联合应用酶消化和机械刷洗提取气道上皮细胞的实验技术①
作者：秦晓群 孙秀泓 张长青
单位：秦晓群 孙秀泓 张长青(生理学研究室 长沙 410078)
关键词：细胞培养；细胞分离；支气管；上皮细胞
湖南医科大学学报990124 提要 采用低浓度胰酶对兔气道的上皮侧进行温和消化后用乳胶刷机械刷洗，获取兔气管、支气管上皮细胞进行原代培养。通过免疫细胞化学、电子显微镜等鉴定细胞，测定细胞成活率及细胞膜完整性，并与单纯机械刷洗及单纯酶消化进行比较。结果显示，用该实验技术获得的气管、支气管上皮细胞有较高的纯度和成活率，是一种实用、有效的小动物支气管上皮细胞分离方法。
中国图书分类号 R332
Technique of enzyme digestion adding brushing for
, 百拇医药
isolating bronchial epithelial cells
Qin Xiaoqun Sun Xiuhong Zhang Changqing
(Department of Physiology， Hunan Medical University, Changsha 410078)
This study improved the previous techniques of harvesting rabbit bronchial epithelial cells. With 0.05% of trypsin on the epithelial side of trachea and bronchus, a mild digestion was used before a brushing protocol. The cells were identified with immunocytochemistry and electromicroscope, both the cell viability and the membrane integrity of cells were evaluated. A comparison analysis of this method with the simple mechanic brushing and the simple digestion method were done. The results showed that, with this method, cells in a high purity and high viability could be obtained and the recovered cell number could be enough for experiments. It can be concluded that the method is useful and effective for isolating bronchial epithelial cells especially for small animals.
, http://www.100md.com
Key words cells cultured; cell,separation; bronchi; epithelial cells
气道上皮细胞是功能活跃的细胞，不仅构成呼吸道的物理屏障，还具有对化学性毒物或药物的转化代谢作用，有自分泌或旁分泌功能，参与对毗邻细胞功能的调控[1]。常见的气道疾病的发生与气道上皮细胞的损伤或功能缺陷有关。近年来，实验研究所用的气道上皮细胞主要以单纯机械刷洗法或单纯酶消化法获得，但细胞收获量、纯度、成活率等难以达到满意的水平。本文对上述方法予以改良，联合应用酶消化加刷洗法提取兔气管、支气管上皮细胞，旨在获取适用于原代培养的细胞数量和质量。
1 材料与方法
1.1 实验材料 动物为新西兰兔，雌雄不拘，体重1.5±0.3kg。尚备(括号内为来源)：胰蛋白酶(Sigma公司)、RPMI 1640培养基(日本产)、胰岛素(Sigma公司)、角蛋白免疫组化试剂盒(华美公司)、3H-UdR(中国原子能研究所)、乳胶刷(自制)、离心涂片机(Eppendorf)、臭氧发生器(湖南有色冶金研究所)、臭氧染毒室(自制)、液闪仪(Beckman)等。
, 百拇医药
1.2 气道上皮细胞提取及培养 (1)单纯机械刷洗：股动脉放血处死动物，用乳胶刷蘸Hanks液刷洗气管和支气管，再将粘附于乳胶刷上之细胞洗脱于Hanks液中收集，离心洗涤，培养液悬浮。(2)单纯酶消化：取出气管及支气管，仔细去除其周围的结缔组织，在Hanks液中短暂漂洗。以0.15%胰蛋白酶溶液充灌气管和支气管腔，结扎密闭，在4℃冰箱中过夜。用注射器加压注射Hanks液冲洗管腔，收集冲洗液，离心洗涤，分离气道上皮细胞。(3)酶消化加刷洗：分离气管、支气管，用0.05%胰蛋白酶溶液充灌气管和支气管腔，结扎密闭，于37℃消化1h，纵行剪开气管和支气管，加血清终止消化反应。用乳胶刷刷洗管腔面，收集刷洗液，4号针头挤压分散，离心1?000?r.min-1，5min，洗涤3次。用培养液悬浮细胞，于平皿中37℃空气孵育过夜，更换培养液，收集贴壁细胞。进行细胞计数、成活率计数及上皮细胞纯度计数。培养体系为RPMI 1640，胰岛素(40U.L-1)，青霉素(100U.ml-1)及链霉素(100μg.ml-1)。
, 百拇医药
1.3 细胞纯度及鉴定 细胞离心洗涤后，用Hanks液悬浮细胞成5×105个.ml-1，取100μl离心涂片，冷丙酮固定后，用抗角蛋白(cytokeratin)单克隆抗体进行SP法免疫细胞化学反应，DAB显色阳性为上皮细胞。采用Gimsa染色，显微镜下观察上皮细胞的形态，进行细胞纯度计数。细胞离心沉淀锇酸固定，超薄切片，电镜观察细胞超微结构。
1.4 细胞活性检测 采用台盼蓝排斥法计数细胞成活率。为检测细胞膜的完整性，用3H-UdR(1μCi.ml-1)标记细胞过夜，离心并反复洗涤，更换培养液，置空气中一定时间。测定不同时间点上清液中的自发3H释放量，以反映细胞膜的完整性。设置浓度为1.5ppm的臭氧攻击组作为阳性对照。
2 结 果
, 百拇医药 2.1 气道上皮细胞的免疫细胞化学鉴定 抗角蛋白免疫细胞化学反应显示，DAB阳性显色的细胞达93±4%。光镜下细胞形态呈柱状、锥状等，大部分有纤毛，分散或成簇状分布，具有气管、支气管上皮细胞的特征[2]。
2.2 纤毛细胞的电镜观察 电镜可见典型的气管和支气管上皮中的纤毛柱状细胞，核位于中部，胞膜及核膜边界清晰，无核异质；胞质内线粒体较丰富；细胞一侧有纤毛，纤毛纵切面内有与纤毛纵轴平行的中央微管与周围微管，每根纤毛的根部有一基体，基体一侧近细胞表面有矩突(图1A)；纤毛中部横切面可见特征性“9×2+2”微管图像(图1B)，为气道上皮细胞的纤毛所特有[3]。
图1 气道纤毛上皮细胞的超微结构(×10?000)
Fig. 1 Ultrastructure of bronchial epithelial ciliated cell
, 百拇医药
2.3 气道上皮细胞提取方法比较 结果见附表。单纯机械刷洗获得的上皮细胞纯度较高，但成活率低；单纯酶消化可提高成活率(P<0.05)，但细胞收获量小(P<0.01)，纯度也降低(P<0.05)；联合应用酶消化加刷洗法显著提高细胞的收获量(P<0.01)和成活率(P<0.05)，并保持较高的细胞纯度。
附表 兔气道上皮细胞提取方法比较 组别
样本
数
细胞数
(×107/兔)
纯度
(%)
成活率
, 百拇医药
(%)
单纯刷洗
18
1.35±0.23
93.64±3.84
57.21±9.28
单纯消化
12
0.73±0.42②
85.14±4.96①
75.79±9.45①
, 百拇医药
消化后刷洗
14
2.41±0.54②
89.50±4.42
78.93±5.74①
与单纯刷洗组比较：①P<0.05；②P<0.01
2.4 细胞膜完整性检测 图2可见，各时段细胞的自发3H释放量很低，放置时间长短对3H释放影响不大；而受臭氧攻击的阳性对照组3H释放明显增高，并随攻击时间延长而增大。表明所提取的细胞在受臭氧攻击之前膜的完整性良好。
, 百拇医药
图2 气道上皮细胞自发3H释放的时-效关系
Fig. 2 Correlation between spontaneous 3H release of bronchial epithelial cells and air exposure time(n=4)
3 讨 论
气道上皮为假复层纤毛柱状上皮，由多种细胞构成。主要为纤毛细胞，其顶部伸至上皮腔面，细胞间有连接复合体，维持上皮的完整性，其间夹杂杯状细胞、基细胞、刷细胞、Clara细胞、神经内分泌细胞等。基细胞位于上皮基底部，数量较多，与纤毛细胞间借桥粒连接，底部以半桥粒锚定于基膜上。基细胞有分裂增殖能力，是纤毛细胞的前体。纤毛细胞脱落时，基细胞可增殖、分化为纤毛细胞，完成上皮的更新和修复[4]。支气管上皮细胞离体培养一定时间后，细胞形状发生变化，呈梭形或球形，纤毛结构退化或消失。上皮细胞特征性地表达角蛋白，可用抗角蛋白抗体进行免疫细胞化学鉴定及纯度分析[5]。
, http://www.100md.com
在细胞和分子水平上对气道上皮的研究起步较晚，主要受到细胞提取的收获量、细胞纯度、成活率等因素的限制。单纯酶消化法较早应用于分离大动物的支气管上皮细胞。本文观察到用此法获得的上皮细胞成活率较高，但细胞收获量小，细胞纯度偏低。此结果与国外报道接近[6]。可能由于酶消化作用强不易控制条件，故细胞收获量小，并且不能清除成纤维细胞等间质细胞的沾染，影响细胞纯度。单纯机械刷洗主要用于临床检测或实验研究，在支纤镜操作下，分离人支气管上皮细胞，获得的细胞纯度可达90%以上。单纯机械刷洗获得的主要是气道上皮衰老并容易脱落的纤毛细胞。本实验用此法提取的兔支气管上皮细胞纯度与文献报道接近，成活率较低但略高于文献报道[7]，收获量也不高，难以进行分子水平的实验研究。本文改用0.05%胰蛋白酶在气管、支气管上皮一侧进行1h温和消化，使富含蛋白质的细胞间桥粒和半桥粒解裂，细胞易于分散脱落，而对细胞本身的消化损伤小。在此基础上，加用乳胶刷机械刷洗，使处于基底层的基细胞大量回收，明显提高了细胞的收获量与成活率。由于只在上皮侧进行温和消化，故不会使成纤维细胞脱落，保证了细胞的纯度。本组用此改良方法提取兔支气管上皮细胞原代培养，并用分子生物学技术检测细胞内bcl-2和c-myc基因表达，实验结果满意。
, 百拇医药
作者：秦晓群 男 39岁 副教授 ①国家自然科学基金资助课题(编号39770635)
参考文献
[1]Becker KL. The coming of age of a bronchial epithelial cell. Am Rev Respir Dis, 1993,148:1166-1168
[2]Vignola AM, Campbell AM, Chanez P, et al. HLA-DR and ICAM-1 expression on bronchial epithelial cells in asthma and chronic bronchitis. Am Rev Respir Dis, 1993,148:689-694
[3]Junqueira LC, Calneiro J, Long JA. Epithelial tissue. In: Basic Histology. 5th ed. Los Altos, California: Longe Medical Publications, 1986:64-92
, 百拇医药
[4]Mason RJ, Williams MC, Moses HL, et al. Stem cells in lung development, disease, and therapy. Am J Respir Cell Mol Biol, 1997,16:355-363
[5]Nakamura Y, Tate L, Ertl RF, et al. Bronchial epithelial cells regulate fibroblast proliferation. Am J Physiol, 1995,269:L377-L387
[6]Kim JS, Mckinnis VS, White SR. Migration of guinea pig airway epithelial cells in response to bombestin analogues. Am J Respir Cell Mol Biol, 1997,16:259-266
[7]Willey JC, Coy E, Brolly C, et al. Xenobiotic metabolism enzyme gene expression in human bronchial epithelial and alveolar macrophages cells. Am J Respir Cell Mol Biol, 1996,14:263-271
1998-08-25 收稿, 百拇医药
单位：秦晓群 孙秀泓 张长青(生理学研究室 长沙 410078)
关键词：细胞培养；细胞分离；支气管；上皮细胞
湖南医科大学学报990124 提要 采用低浓度胰酶对兔气道的上皮侧进行温和消化后用乳胶刷机械刷洗，获取兔气管、支气管上皮细胞进行原代培养。通过免疫细胞化学、电子显微镜等鉴定细胞，测定细胞成活率及细胞膜完整性，并与单纯机械刷洗及单纯酶消化进行比较。结果显示，用该实验技术获得的气管、支气管上皮细胞有较高的纯度和成活率，是一种实用、有效的小动物支气管上皮细胞分离方法。
中国图书分类号 R332
Technique of enzyme digestion adding brushing for
, 百拇医药
isolating bronchial epithelial cells
Qin Xiaoqun Sun Xiuhong Zhang Changqing
(Department of Physiology， Hunan Medical University, Changsha 410078)
This study improved the previous techniques of harvesting rabbit bronchial epithelial cells. With 0.05% of trypsin on the epithelial side of trachea and bronchus, a mild digestion was used before a brushing protocol. The cells were identified with immunocytochemistry and electromicroscope, both the cell viability and the membrane integrity of cells were evaluated. A comparison analysis of this method with the simple mechanic brushing and the simple digestion method were done. The results showed that, with this method, cells in a high purity and high viability could be obtained and the recovered cell number could be enough for experiments. It can be concluded that the method is useful and effective for isolating bronchial epithelial cells especially for small animals.
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Key words cells cultured; cell,separation; bronchi; epithelial cells
气道上皮细胞是功能活跃的细胞，不仅构成呼吸道的物理屏障，还具有对化学性毒物或药物的转化代谢作用，有自分泌或旁分泌功能，参与对毗邻细胞功能的调控[1]。常见的气道疾病的发生与气道上皮细胞的损伤或功能缺陷有关。近年来，实验研究所用的气道上皮细胞主要以单纯机械刷洗法或单纯酶消化法获得，但细胞收获量、纯度、成活率等难以达到满意的水平。本文对上述方法予以改良，联合应用酶消化加刷洗法提取兔气管、支气管上皮细胞，旨在获取适用于原代培养的细胞数量和质量。
1 材料与方法
1.1 实验材料 动物为新西兰兔，雌雄不拘，体重1.5±0.3kg。尚备(括号内为来源)：胰蛋白酶(Sigma公司)、RPMI 1640培养基(日本产)、胰岛素(Sigma公司)、角蛋白免疫组化试剂盒(华美公司)、3H-UdR(中国原子能研究所)、乳胶刷(自制)、离心涂片机(Eppendorf)、臭氧发生器(湖南有色冶金研究所)、臭氧染毒室(自制)、液闪仪(Beckman)等。
, 百拇医药
1.2 气道上皮细胞提取及培养 (1)单纯机械刷洗：股动脉放血处死动物，用乳胶刷蘸Hanks液刷洗气管和支气管，再将粘附于乳胶刷上之细胞洗脱于Hanks液中收集，离心洗涤，培养液悬浮。(2)单纯酶消化：取出气管及支气管，仔细去除其周围的结缔组织，在Hanks液中短暂漂洗。以0.15%胰蛋白酶溶液充灌气管和支气管腔，结扎密闭，在4℃冰箱中过夜。用注射器加压注射Hanks液冲洗管腔，收集冲洗液，离心洗涤，分离气道上皮细胞。(3)酶消化加刷洗：分离气管、支气管，用0.05%胰蛋白酶溶液充灌气管和支气管腔，结扎密闭，于37℃消化1h，纵行剪开气管和支气管，加血清终止消化反应。用乳胶刷刷洗管腔面，收集刷洗液，4号针头挤压分散，离心1?000?r.min-1，5min，洗涤3次。用培养液悬浮细胞，于平皿中37℃空气孵育过夜，更换培养液，收集贴壁细胞。进行细胞计数、成活率计数及上皮细胞纯度计数。培养体系为RPMI 1640，胰岛素(40U.L-1)，青霉素(100U.ml-1)及链霉素(100μg.ml-1)。
, 百拇医药
1.3 细胞纯度及鉴定 细胞离心洗涤后，用Hanks液悬浮细胞成5×105个.ml-1，取100μl离心涂片，冷丙酮固定后，用抗角蛋白(cytokeratin)单克隆抗体进行SP法免疫细胞化学反应，DAB显色阳性为上皮细胞。采用Gimsa染色，显微镜下观察上皮细胞的形态，进行细胞纯度计数。细胞离心沉淀锇酸固定，超薄切片，电镜观察细胞超微结构。
1.4 细胞活性检测 采用台盼蓝排斥法计数细胞成活率。为检测细胞膜的完整性，用3H-UdR(1μCi.ml-1)标记细胞过夜，离心并反复洗涤，更换培养液，置空气中一定时间。测定不同时间点上清液中的自发3H释放量，以反映细胞膜的完整性。设置浓度为1.5ppm的臭氧攻击组作为阳性对照。
2 结 果
, 百拇医药 2.1 气道上皮细胞的免疫细胞化学鉴定 抗角蛋白免疫细胞化学反应显示，DAB阳性显色的细胞达93±4%。光镜下细胞形态呈柱状、锥状等，大部分有纤毛，分散或成簇状分布，具有气管、支气管上皮细胞的特征[2]。
2.2 纤毛细胞的电镜观察 电镜可见典型的气管和支气管上皮中的纤毛柱状细胞，核位于中部，胞膜及核膜边界清晰，无核异质；胞质内线粒体较丰富；细胞一侧有纤毛，纤毛纵切面内有与纤毛纵轴平行的中央微管与周围微管，每根纤毛的根部有一基体，基体一侧近细胞表面有矩突(图1A)；纤毛中部横切面可见特征性“9×2+2”微管图像(图1B)，为气道上皮细胞的纤毛所特有[3]。
图1 气道纤毛上皮细胞的超微结构(×10?000)
Fig. 1 Ultrastructure of bronchial epithelial ciliated cell
, 百拇医药
2.3 气道上皮细胞提取方法比较 结果见附表。单纯机械刷洗获得的上皮细胞纯度较高，但成活率低；单纯酶消化可提高成活率(P<0.05)，但细胞收获量小(P<0.01)，纯度也降低(P<0.05)；联合应用酶消化加刷洗法显著提高细胞的收获量(P<0.01)和成活率(P<0.05)，并保持较高的细胞纯度。
附表 兔气道上皮细胞提取方法比较 组别
样本
数
细胞数
(×107/兔)
纯度
(%)
成活率
, 百拇医药
(%)
单纯刷洗
18
1.35±0.23
93.64±3.84
57.21±9.28
单纯消化
12
0.73±0.42②
85.14±4.96①
75.79±9.45①
, 百拇医药
消化后刷洗
14
2.41±0.54②
89.50±4.42
78.93±5.74①
与单纯刷洗组比较：①P<0.05；②P<0.01
2.4 细胞膜完整性检测 图2可见，各时段细胞的自发3H释放量很低，放置时间长短对3H释放影响不大；而受臭氧攻击的阳性对照组3H释放明显增高，并随攻击时间延长而增大。表明所提取的细胞在受臭氧攻击之前膜的完整性良好。
, 百拇医药
图2 气道上皮细胞自发3H释放的时-效关系
Fig. 2 Correlation between spontaneous 3H release of bronchial epithelial cells and air exposure time(n=4)
3 讨 论
气道上皮为假复层纤毛柱状上皮，由多种细胞构成。主要为纤毛细胞，其顶部伸至上皮腔面，细胞间有连接复合体，维持上皮的完整性，其间夹杂杯状细胞、基细胞、刷细胞、Clara细胞、神经内分泌细胞等。基细胞位于上皮基底部，数量较多，与纤毛细胞间借桥粒连接，底部以半桥粒锚定于基膜上。基细胞有分裂增殖能力，是纤毛细胞的前体。纤毛细胞脱落时，基细胞可增殖、分化为纤毛细胞，完成上皮的更新和修复[4]。支气管上皮细胞离体培养一定时间后，细胞形状发生变化，呈梭形或球形，纤毛结构退化或消失。上皮细胞特征性地表达角蛋白，可用抗角蛋白抗体进行免疫细胞化学鉴定及纯度分析[5]。
, http://www.100md.com
在细胞和分子水平上对气道上皮的研究起步较晚，主要受到细胞提取的收获量、细胞纯度、成活率等因素的限制。单纯酶消化法较早应用于分离大动物的支气管上皮细胞。本文观察到用此法获得的上皮细胞成活率较高，但细胞收获量小，细胞纯度偏低。此结果与国外报道接近[6]。可能由于酶消化作用强不易控制条件，故细胞收获量小，并且不能清除成纤维细胞等间质细胞的沾染，影响细胞纯度。单纯机械刷洗主要用于临床检测或实验研究，在支纤镜操作下，分离人支气管上皮细胞，获得的细胞纯度可达90%以上。单纯机械刷洗获得的主要是气道上皮衰老并容易脱落的纤毛细胞。本实验用此法提取的兔支气管上皮细胞纯度与文献报道接近，成活率较低但略高于文献报道[7]，收获量也不高，难以进行分子水平的实验研究。本文改用0.05%胰蛋白酶在气管、支气管上皮一侧进行1h温和消化，使富含蛋白质的细胞间桥粒和半桥粒解裂，细胞易于分散脱落，而对细胞本身的消化损伤小。在此基础上，加用乳胶刷机械刷洗，使处于基底层的基细胞大量回收，明显提高了细胞的收获量与成活率。由于只在上皮侧进行温和消化，故不会使成纤维细胞脱落，保证了细胞的纯度。本组用此改良方法提取兔支气管上皮细胞原代培养，并用分子生物学技术检测细胞内bcl-2和c-myc基因表达，实验结果满意。
, 百拇医药
作者：秦晓群 男 39岁 副教授 ①国家自然科学基金资助课题(编号39770635)
参考文献
[1]Becker KL. The coming of age of a bronchial epithelial cell. Am Rev Respir Dis, 1993,148:1166-1168
[2]Vignola AM, Campbell AM, Chanez P, et al. HLA-DR and ICAM-1 expression on bronchial epithelial cells in asthma and chronic bronchitis. Am Rev Respir Dis, 1993,148:689-694
[3]Junqueira LC, Calneiro J, Long JA. Epithelial tissue. In: Basic Histology. 5th ed. Los Altos, California: Longe Medical Publications, 1986:64-92
, 百拇医药
[4]Mason RJ, Williams MC, Moses HL, et al. Stem cells in lung development, disease, and therapy. Am J Respir Cell Mol Biol, 1997,16:355-363
[5]Nakamura Y, Tate L, Ertl RF, et al. Bronchial epithelial cells regulate fibroblast proliferation. Am J Physiol, 1995,269:L377-L387
[6]Kim JS, Mckinnis VS, White SR. Migration of guinea pig airway epithelial cells in response to bombestin analogues. Am J Respir Cell Mol Biol, 1997,16:259-266
[7]Willey JC, Coy E, Brolly C, et al. Xenobiotic metabolism enzyme gene expression in human bronchial epithelial and alveolar macrophages cells. Am J Respir Cell Mol Biol, 1996,14:263-271
1998-08-25 收稿, 百拇医药