3种保存血样方法对猪总DNA制备的影响
作者：刘中禄 王 勇 朱富旭 吴丰春 魏 泓
单位：第三军医大学实验动物中心教研室 重庆，400038
关键词：血样保存；猪全血；总DNA制备
第三军医大学学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE1999年 第21卷 第1期 VOL
提 要：目的探索不同保存血样方法对猪全血中总DNA制备的影响。方法：采取全血4℃保存(方法Ⅰ)、沉淀白细胞加消化液室温保存(方法Ⅱ)和全血加SDS-EDTANa2缓冲液室温保存(方法Ⅲ)等3种方法保存血样，用常规方法制备总DNA并对其效果进行评价。结果：方法Ⅰ、Ⅱ均能得到较纯净、完整的DNA，方法Ⅲ得率高、简便，但DNA有一定降解。结论：因方法Ⅱ勿需低温冷藏，可作为野外远距离采血的首选方法。
, 百拇医药
中图法分类号：R446.11
Effects of three sample preservation methods on total DNA preparation of porcie whole blood*
Liu Zhonglu, Wang Yong, Zu Fuxu, Wei Hong
(Laboratory Animal Center, Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
Abstract Objective: To investigate the effects of different blood sample preservation methods on total DNA preparation of porcine whole blood. Methods: The three methods used in the study were as followings: 1) Method I-the blood sample was stored at 4℃. 2) Method Ⅱ-leukocyte sediment was added to the digestive solution and then stored at room temperature. 3) Method Ⅲ-the blood sample was mixed with SDS-EDTANa2 and then stored at room temperature. Total DNA was purified by Phenol/Chloroform extraction and ethanol precipitation. Results: Pure and intact total DNA was obtained with all the three methods. Though the use of method Ⅲ resulted in more DNA, DNA was destroyed to some extent. Conclusion: Method Ⅱ does not need low temperature storage condition. Therefore, it is the best way to store blood samples for outdoor sample collection.
, 百拇医药
Key words porcine whole blood; total DNA; preparation; preservation
* This project was supported by the National Natural Science Foundation of China,No.39770398
野外远距离采血制备总DNA，如果血样保存不当，必然严重影响DNA的质量。为解决野外远距采血血样保存问题，根据课题实际，本研究采取3种方法保存血样，常规方法制备总DNA，分别以总DNA的得率、纯度、完整性以及基因组DNA的RAPD和mtDNA的D-loop PCR为指标，对其效果进行评价，以达到优选适合野外远距离采血血样保存方法的目的。
1 材料和方法
1.1 样品来源
, 百拇医药
来自同一头杂交长白猪(由第三军医大学实验动物中心提供)的前腔静脉血200 ml，ACD抗凝。
1.2 血样的保存
1.2.1全血4℃保存(方法Ⅰ)分别取10 ml抗凝血于4支50 ml离心管中，置4℃存。
1.2.2 沉淀白细胞加消化液室温保存(方法Ⅱ) 分别取10 ml抗凝血于4支50 ml离心管中，加入等体积2×ST(0.64 mol/L蔗糖、0.02 mol/L Tris-HCl pH7.6、0.01 mol/L MgCL2、2%TritonX-100)，充分振荡混匀，冰浴15 min，破碎红细胞。加10 ml 1×ST洗1～2次。每管加入消化液：STE(10 mmol/L Tris-HCl pH8.0、25 mmol/L EDTANa2、100 mmol/L NaCl 5 ml和SDS、蛋白酶K(终浓度分别为1%和0.1 mg/ml)，充分振荡，室温保存。
, http://www.100md.com
1.2.3 全血加SDS-EDTANa2缓冲液室温保存(方法Ⅲ)分别取10 ml抗凝血于4支50 ml离心管中，加入等体积的SDS-EDTANa2缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl pH8.0、100 mmol/L EDTANa2、2%SDS)和蛋白酶K(终浓度为0.1 mg/ml)，充分振荡混匀，室温保存。
1.3 总DNA的制备
3组样品分别在0d和8d各取2管，于37℃消化过夜，其中方法Ⅰ须先沉淀白细胞和加消化液(同方法Ⅱ)。按常规酚、氯仿、异戊醇抽提，乙醇沉淀DNA，12000×g离心，TE溶解。
1.4 总DNA质量评估
应用752型紫外光栅分光光度计测定其得率和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳和RAPD检查基因组DNA的完整性，以mtDNA D-loop PCR检查mtDNA的存在。
, 百拇医药
2 结果
2.1 DNA得率和纯度
3种血样保存方法制备的总DNA纯度(D260/D280)在1.4～1.7之间。各组得率比较，方法Ⅰ与方法Ⅱ无差别，方法Ⅲ在0 d和8 d均显著高于方法Ⅰ、Ⅱ。
2.2 总DNA琼脂糖凝胶电泳结果，见图1
图1 1%琼脂糖凝胶检测总DNA的电泳结果
Fig 1 Total DNA of detection by agarose
gel electrophoresis
, 百拇医药
1,8：method Ⅲ0 d；2,3：method Ⅱ8 d；4：method Ⅱ0 d；5,6：method Ⅰ8 d；7：method Ⅰ0 d；9,10：mehtod Ⅲ4℃ 8 d；11～14：method Ⅲ8 d
方法Ⅰ、Ⅱ0 d和8 d以及方法Ⅲ的0 d制备的总DNA谱带清晰一致，DNA较完整，而方法Ⅲ8 d，出现拖尾现象。
2.3 mtDNA D-loop PCR结果,见图2
图2 猪mtDNA D-loop的扩增
Fig 2 Amplification of the porcine mtDNA D-loop
1：method Ⅰ0 d;2：method Ⅰ8 d；3：method Ⅱ0 d；4：method Ⅱ8 d；5：method Ⅲ0 d；6：method Ⅲ8 d
, 百拇医药
3种方法在0 d和8 d所制备的总DNA，均能得到mtDNA D-loop区域的清晰的扩增带。
2.4 基因组DNA RAPD分析结果,见图3
图3 猪总DNA的RAPD分析
Fig 3 Analysis of porcine total DNA by RAPD
1：method Ⅰ0 d；2：method Ⅰ8 d；3：method Ⅱ0 d；4：method ：Ⅱ8 d；5：method Ⅲ0 d；6：method Ⅲ8 d
3种方法在各天所制备的总DNA，进行RAPD分析，均得到一致的谱带。
, 百拇医药
3 讨论
3.1 关于总DNA的得率和纯度
3种保存方法制备的总DNA纯度在1.4～1.7之间，表明有一定量未抽提净的蛋白质存在，这与抽提过程有关，若增加酚抽提步骤即可有效去除蛋白质。但该纯度已能达到常规分子生物学实验要求。方法Ⅲ得率较高，是因为省略了先沉淀白细胞步骤，直接破裂全血中的白细胞，减少了白细胞的丢失。
3.2 总DNA完整性比较
琼脂糖凝胶电泳结果表明，方法Ⅰ、Ⅱ谱带完整、一致，而方法Ⅲ8d出现拖尾现象，说明DNA有一定降解，可能是因为SDS-EDTANa2或蛋白酶k浓度低，未能较好地抑制核酸酶的活性，为证实这一点，本实验将方法Ⅲ血样置4℃保存8 d作对照，使核酸酶在低温下活性变低，得到与方法Ⅰ、Ⅱ一致的结果。
, http://www.100md.com 基因组DNA RAPD分析和mtDNA D-Loop PCR分析结果显示，3种方法所得总DNA均能得到较好的扩增结果，证明所制备的总DNA较完整，符合常规分子生物学实验要求。
3.3 3种血样保存方法综合评价
在野外条件下采血，应用方法Ⅰ需要低温冷藏，方法Ⅱ需离心分离设备，方法Ⅲ最为简便，但DNA有一定程度的降解。笔者认为方法Ⅱ较好，通过对南宁(300头)，贵阳(250头)和西双版纳(250头)共计800头猪血样的野外采集，远距离运输和实验室制备总DNA，得到满意效果，进一步证实方法Ⅱ(沉淀白细胞加消化液)是保存血样中总DNA的实用方法。
国家自然科学基金资助项目，NO.39770398 国家'九五"重点科技攻关项目，96-A23-06-01
作者简介：刘中禄，32,讲师,硕士
, http://www.100md.com
参考文献
[1] Boyum A. Separation of white blood cell. Nature,1964,204(2):794
[2] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd ed. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1992.304～314，463～468
[3] 方福德，周 吕，于 濂，等.现代医学实验技巧全书.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995.586～592
[4] 乔守怡.从固定白细胞中分离DNA研究人的TK基因多态性.细胞生物学杂志，1992，14(2)：91
[5] 陈俊杰，游乐然，张秋萍，等.3种提取血细胞基因组DNA方法的比较.遗传与疾病，1988，4(5)：230
[6] 方福德.两种提取血细胞DNA方法的比较.中华血液学杂志，1985，6(7)：432
收稿：1998-06-04；修回：1998-10-07, 百拇医药
单位：第三军医大学实验动物中心教研室 重庆，400038
关键词：血样保存；猪全血；总DNA制备
第三军医大学学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE1999年 第21卷 第1期 VOL
提 要：目的探索不同保存血样方法对猪全血中总DNA制备的影响。方法：采取全血4℃保存(方法Ⅰ)、沉淀白细胞加消化液室温保存(方法Ⅱ)和全血加SDS-EDTANa2缓冲液室温保存(方法Ⅲ)等3种方法保存血样，用常规方法制备总DNA并对其效果进行评价。结果：方法Ⅰ、Ⅱ均能得到较纯净、完整的DNA，方法Ⅲ得率高、简便，但DNA有一定降解。结论：因方法Ⅱ勿需低温冷藏，可作为野外远距离采血的首选方法。
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中图法分类号：R446.11
Effects of three sample preservation methods on total DNA preparation of porcie whole blood*
Liu Zhonglu, Wang Yong, Zu Fuxu, Wei Hong
(Laboratory Animal Center, Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
Abstract Objective: To investigate the effects of different blood sample preservation methods on total DNA preparation of porcine whole blood. Methods: The three methods used in the study were as followings: 1) Method I-the blood sample was stored at 4℃. 2) Method Ⅱ-leukocyte sediment was added to the digestive solution and then stored at room temperature. 3) Method Ⅲ-the blood sample was mixed with SDS-EDTANa2 and then stored at room temperature. Total DNA was purified by Phenol/Chloroform extraction and ethanol precipitation. Results: Pure and intact total DNA was obtained with all the three methods. Though the use of method Ⅲ resulted in more DNA, DNA was destroyed to some extent. Conclusion: Method Ⅱ does not need low temperature storage condition. Therefore, it is the best way to store blood samples for outdoor sample collection.
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Key words porcine whole blood; total DNA; preparation; preservation
* This project was supported by the National Natural Science Foundation of China,No.39770398
野外远距离采血制备总DNA，如果血样保存不当，必然严重影响DNA的质量。为解决野外远距采血血样保存问题，根据课题实际，本研究采取3种方法保存血样，常规方法制备总DNA，分别以总DNA的得率、纯度、完整性以及基因组DNA的RAPD和mtDNA的D-loop PCR为指标，对其效果进行评价，以达到优选适合野外远距离采血血样保存方法的目的。
1 材料和方法
1.1 样品来源
, 百拇医药
来自同一头杂交长白猪(由第三军医大学实验动物中心提供)的前腔静脉血200 ml，ACD抗凝。
1.2 血样的保存
1.2.1全血4℃保存(方法Ⅰ)分别取10 ml抗凝血于4支50 ml离心管中，置4℃存。
1.2.2 沉淀白细胞加消化液室温保存(方法Ⅱ) 分别取10 ml抗凝血于4支50 ml离心管中，加入等体积2×ST(0.64 mol/L蔗糖、0.02 mol/L Tris-HCl pH7.6、0.01 mol/L MgCL2、2%TritonX-100)，充分振荡混匀，冰浴15 min，破碎红细胞。加10 ml 1×ST洗1～2次。每管加入消化液：STE(10 mmol/L Tris-HCl pH8.0、25 mmol/L EDTANa2、100 mmol/L NaCl 5 ml和SDS、蛋白酶K(终浓度分别为1%和0.1 mg/ml)，充分振荡，室温保存。
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1.2.3 全血加SDS-EDTANa2缓冲液室温保存(方法Ⅲ)分别取10 ml抗凝血于4支50 ml离心管中，加入等体积的SDS-EDTANa2缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl pH8.0、100 mmol/L EDTANa2、2%SDS)和蛋白酶K(终浓度为0.1 mg/ml)，充分振荡混匀，室温保存。
1.3 总DNA的制备
3组样品分别在0d和8d各取2管，于37℃消化过夜，其中方法Ⅰ须先沉淀白细胞和加消化液(同方法Ⅱ)。按常规酚、氯仿、异戊醇抽提，乙醇沉淀DNA，12000×g离心，TE溶解。
1.4 总DNA质量评估
应用752型紫外光栅分光光度计测定其得率和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳和RAPD检查基因组DNA的完整性，以mtDNA D-loop PCR检查mtDNA的存在。
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2 结果
2.1 DNA得率和纯度
3种血样保存方法制备的总DNA纯度(D260/D280)在1.4～1.7之间。各组得率比较，方法Ⅰ与方法Ⅱ无差别，方法Ⅲ在0 d和8 d均显著高于方法Ⅰ、Ⅱ。
2.2 总DNA琼脂糖凝胶电泳结果，见图1
图1 1%琼脂糖凝胶检测总DNA的电泳结果
Fig 1 Total DNA of detection by agarose
gel electrophoresis
, 百拇医药
1,8：method Ⅲ0 d；2,3：method Ⅱ8 d；4：method Ⅱ0 d；5,6：method Ⅰ8 d；7：method Ⅰ0 d；9,10：mehtod Ⅲ4℃ 8 d；11～14：method Ⅲ8 d
方法Ⅰ、Ⅱ0 d和8 d以及方法Ⅲ的0 d制备的总DNA谱带清晰一致，DNA较完整，而方法Ⅲ8 d，出现拖尾现象。
2.3 mtDNA D-loop PCR结果,见图2
图2 猪mtDNA D-loop的扩增
Fig 2 Amplification of the porcine mtDNA D-loop
1：method Ⅰ0 d;2：method Ⅰ8 d；3：method Ⅱ0 d；4：method Ⅱ8 d；5：method Ⅲ0 d；6：method Ⅲ8 d
, 百拇医药
3种方法在0 d和8 d所制备的总DNA，均能得到mtDNA D-loop区域的清晰的扩增带。
2.4 基因组DNA RAPD分析结果,见图3
图3 猪总DNA的RAPD分析
Fig 3 Analysis of porcine total DNA by RAPD
1：method Ⅰ0 d；2：method Ⅰ8 d；3：method Ⅱ0 d；4：method ：Ⅱ8 d；5：method Ⅲ0 d；6：method Ⅲ8 d
3种方法在各天所制备的总DNA，进行RAPD分析，均得到一致的谱带。
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3 讨论
3.1 关于总DNA的得率和纯度
3种保存方法制备的总DNA纯度在1.4～1.7之间，表明有一定量未抽提净的蛋白质存在，这与抽提过程有关，若增加酚抽提步骤即可有效去除蛋白质。但该纯度已能达到常规分子生物学实验要求。方法Ⅲ得率较高，是因为省略了先沉淀白细胞步骤，直接破裂全血中的白细胞，减少了白细胞的丢失。
3.2 总DNA完整性比较
琼脂糖凝胶电泳结果表明，方法Ⅰ、Ⅱ谱带完整、一致，而方法Ⅲ8d出现拖尾现象，说明DNA有一定降解，可能是因为SDS-EDTANa2或蛋白酶k浓度低，未能较好地抑制核酸酶的活性，为证实这一点，本实验将方法Ⅲ血样置4℃保存8 d作对照，使核酸酶在低温下活性变低，得到与方法Ⅰ、Ⅱ一致的结果。
, http://www.100md.com 基因组DNA RAPD分析和mtDNA D-Loop PCR分析结果显示，3种方法所得总DNA均能得到较好的扩增结果，证明所制备的总DNA较完整，符合常规分子生物学实验要求。
3.3 3种血样保存方法综合评价
在野外条件下采血，应用方法Ⅰ需要低温冷藏，方法Ⅱ需离心分离设备，方法Ⅲ最为简便，但DNA有一定程度的降解。笔者认为方法Ⅱ较好，通过对南宁(300头)，贵阳(250头)和西双版纳(250头)共计800头猪血样的野外采集，远距离运输和实验室制备总DNA，得到满意效果，进一步证实方法Ⅱ(沉淀白细胞加消化液)是保存血样中总DNA的实用方法。
国家自然科学基金资助项目，NO.39770398 国家'九五"重点科技攻关项目，96-A23-06-01
作者简介：刘中禄，32,讲师,硕士
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参考文献
[1] Boyum A. Separation of white blood cell. Nature,1964,204(2):794
[2] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd ed. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1992.304～314，463～468
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[4] 乔守怡.从固定白细胞中分离DNA研究人的TK基因多态性.细胞生物学杂志，1992，14(2)：91
[5] 陈俊杰，游乐然，张秋萍，等.3种提取血细胞基因组DNA方法的比较.遗传与疾病，1988，4(5)：230
[6] 方福德.两种提取血细胞DNA方法的比较.中华血液学杂志，1985，6(7)：432
收稿：1998-06-04；修回：1998-10-07, 百拇医药