血小板内皮细胞粘附因子对脐血造血细胞的影响
作者：李夏新 洪平 曹琼
单位：第一军医大学南方医院儿科，广州，510510；广州军区157医院二内科，广州，510515
关键词：CD31分子；脐血；造血细胞
血小板内皮细胞粘附因子对脐血造血细胞的影响 摘要：目的 观察CD31分子在脐血造血细胞的分布和IP28A-CD31单抗对造血祖细胞CFU-GM和BFU-E的集落形成的影响，方法 应用单克隆抗体结合免疫荧光流式细胞仪技术进行免疫分型和分选脐血造血细胞。结果 CD31分子分布于所有脐血的CD34+细胞和部分T、B、NK淋巴细胞， IP28A-CD31单抗在SCF、GM-CSF和EPO存在下能明显增加脐血CFU-GM和BFU-E的集落产率。结论 CD31分子广泛分布于脐血造血细胞，并对脐血造血细胞有正调控作用。
中图分类号：R457.7
, http://www.100md.com
Effects of platelet endothelial cell adhesion molecule-1(CD31) on cord blood hematopoietic cells
Li Xiaxin Chao Qiong
Department of Pediatric, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515;
Hong Ping
Department of the Second Internal Medicine, 157 Hospital of PLA, Guangzhou, 510510
Abstract: Objective To observe the distribution of a platelet endothelial cell adhesion molecule-1(CD31) in hematopoietic cells from human cord blood and effects IP28A-CD31 monoclonal antibody (mAb) on the plating efficiencies of hematopoietic progenitor cells, CFU-GM and BFU-E. Methods Immunotyping and classification and selection of the hematopoietic cells were performed by direct immunofluorescent determination with appropriate mAb using flow cytometry. Results CD31 molecule expressed on all of CD34+ cells and a part of T, B and NK lymphocytes of cord blood. IP28A-CD31 mAb could increase the plating efficiencies of cord blood hematopoietic cells in the present of stem cell factor, GM-CSF and EPO. Conclusion CD31 molecule could express widely on the cord blood hematopoietic cells and positively regulate those cells' growth.
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Key words: CD31 molecule; cord blood; hematopoietic cells
除了分泌一些造血因子外，造血微环境也产生大量的粘附因子调节造血细胞功能，如帮助造血细胞寻找特定的着藏区域及对局部刺激的反应[1,2]。血小板内皮细胞粘附分子1(Platelet endothelial cell adhesion molecule1,PECAM-1或CD31)就是其中之一，这一相对分子质量为130 000的跨膜蛋白存在于血小板、血管内皮细胞、细胞和粒/巨噬祖细胞[3]，也存在于CD34+细胞[4]，提示它可能对造血细胞有一定的影响。本研究旨在探讨它对脐血造血细胞CFU-GM，BFU-E集落形成的影响。
1 材料和方法
1.1 标本来源 脐血由本院妇产科收集，骨髓标本来源于正常骨髓供体。
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1.2 单克隆抗体 抗CD31(IP28A,Bensussen 博士赠送，巴黎)，CD3，CD4，CD8，CD16，CD19(FITC)和CD34(PE)及用于间接荧光FITC标记的羊抗鼠IgG 多克隆抗体均购于 Becton Dickinson公司(CA,USA)。
1.3 免疫荧光标记 新鲜脐血经Ficoll离心，所得的单个核细胞用CD34，IP28A，CD3，CD4，CD8，CD16，CD19单抗按常规免疫荧光方法标记，即单个核细胞经1640培养基洗涤2次后，再用含2%的小牛血清白蛋白的PBS缓冲液洗2次，然后用不同的单抗于4 ℃下标记细胞30 min，最后在FACS Vantage (Becton Dickinson, CA)进行细胞免疫分型和分选CD34细胞[5]。
1.4 造血细胞集落分析 CFU-GM和BFU-E分析用琼脂半固体法，简要为2×10 5/ml脐血单个核细胞或103/ml的脐血CD34+细胞培养于含30%琼脂、20%小牛血清的1640培养基，对CFU-GM培养加基因重组的人干细胞因子(rhSCF)100 μg/L (Amgen)和rhGM-CSF 5 μg/L (Boehringer)。同样对BFU-E培养加2 000 U/L EPO (Beohringer)。实验组加抗体IP28A (0.1~1.0 g/L)，并以无关抗体CD106 (0.5~1.0 mg/L)为对照组。每个样品分3个培养皿，于5% CO2饱和湿度37 ℃下培养14 d，倒置显微镜下记数细胞集落和簇。
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1.5 统计学分析 每组实验重复5次，用线性回归方法分析结果。
2 结果
2.1 CD31分子在脐血单个核细胞的分布 经2色免疫荧光标记流式细胞仪技术分析脐血淋巴细胞各亚群的CD31分子表达，结果显示CD31分子分布于淋巴细胞各亚群，在脐血单个核细胞中IP28A+细胞占28±10.9、CD3+IP28A+细胞为17.8±7.7(占CD3+细胞数的50%，CD3+细胞为36.8±6.6)、CD4+IP28A+细胞13.4±4.3(也占CD4+细胞的1/2，CD4+细胞为26.2±7.4)CD8+IP28A+细胞5.2±2.5(占CD8+细胞的1/3，CD8+细胞为16.5±4.4)，T辅助细胞CD4+的阳性率高于T细胞毒CD8+细胞；CD16+的NK细胞阳性率(9%)高于CD19+B淋巴细胞(5%)(图1)。用免疫磁珠方法分离的CD34+细胞(纯度在90%以上)，再用IP28A标记CD34+细胞，结果全部CD34+细胞均为IP28A阳性细胞(图2)。
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2.2 IP28A/CD31单抗对脐血造血细胞的影响 为了探讨CD31分子对造血干/祖细胞的功能作用，应用体外造血祖细胞(CFU-GM和BFU-E)培养技术，观察了IP28A单克隆抗体对造血祖细胞增殖分化的影响，结果表明在单个核细胞水平，IP28A单抗明显增加CFU-GM集落形成数(P=0.004)，细胞簇数也有增加的趋势，但在统计学上无显著性差异，同样加了IP28A单抗的培养皿中BFU-E 集落数也明显增加(对照组为102±54，0.1 μg组为133±75，0.5 μg组为124±71，1.0 μg组为121±64，实验组与对照组的P=0.0001)，而不同IP28A单抗浓度(0.1、0.5、1.0 mg/L)对CFU-GM和BFU-E的集落形成并无统计学上的差异(P >0.05)，但当IP28A单抗浓度低于0.1 mg/L时对集落生成的影响明显减低。在对照组中加CD106抗体与加生理盐水对CFU-GM和BFU-E集落形成的影响并无差异。说明IP28A单抗可能直接作用于造血祖细胞，为此运用分离的CD34+细胞进行5次实验，发现CFU-GM的产率增加30%以上(P <0.001)。
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3 讨论
造血微环境对造血的调控表现在多方面，通过分泌各种造血因子、产生一些粘附分子和细胞以及细胞间的相互接触来传递刺激或抑制造血的信息。Stockinge[3]等发现CD31分子广泛分布于CD4+细胞、CD8+细胞、B细胞和NK细胞，本研究也得到类似的结果，然而更为有趣的是所有CD34+脐血细胞均为CD31+细胞。提示该分子对脐血造血细胞的增殖分化有一定的影响，因而应用CD31抗体—IP28A去结合该分子的配体，体外培养造血细胞直接观察它对脐血造血细胞的增殖作用。结果发现，该抗体能增加脐血单个核细胞和CD34+细胞的CFU-GM和BFU-E的集落形成能力，说明该分子参与脐血造血调控，其可能的机理是一方面促使造血细胞表达更多的造血因子受体，增加造血细胞对造血因子刺激的敏感性；另一方面促使造血细胞分泌造血因子[6]，但必须排除CD31分子对造血辅助细胞如T细胞、单个核细胞和NK细胞的作用所引发的间接造血调控的影响[7]，确切的机理有待于进一步探讨。
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作者简介：李夏新，男，1962年出生，1989年毕业于第一军医大学，硕士，副教授。
参考文献
1 Hardy CL, Tavassoli M. Homing of hemopoietic stem cells to hemo-poietic stoma. Adv Exp Med Biol,1988,241:129
2 Kincade PW, Lee G, Pietrangeli CE et al. Cells and molecules that regulate B lymphopoiesis in bone marrow. Annu Rev Immunol,1989, 7:111
3 Stockinger H, Gadd SJ, Eher R. et al. Molecular characterization and functional analysis of the leukocyte cell surface protein CD31. J Immunol, 1990, 145:3889
, 百拇医药
4 Watte SH, Williamson J, Genevier H et al. The Heparin binding PECAM-1 adhesion molecule is expressed by CD31+ hematopoietic precursor cells with early myeloid and B lymphoid cell phenotypes. Blood , 1993, 82:2649
5 Bensussan A, Gluckman E, EL Marsafy S et al. By 55 monoclonal antibody delineates within human cord blood and bone marrow lymphocytes distinct cell subsets mediating cytotoxic activity. Proc Natl Acad Sci USA , 1994, 91:9136
, 百拇医药
6 Schibler KR, Li Y, Ohls RK et al. Possible mechanisms accounting for the growth factor independence of hematopoietic progenitors from umbilical cord blood. Blood, 1994, 84:3679
7 Piali L, Albbelda SM, Baldwin HS et al. Murine platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1)/CD31 modulates B integrins on lympho-cyte-activated killer cells. Eur J Immunol ,1993, 23:246
(收稿日期：1998-08-09), 百拇医药
单位：第一军医大学南方医院儿科，广州，510510；广州军区157医院二内科，广州，510515
关键词：CD31分子；脐血；造血细胞
血小板内皮细胞粘附因子对脐血造血细胞的影响 摘要：目的 观察CD31分子在脐血造血细胞的分布和IP28A-CD31单抗对造血祖细胞CFU-GM和BFU-E的集落形成的影响，方法 应用单克隆抗体结合免疫荧光流式细胞仪技术进行免疫分型和分选脐血造血细胞。结果 CD31分子分布于所有脐血的CD34+细胞和部分T、B、NK淋巴细胞， IP28A-CD31单抗在SCF、GM-CSF和EPO存在下能明显增加脐血CFU-GM和BFU-E的集落产率。结论 CD31分子广泛分布于脐血造血细胞，并对脐血造血细胞有正调控作用。
中图分类号：R457.7
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Effects of platelet endothelial cell adhesion molecule-1(CD31) on cord blood hematopoietic cells
Li Xiaxin Chao Qiong
Department of Pediatric, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515;
Hong Ping
Department of the Second Internal Medicine, 157 Hospital of PLA, Guangzhou, 510510
Abstract: Objective To observe the distribution of a platelet endothelial cell adhesion molecule-1(CD31) in hematopoietic cells from human cord blood and effects IP28A-CD31 monoclonal antibody (mAb) on the plating efficiencies of hematopoietic progenitor cells, CFU-GM and BFU-E. Methods Immunotyping and classification and selection of the hematopoietic cells were performed by direct immunofluorescent determination with appropriate mAb using flow cytometry. Results CD31 molecule expressed on all of CD34+ cells and a part of T, B and NK lymphocytes of cord blood. IP28A-CD31 mAb could increase the plating efficiencies of cord blood hematopoietic cells in the present of stem cell factor, GM-CSF and EPO. Conclusion CD31 molecule could express widely on the cord blood hematopoietic cells and positively regulate those cells' growth.
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Key words: CD31 molecule; cord blood; hematopoietic cells
除了分泌一些造血因子外，造血微环境也产生大量的粘附因子调节造血细胞功能，如帮助造血细胞寻找特定的着藏区域及对局部刺激的反应[1,2]。血小板内皮细胞粘附分子1(Platelet endothelial cell adhesion molecule1,PECAM-1或CD31)就是其中之一，这一相对分子质量为130 000的跨膜蛋白存在于血小板、血管内皮细胞、细胞和粒/巨噬祖细胞[3]，也存在于CD34+细胞[4]，提示它可能对造血细胞有一定的影响。本研究旨在探讨它对脐血造血细胞CFU-GM，BFU-E集落形成的影响。
1 材料和方法
1.1 标本来源 脐血由本院妇产科收集，骨髓标本来源于正常骨髓供体。
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1.2 单克隆抗体 抗CD31(IP28A,Bensussen 博士赠送，巴黎)，CD3，CD4，CD8，CD16，CD19(FITC)和CD34(PE)及用于间接荧光FITC标记的羊抗鼠IgG 多克隆抗体均购于 Becton Dickinson公司(CA,USA)。
1.3 免疫荧光标记 新鲜脐血经Ficoll离心，所得的单个核细胞用CD34，IP28A，CD3，CD4，CD8，CD16，CD19单抗按常规免疫荧光方法标记，即单个核细胞经1640培养基洗涤2次后，再用含2%的小牛血清白蛋白的PBS缓冲液洗2次，然后用不同的单抗于4 ℃下标记细胞30 min，最后在FACS Vantage (Becton Dickinson, CA)进行细胞免疫分型和分选CD34细胞[5]。
1.4 造血细胞集落分析 CFU-GM和BFU-E分析用琼脂半固体法，简要为2×10 5/ml脐血单个核细胞或103/ml的脐血CD34+细胞培养于含30%琼脂、20%小牛血清的1640培养基，对CFU-GM培养加基因重组的人干细胞因子(rhSCF)100 μg/L (Amgen)和rhGM-CSF 5 μg/L (Boehringer)。同样对BFU-E培养加2 000 U/L EPO (Beohringer)。实验组加抗体IP28A (0.1~1.0 g/L)，并以无关抗体CD106 (0.5~1.0 mg/L)为对照组。每个样品分3个培养皿，于5% CO2饱和湿度37 ℃下培养14 d，倒置显微镜下记数细胞集落和簇。
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1.5 统计学分析 每组实验重复5次，用线性回归方法分析结果。
2 结果
2.1 CD31分子在脐血单个核细胞的分布 经2色免疫荧光标记流式细胞仪技术分析脐血淋巴细胞各亚群的CD31分子表达，结果显示CD31分子分布于淋巴细胞各亚群，在脐血单个核细胞中IP28A+细胞占28±10.9、CD3+IP28A+细胞为17.8±7.7(占CD3+细胞数的50%，CD3+细胞为36.8±6.6)、CD4+IP28A+细胞13.4±4.3(也占CD4+细胞的1/2，CD4+细胞为26.2±7.4)CD8+IP28A+细胞5.2±2.5(占CD8+细胞的1/3，CD8+细胞为16.5±4.4)，T辅助细胞CD4+的阳性率高于T细胞毒CD8+细胞；CD16+的NK细胞阳性率(9%)高于CD19+B淋巴细胞(5%)(图1)。用免疫磁珠方法分离的CD34+细胞(纯度在90%以上)，再用IP28A标记CD34+细胞，结果全部CD34+细胞均为IP28A阳性细胞(图2)。
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2.2 IP28A/CD31单抗对脐血造血细胞的影响 为了探讨CD31分子对造血干/祖细胞的功能作用，应用体外造血祖细胞(CFU-GM和BFU-E)培养技术，观察了IP28A单克隆抗体对造血祖细胞增殖分化的影响，结果表明在单个核细胞水平，IP28A单抗明显增加CFU-GM集落形成数(P=0.004)，细胞簇数也有增加的趋势，但在统计学上无显著性差异，同样加了IP28A单抗的培养皿中BFU-E 集落数也明显增加(对照组为102±54，0.1 μg组为133±75，0.5 μg组为124±71，1.0 μg组为121±64，实验组与对照组的P=0.0001)，而不同IP28A单抗浓度(0.1、0.5、1.0 mg/L)对CFU-GM和BFU-E的集落形成并无统计学上的差异(P >0.05)，但当IP28A单抗浓度低于0.1 mg/L时对集落生成的影响明显减低。在对照组中加CD106抗体与加生理盐水对CFU-GM和BFU-E集落形成的影响并无差异。说明IP28A单抗可能直接作用于造血祖细胞，为此运用分离的CD34+细胞进行5次实验，发现CFU-GM的产率增加30%以上(P <0.001)。
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3 讨论
造血微环境对造血的调控表现在多方面，通过分泌各种造血因子、产生一些粘附分子和细胞以及细胞间的相互接触来传递刺激或抑制造血的信息。Stockinge[3]等发现CD31分子广泛分布于CD4+细胞、CD8+细胞、B细胞和NK细胞，本研究也得到类似的结果，然而更为有趣的是所有CD34+脐血细胞均为CD31+细胞。提示该分子对脐血造血细胞的增殖分化有一定的影响，因而应用CD31抗体—IP28A去结合该分子的配体，体外培养造血细胞直接观察它对脐血造血细胞的增殖作用。结果发现，该抗体能增加脐血单个核细胞和CD34+细胞的CFU-GM和BFU-E的集落形成能力，说明该分子参与脐血造血调控，其可能的机理是一方面促使造血细胞表达更多的造血因子受体，增加造血细胞对造血因子刺激的敏感性；另一方面促使造血细胞分泌造血因子[6]，但必须排除CD31分子对造血辅助细胞如T细胞、单个核细胞和NK细胞的作用所引发的间接造血调控的影响[7]，确切的机理有待于进一步探讨。
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作者简介：李夏新，男，1962年出生，1989年毕业于第一军医大学，硕士，副教授。
参考文献
1 Hardy CL, Tavassoli M. Homing of hemopoietic stem cells to hemo-poietic stoma. Adv Exp Med Biol,1988,241:129
2 Kincade PW, Lee G, Pietrangeli CE et al. Cells and molecules that regulate B lymphopoiesis in bone marrow. Annu Rev Immunol,1989, 7:111
3 Stockinger H, Gadd SJ, Eher R. et al. Molecular characterization and functional analysis of the leukocyte cell surface protein CD31. J Immunol, 1990, 145:3889
, 百拇医药
4 Watte SH, Williamson J, Genevier H et al. The Heparin binding PECAM-1 adhesion molecule is expressed by CD31+ hematopoietic precursor cells with early myeloid and B lymphoid cell phenotypes. Blood , 1993, 82:2649
5 Bensussan A, Gluckman E, EL Marsafy S et al. By 55 monoclonal antibody delineates within human cord blood and bone marrow lymphocytes distinct cell subsets mediating cytotoxic activity. Proc Natl Acad Sci USA , 1994, 91:9136
, 百拇医药
6 Schibler KR, Li Y, Ohls RK et al. Possible mechanisms accounting for the growth factor independence of hematopoietic progenitors from umbilical cord blood. Blood, 1994, 84:3679
7 Piali L, Albbelda SM, Baldwin HS et al. Murine platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1)/CD31 modulates B integrins on lympho-cyte-activated killer cells. Eur J Immunol ,1993, 23:246
(收稿日期：1998-08-09), 百拇医药