光反应。
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在体内，不仅骨组织因改建和塑建过程而处于活动状态，而且注射于机体并进入循环过程中合适剂量的四环素与骨组织有一良好的接触。在体外培养条件下存活的新鲜骨组织及培养体系中合适的四环素浓度，是标记成功的关键。为改善体外骨组织生长环境，本实验采用旋转培养的方法，使试管内骨组织周围有一流动的营养供应和较好的代谢产物排泄，并在四环素与骨荧光强度的剂量-效应依赖关系的实验基础上，使培养液内四环素的浓度维持在0.05 g*L-1，证明是可行的。由于培养的骨组织营养和四环素与新生骨组织Ca2+的螯合是靠渗透完成的，因此四环素的趋骨标记有一定的限度，距骨表面越远，荧光强度越差。本实验发现经24 h培养的松质骨组织，四环素单侧有效渗透距离为2.3 mm，这一深度足以用于4.5 mm厚的松质骨和骨穿刺的标本。因而这一技术可被应用于骨组织形态计量研究，而不受体外培养条件的限制。
作者简介：邓廉夫，男，36岁，博士，副研究员,主要从骨关节病损与修复研究工作
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柴本甫，男，74岁，医学博士，博士生导师，上海市伤骨科研究所名誉所长，中华创伤学会副主任委员，主要从事骨关节病损与修复研究工作
参考文献
1 时光达，陈宝兴.实验骨伤科学.北京：人民卫生出版社，1993：92～104
2 Xu RH, Chai BF, Zhu YP. Effect of radix salviae miltiorrhizae on growth of isolated cells from embryonic chichen frontal bone cultured in vitro (A histochemical study), Ⅱ. The develepment and maturation of osteoblast-like cells. Journal of Shanghai Second Medical University, 1993;7(1):47～50
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3 邓廉夫，柴本甫，齐 进.损伤性和骨关节炎性滑膜细胞成骨作用的体外研究.中华骨科杂志，1997；17(11)：693～695
4 徐荣辉.未脱钙骨酶组织化学研究新技术-低温塑料包埋切片技术.解剖学通报，1983；6(2)：174～175
5 Steflik DE, Mckinney BV, Mobley GL et al. Stimultaneous histological preparation of bone, soft tissue and implanted biomaterials for light microscopic observations. Stain Technol, 1982;57:91～97
(图片见插页第11页)
收稿日期：1998-02-06, 百拇医药
单位：邓廉夫 徐荣辉 柴本甫 齐 进(上海市伤骨科研究所，上海 200025)
关键词：四环素标记；骨组织；形态计量学；体外培养
临床与实验病理学杂志990131
中国图书分类号 R336
文献标识码 A 文章编号 1001-7399(1999)01-0081-02
趋骨性荧光素-四环素标记技术，在活体内骨组织计量学研究及临床检验中得到了较为广泛的应用〔1〕，但必需在取材前48 h给药。由于这种限制，为急症手术获得的或临时决定对骨组织作计量学测定的标本带来困难。为弥补这一缺陷，本研究以体外培养细胞新骨形成的趋骨荧光标记实验为依据〔2，3〕，对家兔新鲜密质骨(胫骨)和松质骨(髂骨)，在体外应用四环素作组织培养标记，藉以探讨体外骨组织荧光标记应用的可能性。
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1 材料与方法
实验用健康新西兰家兔12只，体重3～3.5 kg,♀、
不拘。1.1 体外培养骨组织的四环素荧光标记 随机取9只动物，用戊巴比妥钠静脉麻醉，在无菌条件下取其双侧髂骨(1.0 cm×0.6 cm)和双侧胫骨骨干中段(长1 cm)的骨组织标本，生理盐水漂洗后，放入含四环素的最小基础培养液(MEM)的试管内(四环素浓度为0.05 g*L-1)，将试管插入转鼓(转鼓的转速为10 r*h-1)，置38℃、5% CO2培养箱内培养，培养时间分别3、6和24 h；换新鲜MEM培养液(不含四环素)，继续作旋转培养1 h。培养结束后，标本经生理盐水漂洗、丙酮固定、脱水、脱脂。松质骨(髂骨)标本用低温塑料包埋法〔4〕制成10 μm厚的不脱钙连续切片；密质骨(胫骨)用甲基丙烯酸甲酯(MMA)包埋法〔5〕制成100 μm厚的不脱钙骨连续切片，DPX封固，落射荧光显微镜观察。
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1.2 体内骨组织的四环素荧光标记 3只动物按常规方法肌肉注射四环素(0.05 g*kg-1体重)，48 h后处死，取双侧髂骨(1.0 cm×0.6 cm)和双侧胫骨骨干中段(长1 cm)的骨组织标本，按上述同样方法制成不脱钙连续切片，落射荧光显微镜观察，作为阳性对照。
2 结果
体外培养的松质骨和密质骨标本，经四环素标记3 h，其切片几乎没有荧光显示；经四环素荧光标记6 h，呈较弱的荧光反应，其强度低于阳性对照组标本的荧光反应。
体外培养的松质骨标本，经四环素标记24 h，自表面向中央达2.3 mm厚的连续切片中，在骨小梁边缘和哈氏管四周的新生骨组织均显示强金黄色荧光，其荧光强度与对照组相似，甚至更强(图1)；深于2.3 mm的切片，其荧光强度呈逐渐减弱，至3 mm处荧光强度明显减弱。体外培养的密质骨标本，经四环素标记24 h，骨外膜处新生骨组织显示金黄色荧光反应，骨内膜处新生骨组织亦显示金黄色荧光，荧光反应可深达距内膜缘3.6 mm的区域，荧光强度与阳性对照组相似(图2)；随着距骨膜缘距离的增加，其荧光强度减弱，但在哈氏管处仍可见新生骨组织的金黄色荧光环(图3)，哈氏系统所显示的荧光强度与其在密质骨中的位置有关，近骨内、外膜和两断端其荧光较强。
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图1体外培养髂骨四环素荧光标记24h后，哈氏管四周的新生骨组织显示强金黄色荧光。×72.5
图2体外培养胫骨四环素标记24h后，骨外膜、骨内膜处的新生骨组织所显示的金黄色荧光。×72.5
3 讨论
由于四环素的醌氧(quinone qxygen)具有与游离Ca2+的螯合的特性。因此，活体新生骨组织或骨组织的新钙化区经四环素标记后能显示特殊的金黄色荧光，应用一种或多种趋骨性荧光素间隔给药，能评估骨改建的速度。因该方法简便易行、结果可靠而广泛应用于骨形态计量学及代谢性骨病的研究〔1〕。
作者以往应用趋骨荧光素标记技术，检测体外培养的成骨细胞样细胞或成纤维细胞样细胞的新骨形成状况，发现在培养体系内，由成骨细胞样细胞或成纤维细胞样细胞形成的骨结节和骨小梁样组织可被四环素标记，与活体内一样，新生骨组织在荧光显微镜下呈现金黄色荧光〔2，3〕。本实验进一步发现这一技术同样可用于体外培养条件下的骨组织器官，在新骨发生处与体内一样，呈现强金黄色荧光反应。
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在体内，不仅骨组织因改建和塑建过程而处于活动状态，而且注射于机体并进入循环过程中合适剂量的四环素与骨组织有一良好的接触。在体外培养条件下存活的新鲜骨组织及培养体系中合适的四环素浓度，是标记成功的关键。为改善体外骨组织生长环境，本实验采用旋转培养的方法，使试管内骨组织周围有一流动的营养供应和较好的代谢产物排泄，并在四环素与骨荧光强度的剂量-效应依赖关系的实验基础上，使培养液内四环素的浓度维持在0.05 g*L-1，证明是可行的。由于培养的骨组织营养和四环素与新生骨组织Ca2+的螯合是靠渗透完成的，因此四环素的趋骨标记有一定的限度，距骨表面越远，荧光强度越差。本实验发现经24 h培养的松质骨组织，四环素单侧有效渗透距离为2.3 mm，这一深度足以用于4.5 mm厚的松质骨和骨穿刺的标本。因而这一技术可被应用于骨组织形态计量研究，而不受体外培养条件的限制。
作者简介：邓廉夫，男，36岁，博士，副研究员,主要从骨关节病损与修复研究工作
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柴本甫，男，74岁，医学博士，博士生导师，上海市伤骨科研究所名誉所长，中华创伤学会副主任委员，主要从事骨关节病损与修复研究工作
参考文献
1 时光达，陈宝兴.实验骨伤科学.北京：人民卫生出版社，1993：92～104
2 Xu RH, Chai BF, Zhu YP. Effect of radix salviae miltiorrhizae on growth of isolated cells from embryonic chichen frontal bone cultured in vitro (A histochemical study), Ⅱ. The develepment and maturation of osteoblast-like cells. Journal of Shanghai Second Medical University, 1993;7(1):47～50
, http://www.100md.com
3 邓廉夫，柴本甫，齐 进.损伤性和骨关节炎性滑膜细胞成骨作用的体外研究.中华骨科杂志，1997；17(11)：693～695
4 徐荣辉.未脱钙骨酶组织化学研究新技术-低温塑料包埋切片技术.解剖学通报，1983；6(2)：174～175
5 Steflik DE, Mckinney BV, Mobley GL et al. Stimultaneous histological preparation of bone, soft tissue and implanted biomaterials for light microscopic observations. Stain Technol, 1982;57:91～97
(图片见插页第11页)
收稿日期：1998-02-06, 百拇医药