复方丹参注射液对巨噬细胞一氧化氮合成的影响1
作者：黄迪南 侯敢 祝其锋
单位：广东医学院生化教研室，湛江 524023
关键词：复方丹参注射液；小鼠腹腔巨噬细胞；一氧化氮
中国老年学杂志/990123 摘 要 观察复方丹参注射和丹参的水溶性单体成分丹酚酸B(Sal B)对小鼠腹腔巨噬细胞一氧化氮(NO)合成的影响。结果表明，复方参丹注射液在一定程度上可增加未激活巨噬细胞NO生的临床功效，可能与其能在一定程度上促进巨噬细胞NO生成有关。
Effect of Salviae Miltiorrhize Compound injectio
on the peritoneal macrophage synthesis of nitric oxide of the mice
, 百拇医药
Huang Dinan,Hou Gan,Zhu Qifeng
Biochemical Department of GuangDong Medical College,Zhanjiang 524023
The effect of Salviae Miltiorrhize Compound injectio and Salvianolic acid B on the production of NO-2 and nitric oxide by peritoneal macrophages of the mice were investigated.Salviae Miltiorrhize Compound injectio could induce the increase of NO-2 formation in a partial concentration-dependent and time-dependednt manner,but not with Salvianolic acid B.The data suggest that part of the clinical effect of Salviae Miltiorrhize Compound injectio is the due to the increasing production of nitric oxide.
, 百拇医药
Key words Salviae Miltiorrhize Compound injectio Mouse peritoneal macrophages Nitric Oxide
一氧化氮(NO)是一个具有自由基性质的生物信息分子和效应分子，在体内参与调节心血管紧张度、抑制血小板聚集、参与神经传递和介导免疫应答等诸多病理和生理过程〔1〕。丹参是常用的活血化瘀中药，它具有扩张冠脉、改善血液流变学和抗凝血等作用。为进一步研究丹参的药理作用，本文观察了临床上广泛使用的复方丹参注射液及其丹参的水溶性单体成分丹酚酸B(Sal B)对小鼠腹腔巨噬细胞NO合成的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 复方丹参注射液(河南信阳大别山制药厂，批号：9704142)为丹参、降香提取制成的水溶液，每ml相当于原生药1 g；Sal B(中国科学院药理研究所)。
, 百拇医药
RPMI 1640培养基(GIBCO)，无酚红RPMI 1640培养基(SIGMA)，细菌脂多糖(LPS，SIGMA)，干扰素-γ(IFN-γ，第二军医大学)，余为国产分析纯试剂。
1.2 实验动物 BALP/c小鼠，雌性，7～8 w龄，体重20～25 g，由本校动物中心提供。
1.3 方法
1.3.1 小鼠腹腔巨噬细胞制备 于小鼠腹腔内注射无血清RPMI 1640培养液2 ml，颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡5 min，收集腹腔内液，1 000 r/min离心5 min收集细胞，用含10%小牛血清的RPMI 1604培养液调整细胞浓度至1×106/ml，取24孔细胞培养板，每孔加细胞悬液1 ml，置5%CO2、37 ℃培养12 h，弃去培养液后，再用无酚红RPMI 1640培养液洗去未贴壁细胞，即为所需的巨噬细胞。每孔加1 ml无酚红RPMI 1640培养液，按所需剂量加入药物进行培养。
, 百拇医药
1.3.2 巨噬细胞NO生成量的测定〔2〕 通过测定细胞培养上清液中的NO-2量间接反映巨噬细胞的NO生成量。根据Griess反应测定：取50 μl细胞培养液，加入等量Griess试剂(1%对氨基苯磺酰胺，0.1% N-1-萘乙二胺盐酸盐，2.5%磷酸)，于酶标仪上测定550 nm吸光值，以NaNO2标准溶液制作校正曲线计算NO-2浓度。
1.3.3 统计分析 实验数据用
±s表示，采用SYSTAT统计软件进行统计分析。
2 结 果
2.1 复方丹参注射液对巨噬细胞NO生成的影响 培养液中加入20 ng/ml LPS及2 u/ml IFN-γ(终浓度)激活巨噬细胞。分别按0、1‰、2‰、4‰、8‰和16‰终浓度加入复方丹参注射液于激活和末激活的巨噬细胞培养液中。培养24 h后取细胞培养液测定NO-2浓度，结果见图1。
, 百拇医药
●为未激活巨噬细胞；▲为LPS+IFN-γ激活巨噬细胞。
图1 复方丹参注射液作用剂量对巨噬细胞NO生成的影响
用2‰终浓度复方丹参注射液处理未激活的巨噬细胞，于不同时间取细胞培养液测定NO-2浓度，结果见表1。表1 复方丹参注射液作用时间对未激活巨噬细胞NO生成的影响(±s) 作用时间(h)
n
NO-2(μmol/L)
对照组
药物组
, 百拇医药
6
6
3.85±0635
4.29±0.34
12
6
4.11±0.30
7.42±0.291)
24
6
4.28±0.29
8.17±0.331)
, 百拇医药
48
6
4.34±0.23
8.25±0.411)
72
6
4.45±0.36
8.27±0.391)
与相应对照组比较：1)P<0.01
从表1和图1可见，复方丹参注射液在一定程度上可增加未激活巨噬细胞NO生成(各剂量组与对照组比较，SNK检验，n=6，P<0.01)，但剂量或时间依赖关系不明显，且对被LPS联合IFN-γ激活的巨噬细胞NO生成无明显影响。
, 百拇医药
2.2 丹酚酸B对巨噬细胞NO生成量的影响 用不同剂量丹酚酸B分别处理未激活和激活(20 ng/ml LPS+2u/ml IFN-γ)巨噬细胞24 h，测定培养液中NO-2浓度，结果见表2。表2可见，丹酚酸B对激活和未激活的巨噬细胞NO生成均无明显影响(SNK检验，P>0.05)。
表2 Sal B对巨噬细胞NO生成的影响(±s) Sal B(μmol/L)
n
NO-2(μmol/L)
未激活组
激活组
, http://www.100md.com
0
6
4.22±0.29
13.41±0.43
1
6
4.34±0.33
13.65±0.51
5
6
4.48±0.37
13.50±0.47
15
, http://www.100md.com
6
4.37±0.35
13.46±0.52
3 讨 论
巨噬细胞内存在诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，可被多种因素诱导产生，如IFN-γ、肿瘤坏死因子等细胞因子及细菌脂多糖等激活，并通过L-精氨酸途径合成NO，起到杀伤多种病原体及肿瘤细胞的作用〔3，4〕。研究表明，在动脉粥样硬化早期内皮细胞损伤、泡沫细胞产生、脂纹形成以及后期的纤维斑块形成过程中，单核细胞来源的巨噬细胞起着举足轻重的作用〔5〕。动脉硬化及高脂血症时，内皮细胞损伤，NO释放减少，导致血小板粘附、聚集及血栓形成〔6〕，活化的血小板释放趋化因子和粘附分子，能促进单核白细胞粘附血管内皮并浸润血管成为巨噬细胞〔7〕。巨噬细胞表面的清道夫受体可识别氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)并大量吞噬而成为泡沫细胞。巨噬细胞本身亦能介导低密度脂蛋白的氧化，实验证明〔8〕，用LPS或IFN-γ刺激巨噬细胞产生的NO，可抑制巨噬细胞介导LDL的氧化。NO供体释放的NO，亦能抑制未激活的巨噬细胞所介导的LDL氧化作用〔9〕。目前，一般认为NO在循环系统中具有舒张血管、抑制平滑肌细胞增殖、抑制血小板聚集和单核细胞粘附以及防止动脉粥样硬化形成等作用。
, 百拇医药
本文研究表明，复方丹参注射液在一定程度上可增加未激活巨噬细胞的NO生成，而Sal B则无此作用，提示可能是丹参中Sal B以外的有效成分或多种成分共同起作用的结果。我们尚不清楚这一作用的机理是通过激活巨噬细胞诱导其iNOS产生，抑或是增加细胞中已有的NOS活性，有待进一步探索。然而，实验结果提示复方丹参注射液活血化瘀的临床功效，可能与其能在一定程度上促进巨噬细胞NO生成有关。
1 广东省重点学科资助课题
作者简介：黄迪南，男，37岁，讲师，从事衰老生物化学研究
参考文献
1 Moncada S，Higgs A.The L-arginine-nitric oxide pathway.N Engl J Med，1993；329(7)：2 002
, http://www.100md.com 2 Ding AH，Nathan CF,Stuhr DJ.Release of reactive nitrogen intermeiates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages.J Immunol，1988；141(7)：2407
3 Lorshach RB，Russel SW.Aspecific sequence of stimulation is required to induce synthesis of the antimicrobial molecule nitric oxide by mouse macrophage.Infect Immunol，1992；267：10976
4 Nathan CF，Hibbs JBJr.Role of nitric oxide synthesis in Mac
, http://www.100md.com
rophage's antimicrobial activity.Curr Opin Immunol，1991；3：65
5 Gerrity RG.The role of the monocyte in atherogenesis:I Transition of blood-borne monocytes into foam cells in fatty lesions.Am J Pathol，1981；103(2)：181
6 Bessenge E.Antiplatelet effects of endothelium-derived relaxing factor and nitrinc oxide donors.Eur Heart J，1991；12(Suppl E)：12
7 Lefer AM，Ma XL.Decreased basal nitric oxide release in hypercholesterolemia increase neutrophil anherence to rabbit coronary artery endothelium.Arterioscler Throms，1993；13(6)：771
, http://www.100md.com
8 Yates MT，Lambert LE,Whitlen JP et al.A Protective role for nitric oxide in the oxidative modification of low-density lipoprotein by mouse macrophages.FEBS Lett，1992；309：135
9 Hogg N，Andrew S,Steven PA et al.Inhibition of macrophage-dependent low density lipoprotein oxidation by nitric oxide donors.J Lipid Res，1995；36：1756
〔1998-04-15收稿 1998-09-17修回〕, http://www.100md.com
单位：广东医学院生化教研室，湛江 524023
关键词：复方丹参注射液；小鼠腹腔巨噬细胞；一氧化氮
中国老年学杂志/990123 摘 要 观察复方丹参注射和丹参的水溶性单体成分丹酚酸B(Sal B)对小鼠腹腔巨噬细胞一氧化氮(NO)合成的影响。结果表明，复方参丹注射液在一定程度上可增加未激活巨噬细胞NO生的临床功效，可能与其能在一定程度上促进巨噬细胞NO生成有关。
Effect of Salviae Miltiorrhize Compound injectio
on the peritoneal macrophage synthesis of nitric oxide of the mice
, 百拇医药
Huang Dinan,Hou Gan,Zhu Qifeng
Biochemical Department of GuangDong Medical College,Zhanjiang 524023
The effect of Salviae Miltiorrhize Compound injectio and Salvianolic acid B on the production of NO-2 and nitric oxide by peritoneal macrophages of the mice were investigated.Salviae Miltiorrhize Compound injectio could induce the increase of NO-2 formation in a partial concentration-dependent and time-dependednt manner,but not with Salvianolic acid B.The data suggest that part of the clinical effect of Salviae Miltiorrhize Compound injectio is the due to the increasing production of nitric oxide.
, 百拇医药
Key words Salviae Miltiorrhize Compound injectio Mouse peritoneal macrophages Nitric Oxide
一氧化氮(NO)是一个具有自由基性质的生物信息分子和效应分子，在体内参与调节心血管紧张度、抑制血小板聚集、参与神经传递和介导免疫应答等诸多病理和生理过程〔1〕。丹参是常用的活血化瘀中药，它具有扩张冠脉、改善血液流变学和抗凝血等作用。为进一步研究丹参的药理作用，本文观察了临床上广泛使用的复方丹参注射液及其丹参的水溶性单体成分丹酚酸B(Sal B)对小鼠腹腔巨噬细胞NO合成的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 复方丹参注射液(河南信阳大别山制药厂，批号：9704142)为丹参、降香提取制成的水溶液，每ml相当于原生药1 g；Sal B(中国科学院药理研究所)。
, 百拇医药
RPMI 1640培养基(GIBCO)，无酚红RPMI 1640培养基(SIGMA)，细菌脂多糖(LPS，SIGMA)，干扰素-γ(IFN-γ，第二军医大学)，余为国产分析纯试剂。
1.2 实验动物 BALP/c小鼠，雌性，7～8 w龄，体重20～25 g，由本校动物中心提供。
1.3 方法
1.3.1 小鼠腹腔巨噬细胞制备 于小鼠腹腔内注射无血清RPMI 1640培养液2 ml，颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡5 min，收集腹腔内液，1 000 r/min离心5 min收集细胞，用含10%小牛血清的RPMI 1604培养液调整细胞浓度至1×106/ml，取24孔细胞培养板，每孔加细胞悬液1 ml，置5%CO2、37 ℃培养12 h，弃去培养液后，再用无酚红RPMI 1640培养液洗去未贴壁细胞，即为所需的巨噬细胞。每孔加1 ml无酚红RPMI 1640培养液，按所需剂量加入药物进行培养。
, 百拇医药
1.3.2 巨噬细胞NO生成量的测定〔2〕 通过测定细胞培养上清液中的NO-2量间接反映巨噬细胞的NO生成量。根据Griess反应测定：取50 μl细胞培养液，加入等量Griess试剂(1%对氨基苯磺酰胺，0.1% N-1-萘乙二胺盐酸盐，2.5%磷酸)，于酶标仪上测定550 nm吸光值，以NaNO2标准溶液制作校正曲线计算NO-2浓度。
1.3.3 统计分析 实验数据用
±s表示，采用SYSTAT统计软件进行统计分析。2 结 果
2.1 复方丹参注射液对巨噬细胞NO生成的影响 培养液中加入20 ng/ml LPS及2 u/ml IFN-γ(终浓度)激活巨噬细胞。分别按0、1‰、2‰、4‰、8‰和16‰终浓度加入复方丹参注射液于激活和末激活的巨噬细胞培养液中。培养24 h后取细胞培养液测定NO-2浓度，结果见图1。
, 百拇医药
●为未激活巨噬细胞；▲为LPS+IFN-γ激活巨噬细胞。
图1 复方丹参注射液作用剂量对巨噬细胞NO生成的影响
用2‰终浓度复方丹参注射液处理未激活的巨噬细胞，于不同时间取细胞培养液测定NO-2浓度，结果见表1。表1 复方丹参注射液作用时间对未激活巨噬细胞NO生成的影响(
±s) 作用时间(h)n
NO-2(μmol/L)
对照组
药物组
, 百拇医药
6
6
3.85±0635
4.29±0.34
12
6
4.11±0.30
7.42±0.291)
24
6
4.28±0.29
8.17±0.331)
, 百拇医药
48
6
4.34±0.23
8.25±0.411)
72
6
4.45±0.36
8.27±0.391)
与相应对照组比较：1)P<0.01
从表1和图1可见，复方丹参注射液在一定程度上可增加未激活巨噬细胞NO生成(各剂量组与对照组比较，SNK检验，n=6，P<0.01)，但剂量或时间依赖关系不明显，且对被LPS联合IFN-γ激活的巨噬细胞NO生成无明显影响。
, 百拇医药
2.2 丹酚酸B对巨噬细胞NO生成量的影响 用不同剂量丹酚酸B分别处理未激活和激活(20 ng/ml LPS+2u/ml IFN-γ)巨噬细胞24 h，测定培养液中NO-2浓度，结果见表2。表2可见，丹酚酸B对激活和未激活的巨噬细胞NO生成均无明显影响(SNK检验，P>0.05)。
表2 Sal B对巨噬细胞NO生成的影响(
±s) Sal B(μmol/L)n
NO-2(μmol/L)
未激活组
激活组
, http://www.100md.com
0
6
4.22±0.29
13.41±0.43
1
6
4.34±0.33
13.65±0.51
5
6
4.48±0.37
13.50±0.47
15
, http://www.100md.com
6
4.37±0.35
13.46±0.52
3 讨 论
巨噬细胞内存在诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，可被多种因素诱导产生，如IFN-γ、肿瘤坏死因子等细胞因子及细菌脂多糖等激活，并通过L-精氨酸途径合成NO，起到杀伤多种病原体及肿瘤细胞的作用〔3，4〕。研究表明，在动脉粥样硬化早期内皮细胞损伤、泡沫细胞产生、脂纹形成以及后期的纤维斑块形成过程中，单核细胞来源的巨噬细胞起着举足轻重的作用〔5〕。动脉硬化及高脂血症时，内皮细胞损伤，NO释放减少，导致血小板粘附、聚集及血栓形成〔6〕，活化的血小板释放趋化因子和粘附分子，能促进单核白细胞粘附血管内皮并浸润血管成为巨噬细胞〔7〕。巨噬细胞表面的清道夫受体可识别氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)并大量吞噬而成为泡沫细胞。巨噬细胞本身亦能介导低密度脂蛋白的氧化，实验证明〔8〕，用LPS或IFN-γ刺激巨噬细胞产生的NO，可抑制巨噬细胞介导LDL的氧化。NO供体释放的NO，亦能抑制未激活的巨噬细胞所介导的LDL氧化作用〔9〕。目前，一般认为NO在循环系统中具有舒张血管、抑制平滑肌细胞增殖、抑制血小板聚集和单核细胞粘附以及防止动脉粥样硬化形成等作用。
, 百拇医药
本文研究表明，复方丹参注射液在一定程度上可增加未激活巨噬细胞的NO生成，而Sal B则无此作用，提示可能是丹参中Sal B以外的有效成分或多种成分共同起作用的结果。我们尚不清楚这一作用的机理是通过激活巨噬细胞诱导其iNOS产生，抑或是增加细胞中已有的NOS活性，有待进一步探索。然而，实验结果提示复方丹参注射液活血化瘀的临床功效，可能与其能在一定程度上促进巨噬细胞NO生成有关。
1 广东省重点学科资助课题
作者简介：黄迪南，男，37岁，讲师，从事衰老生物化学研究
参考文献
1 Moncada S，Higgs A.The L-arginine-nitric oxide pathway.N Engl J Med，1993；329(7)：2 002
, http://www.100md.com 2 Ding AH，Nathan CF,Stuhr DJ.Release of reactive nitrogen intermeiates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages.J Immunol，1988；141(7)：2407
3 Lorshach RB，Russel SW.Aspecific sequence of stimulation is required to induce synthesis of the antimicrobial molecule nitric oxide by mouse macrophage.Infect Immunol，1992；267：10976
4 Nathan CF，Hibbs JBJr.Role of nitric oxide synthesis in Mac
, http://www.100md.com
rophage's antimicrobial activity.Curr Opin Immunol，1991；3：65
5 Gerrity RG.The role of the monocyte in atherogenesis:I Transition of blood-borne monocytes into foam cells in fatty lesions.Am J Pathol，1981；103(2)：181
6 Bessenge E.Antiplatelet effects of endothelium-derived relaxing factor and nitrinc oxide donors.Eur Heart J，1991；12(Suppl E)：12
7 Lefer AM，Ma XL.Decreased basal nitric oxide release in hypercholesterolemia increase neutrophil anherence to rabbit coronary artery endothelium.Arterioscler Throms，1993；13(6)：771
, http://www.100md.com
8 Yates MT，Lambert LE,Whitlen JP et al.A Protective role for nitric oxide in the oxidative modification of low-density lipoprotein by mouse macrophages.FEBS Lett，1992；309：135
9 Hogg N，Andrew S,Steven PA et al.Inhibition of macrophage-dependent low density lipoprotein oxidation by nitric oxide donors.J Lipid Res，1995；36：1756
〔1998-04-15收稿 1998-09-17修回〕, http://www.100md.com