用125I-M胆碱受体亚型特异抗体测定大鼠脏器M受体亚型的分布*
作者：高汝桢 赵树进 刘福祥 何世红 孙桂玲
单位：广州军区广州总医院1核医学科；药剂科，广州，510010；广州医药卫生研究所，广州，510180
关键词：毒覃碱样乙酰胆碱能受体；抗体；生物学分布
用125I 摘要：目的 人类多种疾病在M胆碱受体(M-AchR)亚型的分布上有差别。本研究旨在根据M受体的氨基酸序列，合成人工多肽抗原，研究大鼠主要脏器M受体亚型的分布。方法 制备特异性M1和 M2受体抗体，用125I标记两种抗体，注射到大鼠体内。结果 研究显示M1和 M2受体在大鼠心脏、肝脏、气管平滑肌、肾脏及肺组织中分布不同。结论 人工抗体抗原诱发的M受体亚型抗体特异性好，为进行M受体亚型检测提供比较简便、可靠的方法。
, 百拇医药
中图分类号：Q954.63
Determination of subtype-specific biodistribution of muscarinic acetylcholine receptors in the organs of rat by 125I -labeled antibody subtype to subtype of the receptor
Gao Ruzhen Liu Fuxiang He Shihong
Department of epartment of Nuclear Medici
Zhao Shujin
Department of Pharmacy Guangzhou General Hospital of PLA, Guangzhou,510010
, 百拇医药
Sun Guiling
Hygeian Institute of Guangzhou ,Guangzhou,510180 Abstract: Objective To determine subtype-specific biodistribution of muscarinic acetylcholine receptors (m-AchR). Methods The subtypes of the antibodies against the synthetic peptides were prepared corresponding to sequence of the N-end polypeptides of M1 and M2 subtypes of mAchR. antibodies were labeled by 125I. The rats were killed by decapitation at 3 after injection of 125I-antibody. The activity of the heart, liver, lungs, kidneys and bronchi were measured separately. Results The biodistribution was different of subtype-specific antibodies M1and M2. M1 was 55.2% and M2 was 41.5% at the bronchi of rats. Conclusion The antibodies were well specific, which would be valuable for future study of other subtypes of mAchR.
, 百拇医药
Key words: muscarinic acetylcholine receptor; antibody; biodistribution
1 材料与方法
1.1合成多肽及制备抗原 选择M受体多肽链的细胞外N端部分节段的氨基酸序列作为人工抗原的多肽组成，根据表1列出人M受体亚型的氨基酸序列，用多肽合成仪合成多肽，并通过反相HPLC纯化。
表1 M1 、M2 受体N端部分节段的氨基酸序列
Tab.1 Sequence of N-end amino acid of M1 and M2 subtypes of M-AchR
Receptor
, 百拇医药
Amino acid residue
Amino acid sequence
M1
1~23
MNTSAPPAVSPNITVLAPGKGPW
M2
1~21
MNNSTNSSNNSLALTSPYKTF
A液：血蓝蛋白(KLH)150 mg溶于1 ml甘油。B液：合成多肽用二甲基亚砜完全溶解，磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)稀释至3 ml。将两溶液合并，用PBS稀释至总体积5~7 ml，同时加入碘化[1-环巳基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺]-CDC 20 mg作为缩合剂，振摇20~30 min，Sephadex G50柱层析分离，收集第一峰全峰液，即为联接KLH肽，用PBS稀释至10 g/l，4 ℃保存。
, 百拇医药
1.2 抗肽抗体制备及IgG的分离纯化 肽-KLH复合物用 PBS(pH 7.4)配成 10 g/l溶液，加福氏完全佐剂(1:1)，作为抗原免疫新西兰大耳兔(雌雄并用，体质量2.5~3.0 kg，由第一军医大学动物中心提供)。皮下多点注射，每只2 mg，以后每隔三周用肽-KLH复合物加福氏不完全佐剂(1:1)皮下及皮内多点注射，共注射5次，最后一次每只静脉注射1 mg，以加强免疫。免疫注射后耳缘静脉取血测定抗血清效价。最后一次注射1周后，家兔颈静脉放血，常规方法分离血清。
1.3 抗血清的鉴定
1.3.1 将合成多肽作为抗原包被到96孔ELISA反应板中(1.0μg/每孔,含0.15%戊二醛)，4 ℃过夜， 充分淋洗后用2%牛血清白蛋白封闭， 置37 ℃ 2 h，洗涤3次；加入1:200% 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(兰州生物制品所产品)，37 ℃再温育 2 h，洗涤3次；加入邻苯二胺底物液，37 ℃ 20 min，最后加入2 mol/L硫酸溶液终止反应。490 nm读取吸光度值。两种血清效价均在1:105以上，两种抗血清无交叉反应，表明抗体具有较高效价及较好的特异性。
, 百拇医药
1.3.2 将成年大鼠(体质量250 g，由中山医科大学动物中心提供)断头取完整大脑，加入PBS(pH 7.6 含0.25 mol/L蔗糖)，置内切式匀浆器匀浆1 min；用Teflon匀浆器匀浆，离心2 000×g 10 min；将上清液转入另一试管中，离心，27 500g，15 min；沉淀用适量包埋液混匀，配成不同浓度，包埋至96孔ELISA反应板中，封闭，各孔加入不同稀释度的兔抗M1 IgG及兔抗M2 IgG；酶标Ⅱ抗及底物反应等操作步骤同上。不同浓度脑膜悬液及不同稀释度的抗体进行方阵滴定，结果见表2 。证实两种抗体均有很好的特异性，最佳稀释浓度分别为1:400和1:100。
表2 不同浓度脑膜混悬液包被及不同稀释度抗体的测定结果
Tab. 2 The results of determination of meninx suspension at different concentrations with antibodies at different dilutions
, 百拇医药
Antibody dilution
Concentration
1 000
250
62.5
15.6
3.9
0.97
0.24
0.06
1:1 600(M1)
-
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-
-
+
+
+
+
-
1:400(M1)
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+
++
+++
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+++
+
1:100(M1)
-
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+
+
+++
+++
+++
+
1:1 600(M2)
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1:400(M2)
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+
++
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+
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1:100(M2)
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++
+
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1:100(normal rabbit serum)
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1.4 125I 标记抗体 采用氯胺-T法，特异性抗体1.2 mg/ 0.2 ml ，加入0.5 mol/L PBS 50μl，再加入 125I 37.0~55.5 MBq(1.0 ~1.5 mCi)，混匀，迅速加入新鲜配制氯胺-T 40μg/10μl，60 s后用偏重亚硫酸钠终止反应，SephadexG25层析分离，收集第一峰全部峰液。
1.5 M1和M2受体在大鼠部分脏器中分布的测定 SD大鼠，体质量250~280 g，雄性(由中山医科大学动物中心提供)。乙醚浅麻醉后，从阴茎背静脉注射1:160的125I-抗M1或抗M2受体IgG 1 ml，3 h后断头处死，取心脏、肺、气管平滑肌、肝脏、肾，制备各脏器的细胞膜标本。制膜前用PBS洗净血液并将每一标本称量，以每克样本的放射性计数表示受体抗体与脏器内受体结合量。
, 百拇医药
2 结果
125I 标记M1和M2抗体用Sephadex G25分离，见图1、2。标记率62.7%~75.2%，计算放射比活度为135.27 kBq /μg(5.01 μCi/μg)。制备部分脏器的细胞膜标本，分别置入Philips PW4242系列的井型γ探测器测定其每分钟计数(min-1)，记录肺、心脏、气管平滑肌、肝脏及肾脏每克组织的min-1。以5种组织的总放射性为百分之百，比较M1和M2受体在不同组织的分布。M1受体分布比例依次为13.6%、7.2%、55.2%、8.4%和15.7%，M2受体比例为14.8%、8.1%、41.5%、18.9%和16.7%。
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图1 125I标记M1受体抗体分离纯化图谱
Fig. 1 Purification of 125I labeled muscarinic receptor antibody M1
图2 125I标记M2受体抗体分离纯化图谱
Fig. 2 Purification of 125I labeled muscarinic receptor antibody M2
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3 讨论
毒覃碱样胆碱受体(M受体)广泛分布于中枢及外围神经组织、心脏、平滑肌及各种腺体中，通过与不同的鸟核苷酸结合蛋白(G蛋白)偶联引起一系列生理生化反应，如血管平滑肌舒张，心率减慢，心收缩力减弱，胃肠和膀胱平滑肌收缩力加强，腺苷酸环化酶活性改变，肌醇磷酯系统激活及离子通道开放或关闭等，这些作用有时表现为兴奋，有时表现为抑制。不同脏器的不同反应，与各组织器官特点及其具有不同类型的M受体有关。1980年，Hammer[2]提出根据对M受体拮抗剂Pirenzepine的亲和力不同将M受体分成两种亚型，广泛分布于神经组织中的M1受体和主要分布于效应器官的M2受体。分子生物学研究结果进一步表明至少存在5种M受体亚型[4]。以往对M受体的检测多采用放射配基结合分析法或放射自显影法，由于核素标记配基对M受体亚型的选择性比较差，无法检测M受体亚型。本实验选用人工抗原诱发的M受体亚型特异抗体，采用免疫学方法检测M受体及其亚型，结果证实抗体特异性好。作者认为应用该抗体可进一步研究M受体的分子作用机制，为进行M受体亚型检测提供比较简便可靠的方法。
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由于IgG分子不能通过血脑屏障，静脉注入后只能观察外围脏器的M受体分布，以5种脏器的放射性分布作为100%，只是表示5种脏器组织中M1和M2受体分布的相对差异。我们观察到大鼠心脏、肝脏、气管平滑肌、肾脏及肺组织中，M1受体和M2受体存在着分布差异，其生理意义尚不清楚，某些免疫调节性疾病如哮喘、甲状腺功能低下等，已观察到M受体的分布量及反应性有改变[5]，是否与气管平滑肌M受体分布增高有关，尚需进一步研究。本实验由于是在活体给药后制备标本，所以每只动物的每一脏器只能测定一种受体亚型及每种亚型在5个脏器内的分布比例。若采用不同核素标记，则可测出特定脏器两种亚型的比值。
参考文献
1 Bonner TI. The molecular basis of muscarinic receptor diversity. Trends Neurosci, 1989, 12:148
, 百拇医药
2 Hammer R, Berrie CP, Birdsall NJ. A pirenzepine distinguishes between different subclasses of muscarinic receptors. Nature (Lond), 1980, 83:90
3 Wang SZ, Zhu SZ, Mash DC et al. Comparison of the concentration of messenger RNA encoding four muscarinic receptor's subtypes in control and Alzheimer brains. Brain Res Mol Brain Res, 1992,16(1-2):64
4 Nathanson NM. Molecular properties of the muscarinic acetycholine receptor. Annu Rev Neurosci, 1987,10:195
5 胡雅儿,卞以洁,易宁育等. 用放射性配基结合分析法测定甲低小鼠脑M受体.中华核医学杂志,1989, 2:91
(收稿日期：1998-08-12), http://www.100md.com
单位：广州军区广州总医院1核医学科；药剂科，广州，510010；广州医药卫生研究所，广州，510180
关键词：毒覃碱样乙酰胆碱能受体；抗体；生物学分布
用125I 摘要：目的 人类多种疾病在M胆碱受体(M-AchR)亚型的分布上有差别。本研究旨在根据M受体的氨基酸序列，合成人工多肽抗原，研究大鼠主要脏器M受体亚型的分布。方法 制备特异性M1和 M2受体抗体，用125I标记两种抗体，注射到大鼠体内。结果 研究显示M1和 M2受体在大鼠心脏、肝脏、气管平滑肌、肾脏及肺组织中分布不同。结论 人工抗体抗原诱发的M受体亚型抗体特异性好，为进行M受体亚型检测提供比较简便、可靠的方法。
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中图分类号：Q954.63
Determination of subtype-specific biodistribution of muscarinic acetylcholine receptors in the organs of rat by 125I -labeled antibody subtype to subtype of the receptor
Gao Ruzhen Liu Fuxiang He Shihong
Department of epartment of Nuclear Medici
Zhao Shujin
Department of Pharmacy Guangzhou General Hospital of PLA, Guangzhou,510010
, 百拇医药
Sun Guiling
Hygeian Institute of Guangzhou ,Guangzhou,510180 Abstract: Objective To determine subtype-specific biodistribution of muscarinic acetylcholine receptors (m-AchR). Methods The subtypes of the antibodies against the synthetic peptides were prepared corresponding to sequence of the N-end polypeptides of M1 and M2 subtypes of mAchR. antibodies were labeled by 125I. The rats were killed by decapitation at 3 after injection of 125I-antibody. The activity of the heart, liver, lungs, kidneys and bronchi were measured separately. Results The biodistribution was different of subtype-specific antibodies M1and M2. M1 was 55.2% and M2 was 41.5% at the bronchi of rats. Conclusion The antibodies were well specific, which would be valuable for future study of other subtypes of mAchR.
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Key words: muscarinic acetylcholine receptor; antibody; biodistribution
1 材料与方法
1.1合成多肽及制备抗原 选择M受体多肽链的细胞外N端部分节段的氨基酸序列作为人工抗原的多肽组成，根据表1列出人M受体亚型的氨基酸序列，用多肽合成仪合成多肽，并通过反相HPLC纯化。
表1 M1 、M2 受体N端部分节段的氨基酸序列
Tab.1 Sequence of N-end amino acid of M1 and M2 subtypes of M-AchR
Receptor
, 百拇医药
Amino acid residue
Amino acid sequence
M1
1~23
MNTSAPPAVSPNITVLAPGKGPW
M2
1~21
MNNSTNSSNNSLALTSPYKTF
A液：血蓝蛋白(KLH)150 mg溶于1 ml甘油。B液：合成多肽用二甲基亚砜完全溶解，磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)稀释至3 ml。将两溶液合并，用PBS稀释至总体积5~7 ml，同时加入碘化[1-环巳基-3-(3-三甲氨丙基)碳二亚胺]-CDC 20 mg作为缩合剂，振摇20~30 min，Sephadex G50柱层析分离，收集第一峰全峰液，即为联接KLH肽，用PBS稀释至10 g/l，4 ℃保存。
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1.2 抗肽抗体制备及IgG的分离纯化 肽-KLH复合物用 PBS(pH 7.4)配成 10 g/l溶液，加福氏完全佐剂(1:1)，作为抗原免疫新西兰大耳兔(雌雄并用，体质量2.5~3.0 kg，由第一军医大学动物中心提供)。皮下多点注射，每只2 mg，以后每隔三周用肽-KLH复合物加福氏不完全佐剂(1:1)皮下及皮内多点注射，共注射5次，最后一次每只静脉注射1 mg，以加强免疫。免疫注射后耳缘静脉取血测定抗血清效价。最后一次注射1周后，家兔颈静脉放血，常规方法分离血清。
1.3 抗血清的鉴定
1.3.1 将合成多肽作为抗原包被到96孔ELISA反应板中(1.0μg/每孔,含0.15%戊二醛)，4 ℃过夜， 充分淋洗后用2%牛血清白蛋白封闭， 置37 ℃ 2 h，洗涤3次；加入1:200% 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(兰州生物制品所产品)，37 ℃再温育 2 h，洗涤3次；加入邻苯二胺底物液，37 ℃ 20 min，最后加入2 mol/L硫酸溶液终止反应。490 nm读取吸光度值。两种血清效价均在1:105以上，两种抗血清无交叉反应，表明抗体具有较高效价及较好的特异性。
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1.3.2 将成年大鼠(体质量250 g，由中山医科大学动物中心提供)断头取完整大脑，加入PBS(pH 7.6 含0.25 mol/L蔗糖)，置内切式匀浆器匀浆1 min；用Teflon匀浆器匀浆，离心2 000×g 10 min；将上清液转入另一试管中，离心，27 500g，15 min；沉淀用适量包埋液混匀，配成不同浓度，包埋至96孔ELISA反应板中，封闭，各孔加入不同稀释度的兔抗M1 IgG及兔抗M2 IgG；酶标Ⅱ抗及底物反应等操作步骤同上。不同浓度脑膜悬液及不同稀释度的抗体进行方阵滴定，结果见表2 。证实两种抗体均有很好的特异性，最佳稀释浓度分别为1:400和1:100。
表2 不同浓度脑膜混悬液包被及不同稀释度抗体的测定结果
Tab. 2 The results of determination of meninx suspension at different concentrations with antibodies at different dilutions
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Antibody dilution
Concentration
1 000
250
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1.4 125I 标记抗体 采用氯胺-T法，特异性抗体1.2 mg/ 0.2 ml ，加入0.5 mol/L PBS 50μl，再加入 125I 37.0~55.5 MBq(1.0 ~1.5 mCi)，混匀，迅速加入新鲜配制氯胺-T 40μg/10μl，60 s后用偏重亚硫酸钠终止反应，SephadexG25层析分离，收集第一峰全部峰液。
1.5 M1和M2受体在大鼠部分脏器中分布的测定 SD大鼠，体质量250~280 g，雄性(由中山医科大学动物中心提供)。乙醚浅麻醉后，从阴茎背静脉注射1:160的125I-抗M1或抗M2受体IgG 1 ml，3 h后断头处死，取心脏、肺、气管平滑肌、肝脏、肾，制备各脏器的细胞膜标本。制膜前用PBS洗净血液并将每一标本称量，以每克样本的放射性计数表示受体抗体与脏器内受体结合量。
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2 结果
125I 标记M1和M2抗体用Sephadex G25分离，见图1、2。标记率62.7%~75.2%，计算放射比活度为135.27 kBq /μg(5.01 μCi/μg)。制备部分脏器的细胞膜标本，分别置入Philips PW4242系列的井型γ探测器测定其每分钟计数(min-1)，记录肺、心脏、气管平滑肌、肝脏及肾脏每克组织的min-1。以5种组织的总放射性为百分之百，比较M1和M2受体在不同组织的分布。M1受体分布比例依次为13.6%、7.2%、55.2%、8.4%和15.7%，M2受体比例为14.8%、8.1%、41.5%、18.9%和16.7%。
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图1 125I标记M1受体抗体分离纯化图谱
Fig. 1 Purification of 125I labeled muscarinic receptor antibody M1
图2 125I标记M2受体抗体分离纯化图谱
Fig. 2 Purification of 125I labeled muscarinic receptor antibody M2
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3 讨论
毒覃碱样胆碱受体(M受体)广泛分布于中枢及外围神经组织、心脏、平滑肌及各种腺体中，通过与不同的鸟核苷酸结合蛋白(G蛋白)偶联引起一系列生理生化反应，如血管平滑肌舒张，心率减慢，心收缩力减弱，胃肠和膀胱平滑肌收缩力加强，腺苷酸环化酶活性改变，肌醇磷酯系统激活及离子通道开放或关闭等，这些作用有时表现为兴奋，有时表现为抑制。不同脏器的不同反应，与各组织器官特点及其具有不同类型的M受体有关。1980年，Hammer[2]提出根据对M受体拮抗剂Pirenzepine的亲和力不同将M受体分成两种亚型，广泛分布于神经组织中的M1受体和主要分布于效应器官的M2受体。分子生物学研究结果进一步表明至少存在5种M受体亚型[4]。以往对M受体的检测多采用放射配基结合分析法或放射自显影法，由于核素标记配基对M受体亚型的选择性比较差，无法检测M受体亚型。本实验选用人工抗原诱发的M受体亚型特异抗体，采用免疫学方法检测M受体及其亚型，结果证实抗体特异性好。作者认为应用该抗体可进一步研究M受体的分子作用机制，为进行M受体亚型检测提供比较简便可靠的方法。
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由于IgG分子不能通过血脑屏障，静脉注入后只能观察外围脏器的M受体分布，以5种脏器的放射性分布作为100%，只是表示5种脏器组织中M1和M2受体分布的相对差异。我们观察到大鼠心脏、肝脏、气管平滑肌、肾脏及肺组织中，M1受体和M2受体存在着分布差异，其生理意义尚不清楚，某些免疫调节性疾病如哮喘、甲状腺功能低下等，已观察到M受体的分布量及反应性有改变[5]，是否与气管平滑肌M受体分布增高有关，尚需进一步研究。本实验由于是在活体给药后制备标本，所以每只动物的每一脏器只能测定一种受体亚型及每种亚型在5个脏器内的分布比例。若采用不同核素标记，则可测出特定脏器两种亚型的比值。
参考文献
1 Bonner TI. The molecular basis of muscarinic receptor diversity. Trends Neurosci, 1989, 12:148
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2 Hammer R, Berrie CP, Birdsall NJ. A pirenzepine distinguishes between different subclasses of muscarinic receptors. Nature (Lond), 1980, 83:90
3 Wang SZ, Zhu SZ, Mash DC et al. Comparison of the concentration of messenger RNA encoding four muscarinic receptor's subtypes in control and Alzheimer brains. Brain Res Mol Brain Res, 1992,16(1-2):64
4 Nathanson NM. Molecular properties of the muscarinic acetycholine receptor. Annu Rev Neurosci, 1987,10:195
5 胡雅儿,卞以洁,易宁育等. 用放射性配基结合分析法测定甲低小鼠脑M受体.中华核医学杂志,1989, 2:91
(收稿日期：1998-08-12), http://www.100md.com