快速分离肝癌患者外周血树突状细胞
作者：李明松 爱力 赖卓胜 张兰兰
单位：第一军医大学南方医院消化科，广州，510515
关键词：树突状细胞；粒/巨噬细胞集落刺激因子；白介素-4
第一军医大学学报990128 摘要：目的 探讨从肝癌患者外周血中大量快速分离树突状细胞(DC)有效方法。方法 自肝癌患者外周血中分离出单个核细胞(PBMC)；PBMC与GM-CSF及IL-4共培养；检测培养前后DC表面HLA-DR及B7-2表达水平及DC诱导T细胞增殖能力。结果 GM-CSF及IL-4联合刺激选择性使PBMC中DC大量增殖,并通过增强DC表面HLA-DR及B7表达 [从(12.8±1.1)、(15.1±1.0)增至(19.1±1.7)、(21.6±1.5)，P <0.01] 进一步增强DC免疫功能[由(6 820±140)增至(14 090±180) min-1 , P <0.01]。结论 联合应用GM-CSF及IL-4能够从肝癌患者血中制备出大量高免疫活力DC。
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中图分类号：R735.7;R73-35
Rapid isolation of dendritic cells from peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma
Li Mingsong, Yuan Aili, Lai Zhuosheng, Zhang Lanlan
Department of Gastroenterology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
Abstract: Objective To find a rapid method for isolating dendritic cells from hepatocellular carcinoma (HCC) patient. Methods Dendritic cells (DC) were isolated from peripheral blood of HCC patients (n=10) with incubation of granulocyte/macrophage colony- stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 4 (IL-4); then the expression levels of HLA-DR and B7 on DC were detected, and the ability of DC inducing immune response after and before DC incubation with GM-CSF and the IL-4 was also analyzed. Results Combination of GM-CSF and IL-4 selectively enhanced DC proliferation, upregulated the expression level of HLA-DR and B7 on DC (from 12.8±1.1, 15.1±1.0 to 19.1±1.7, 21.6±1.5，P <0.01)and further enhanced the ability of DC ( from 6820±140 to 14 090±180 cpm, P <0.01) to induce T lymphocyte proliferation. Conclusion It is suggested that combination of GM-CSF and IL-4 can selectively enhance proliferation and immune function of DC by upregulating the expression of HLA-DR and B7 on DC.
, 百拇医药
Key words: dendritic cell; granulocyte/macrophage colony stimulating factor; interleukin-4
树突状细胞(DC)因其独特的免疫学特性，在诱导特异性抗肿瘤细胞免疫中起关键作用[1,2]。但DC为一微量细胞群，其分离及纯化极其复杂，妨碍了对其形态、结构及功能的深入研究。研究表明[3,4]，某些细胞因子能促进DC增殖并增强DC免疫功能。本实验联合应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白介素-4(IL-4)联合刺激肝癌患者外周血单个核细胞(PBMC)中DC，探讨GM-CSF及IL-4对DC免疫功能的影响。
1 材料与方法
1.1病例选择及材料 本院1996～1997年临床确诊晚期原发性肝癌患者10例，男9例，女1例，28～56岁，平均年龄48岁，均未接受任何抗肿瘤治疗。GM-CSF、IL-4、抗CD3 单克隆抗体(McAb)、抗HLA-DR McAb。抗CD83 McAb(Thomas F. Tedder惠赠)。抗B7 McAb(Andrew Lazarovits惠赠)。异硫氰酸荧光素(FITC，SIGMA公司产品)。流式细胞仪(FCM，CULTER公司产品)。3H-TdR(北京原子能研究所产品)。
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1.2 方法
1.2.1 以改良的Thomas方法[5]分离及纯化DC及T细胞 主要步骤如下：以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)；以E玫瑰花沉淀法除去T淋巴细胞，1 mol/L氯化铵溶解红细胞作为T淋巴细胞来源；聚丙稀Petri培养皿培养选择性地除去巨噬细胞；尼龙毛柱过滤除去B细胞；以L-亮氨酸-L-亮氨酰甲基酯选择性地除去其中的巨噬细胞、NK细胞及细胞毒性T细胞，余下细胞则主要为DC。以FITC标记的抗CD83 McAb特异性显示DC。台盼兰染色检测DC活力。
1.2.2 GM-CSF及IL-4联合刺激DC[4,5] 主要步骤如下：于16孔板中每孔加入PBMC(105)、GM-CSF(100 μg/L)及IL-4(106 U/L)置37 º C、5% CO2培养箱中培养2 d；收集培养细胞，以FITC标记的抗CD83 McAb显示DC [6] ，台盼兰染色检测DC活力。以肝癌患者PBMC悬浮于RPMI-1640中，浓度为108/L，置37 º C、5% CO2培养箱中培养5 d作对照。
, 百拇医药
1.2.3 以间接免疫荧光法测定肝癌 DC经GM-CSF及IL-4联合刺激前后，DC表面HLA-DR及B7-2表达水平。FCM检测，HLA-DR及B7-2表达水平记录为荧光密度(VOF)。
1.2.4 以DC诱导自体混合T淋巴细胞增殖反应检测肝癌患者DC经GM-CSF及IL-4联合刺激前后免疫诱导功能。主要步骤如下：于96孔板中每孔加入105 自体混合T淋巴细胞(反应细胞)、1´ 103 DC(诱导细胞)、抗CD3 McAb 20 ng，置37º C、5% CO2环境中共培养3 d，加3H-TdR (37 kBg/孔)继续培养12 h，常规收集细胞，b -闪烁计数器检测每分钟脉冲数(次/min) 。仅以105 自体混合T淋巴细胞按同样方法培养作对照组。
1.2.5 统计学方法
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所有变量均表达为
± s，以t检验分析两变量间差异性。
2 结果
2.1 经GM-CSF及IL-4联合刺激2 d后，PBMC细胞数由105增至1.4´ 105，细胞存活率>95%。经FITC标记的抗CD83 McAb特异性显示,PBMC中约70%为DC，较培养前明显增多(P <0.01)。
2.2 经DC诱导后，肝癌患者自体混合T淋巴细胞数由105增至1.6´ 105。
2.3 经GM-CSF及IL-4共培养后，肝癌患者DC表面HLA-DR及B7表达水平及其免疫诱导力均增强(表1)。
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表1 DC表面HLA-DR和B7表达水平及DC免疫诱导力
Tab.1 Expression levels of HLA-DR and B7 on surface of DC and DC immune inducing ability
HLA-DR(VOF)
B7(VOF)
Immune inducing ability
Before incubation
12.8±1.1
15.1±1.0
6 820±140
, 百拇医药
After incubation
19.1±1.7*
21.6±1.5**
14 090±180**
contrasts
11±1.8#
16±1.1#
7 280±96#
# P>0.05,* P<0.05,** P<0.01 vs group of before incubation 3 讨论
, 百拇医药
DC作为一种微量细胞，其分离及纯化的困难妨碍了对其形态、结构及其功能进一步研究。CD83作为DC表面标记物，便于识别DC，但仍不能满足体外大量获取有高免疫活力DC的需要[6]。GM-CSF作为一种细胞因子，具有促进DC增殖分化，并能增强其表面多种免疫分子表达功能。但GM-CSF同时对巨噬细胞增殖亦有促进作用。因而，仅利用GM-CSF并不能在体外获得大量较高纯度的DC。IL-4具有选择性的抑制巨噬细胞增殖及分化作用，但无促进DC增殖分化功能。因此，若能联合应用GM-CSF及IL-4则可能选择性地促进人外周血中的DC优势增殖。Sallusto等报道[4]，在GM-CSF及IL-4联合作用下，能直接从正常成人PBMC中培养出大量DC，该DC具有丰富的HLA、B7及其它免疫分子表达，因而具有较高的免疫活性。本研究联合应用GM-CSF及IL-4成功地自肝癌患者PBMC中培养出较高纯度DC。
DC因其独特的抗原递呈和免疫调节功能在诱导高效而特异的抗肿瘤免疫反应中起关键作用，而DC表面各种免疫分子正常表达则是DC发挥免疫功能的基础。我们以前的研究发现，肝癌患者DC表面HLA-DR及B7表达低下，并因此导致DC免疫功能低下，提示增强肝癌患者DC表面HLA-DR及B7表达将可能增强其免疫功能，从而提高患者抗肝癌免疫力[7]。本研究结果表明，GM-CSF及IL-4联合刺激能从肝癌患者PBMC中培养出大量DC，该DC表面HLA-DR和B7表达水平及其免疫诱导力均增强，提示联合应用GM-CSF及IL-4在体外不仅能从肝癌患者PBMC中培养出大量高纯度DC，并能增强DC免疫学功能。
, 百拇医药
DC在诱导高效而特异性的抗肿瘤免疫中起关键作用，而肿瘤患者因其DC免疫功能低下致宿主抗肿瘤免疫无能。因此在体外从肝癌患者外周血中直接培养出大量具有高免疫活力的DC，无疑将为恢复并增强肝癌(或许包括其它肿瘤)患者抗肿瘤免疫力提供一条有效途径，并对进一步深入研究DC作为职业抗原提呈细胞及天然免疫佐剂的免疫学功能以及DC在肿瘤临床治疗中的应用提供了极大方便[8]。
作者简介：李明松，男，1964年出生，1996年毕业于第一军医大学，医学博士，目前主要从事肝癌免疫治疗的基础及临床研究，发表论文近20篇
参考文献
1 Wright-Browne V, McClain KL, Talpaz M et al. Physiology and patho-physiology of dendritic cells. Human Pathology, 1997,(28): 563
, 百拇医药
2 Chaux P. Dendritic cells and immune function in cancer. Pathol Biol Paris, 1995, 43 (10): 897
3 Steinman RM. Dendritic cells and immune-based therapies. Exp hematol, 1996,24(8): 859
4 Sallusto F, Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by culture human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin-4 and down-regulated by tumor necrosis factor α. J Exp Med，1994，179:1109
, 百拇医药
5 Thomas R, Davis LS, Lipsky PE. Comparative accessory cell function of human peripheral blood dendritic cells and monocytes. J Immunol，1993，151:6840
6 Zhou LJ, Tedder TF. Human blood dendritic cells selectively express CD83, a member of the immunoglobulin superfamily. J Immunol，1995，154:3821
7 李明松,袁爱力.肝癌患者外周血树突状细胞免疫状态的研究.中国癌症杂志 , 1998, 8(2):85
8 Hmbilin TJ. From dendritic cells to vaccines.Lacent,1996, 16: 705
(收稿日期：1998-06-14), 百拇医药
单位：第一军医大学南方医院消化科，广州，510515
关键词：树突状细胞；粒/巨噬细胞集落刺激因子；白介素-4
第一军医大学学报990128 摘要：目的 探讨从肝癌患者外周血中大量快速分离树突状细胞(DC)有效方法。方法 自肝癌患者外周血中分离出单个核细胞(PBMC)；PBMC与GM-CSF及IL-4共培养；检测培养前后DC表面HLA-DR及B7-2表达水平及DC诱导T细胞增殖能力。结果 GM-CSF及IL-4联合刺激选择性使PBMC中DC大量增殖,并通过增强DC表面HLA-DR及B7表达 [从(12.8±1.1)、(15.1±1.0)增至(19.1±1.7)、(21.6±1.5)，P <0.01] 进一步增强DC免疫功能[由(6 820±140)增至(14 090±180) min-1 , P <0.01]。结论 联合应用GM-CSF及IL-4能够从肝癌患者血中制备出大量高免疫活力DC。
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中图分类号：R735.7;R73-35
Rapid isolation of dendritic cells from peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma
Li Mingsong, Yuan Aili, Lai Zhuosheng, Zhang Lanlan
Department of Gastroenterology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
Abstract: Objective To find a rapid method for isolating dendritic cells from hepatocellular carcinoma (HCC) patient. Methods Dendritic cells (DC) were isolated from peripheral blood of HCC patients (n=10) with incubation of granulocyte/macrophage colony- stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 4 (IL-4); then the expression levels of HLA-DR and B7 on DC were detected, and the ability of DC inducing immune response after and before DC incubation with GM-CSF and the IL-4 was also analyzed. Results Combination of GM-CSF and IL-4 selectively enhanced DC proliferation, upregulated the expression level of HLA-DR and B7 on DC (from 12.8±1.1, 15.1±1.0 to 19.1±1.7, 21.6±1.5，P <0.01)and further enhanced the ability of DC ( from 6820±140 to 14 090±180 cpm, P <0.01) to induce T lymphocyte proliferation. Conclusion It is suggested that combination of GM-CSF and IL-4 can selectively enhance proliferation and immune function of DC by upregulating the expression of HLA-DR and B7 on DC.
, 百拇医药
Key words: dendritic cell; granulocyte/macrophage colony stimulating factor; interleukin-4
树突状细胞(DC)因其独特的免疫学特性，在诱导特异性抗肿瘤细胞免疫中起关键作用[1,2]。但DC为一微量细胞群，其分离及纯化极其复杂，妨碍了对其形态、结构及功能的深入研究。研究表明[3,4]，某些细胞因子能促进DC增殖并增强DC免疫功能。本实验联合应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白介素-4(IL-4)联合刺激肝癌患者外周血单个核细胞(PBMC)中DC，探讨GM-CSF及IL-4对DC免疫功能的影响。
1 材料与方法
1.1病例选择及材料 本院1996～1997年临床确诊晚期原发性肝癌患者10例，男9例，女1例，28～56岁，平均年龄48岁，均未接受任何抗肿瘤治疗。GM-CSF、IL-4、抗CD3 单克隆抗体(McAb)、抗HLA-DR McAb。抗CD83 McAb(Thomas F. Tedder惠赠)。抗B7 McAb(Andrew Lazarovits惠赠)。异硫氰酸荧光素(FITC，SIGMA公司产品)。流式细胞仪(FCM，CULTER公司产品)。3H-TdR(北京原子能研究所产品)。
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1.2 方法
1.2.1 以改良的Thomas方法[5]分离及纯化DC及T细胞 主要步骤如下：以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)；以E玫瑰花沉淀法除去T淋巴细胞，1 mol/L氯化铵溶解红细胞作为T淋巴细胞来源；聚丙稀Petri培养皿培养选择性地除去巨噬细胞；尼龙毛柱过滤除去B细胞；以L-亮氨酸-L-亮氨酰甲基酯选择性地除去其中的巨噬细胞、NK细胞及细胞毒性T细胞，余下细胞则主要为DC。以FITC标记的抗CD83 McAb特异性显示DC。台盼兰染色检测DC活力。
1.2.2 GM-CSF及IL-4联合刺激DC[4,5] 主要步骤如下：于16孔板中每孔加入PBMC(105)、GM-CSF(100 μg/L)及IL-4(106 U/L)置37 º C、5% CO2培养箱中培养2 d；收集培养细胞，以FITC标记的抗CD83 McAb显示DC [6] ，台盼兰染色检测DC活力。以肝癌患者PBMC悬浮于RPMI-1640中，浓度为108/L，置37 º C、5% CO2培养箱中培养5 d作对照。
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1.2.3 以间接免疫荧光法测定肝癌 DC经GM-CSF及IL-4联合刺激前后，DC表面HLA-DR及B7-2表达水平。FCM检测，HLA-DR及B7-2表达水平记录为荧光密度(VOF)。
1.2.4 以DC诱导自体混合T淋巴细胞增殖反应检测肝癌患者DC经GM-CSF及IL-4联合刺激前后免疫诱导功能。主要步骤如下：于96孔板中每孔加入105 自体混合T淋巴细胞(反应细胞)、1´ 103 DC(诱导细胞)、抗CD3 McAb 20 ng，置37º C、5% CO2环境中共培养3 d，加3H-TdR (37 kBg/孔)继续培养12 h，常规收集细胞，b -闪烁计数器检测每分钟脉冲数(次/min) 。仅以105 自体混合T淋巴细胞按同样方法培养作对照组。
1.2.5 统计学方法
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所有变量均表达为
± s，以t检验分析两变量间差异性。2 结果
2.1 经GM-CSF及IL-4联合刺激2 d后，PBMC细胞数由105增至1.4´ 105，细胞存活率>95%。经FITC标记的抗CD83 McAb特异性显示,PBMC中约70%为DC，较培养前明显增多(P <0.01)。
2.2 经DC诱导后，肝癌患者自体混合T淋巴细胞数由105增至1.6´ 105。
2.3 经GM-CSF及IL-4共培养后，肝癌患者DC表面HLA-DR及B7表达水平及其免疫诱导力均增强(表1)。
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表1 DC表面HLA-DR和B7表达水平及DC免疫诱导力
Tab.1 Expression levels of HLA-DR and B7 on surface of DC and DC immune inducing ability
HLA-DR(VOF)
B7(VOF)
Immune inducing ability
Before incubation
12.8±1.1
15.1±1.0
6 820±140
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After incubation
19.1±1.7*
21.6±1.5**
14 090±180**
contrasts
11±1.8#
16±1.1#
7 280±96#
# P>0.05,* P<0.05,** P<0.01 vs group of before incubation 3 讨论
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DC作为一种微量细胞，其分离及纯化的困难妨碍了对其形态、结构及其功能进一步研究。CD83作为DC表面标记物，便于识别DC，但仍不能满足体外大量获取有高免疫活力DC的需要[6]。GM-CSF作为一种细胞因子，具有促进DC增殖分化，并能增强其表面多种免疫分子表达功能。但GM-CSF同时对巨噬细胞增殖亦有促进作用。因而，仅利用GM-CSF并不能在体外获得大量较高纯度的DC。IL-4具有选择性的抑制巨噬细胞增殖及分化作用，但无促进DC增殖分化功能。因此，若能联合应用GM-CSF及IL-4则可能选择性地促进人外周血中的DC优势增殖。Sallusto等报道[4]，在GM-CSF及IL-4联合作用下，能直接从正常成人PBMC中培养出大量DC，该DC具有丰富的HLA、B7及其它免疫分子表达，因而具有较高的免疫活性。本研究联合应用GM-CSF及IL-4成功地自肝癌患者PBMC中培养出较高纯度DC。
DC因其独特的抗原递呈和免疫调节功能在诱导高效而特异的抗肿瘤免疫反应中起关键作用，而DC表面各种免疫分子正常表达则是DC发挥免疫功能的基础。我们以前的研究发现，肝癌患者DC表面HLA-DR及B7表达低下，并因此导致DC免疫功能低下，提示增强肝癌患者DC表面HLA-DR及B7表达将可能增强其免疫功能，从而提高患者抗肝癌免疫力[7]。本研究结果表明，GM-CSF及IL-4联合刺激能从肝癌患者PBMC中培养出大量DC，该DC表面HLA-DR和B7表达水平及其免疫诱导力均增强，提示联合应用GM-CSF及IL-4在体外不仅能从肝癌患者PBMC中培养出大量高纯度DC，并能增强DC免疫学功能。
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DC在诱导高效而特异性的抗肿瘤免疫中起关键作用，而肿瘤患者因其DC免疫功能低下致宿主抗肿瘤免疫无能。因此在体外从肝癌患者外周血中直接培养出大量具有高免疫活力的DC，无疑将为恢复并增强肝癌(或许包括其它肿瘤)患者抗肿瘤免疫力提供一条有效途径，并对进一步深入研究DC作为职业抗原提呈细胞及天然免疫佐剂的免疫学功能以及DC在肿瘤临床治疗中的应用提供了极大方便[8]。
作者简介：李明松，男，1964年出生，1996年毕业于第一军医大学，医学博士，目前主要从事肝癌免疫治疗的基础及临床研究，发表论文近20篇
参考文献
1 Wright-Browne V, McClain KL, Talpaz M et al. Physiology and patho-physiology of dendritic cells. Human Pathology, 1997,(28): 563
, 百拇医药
2 Chaux P. Dendritic cells and immune function in cancer. Pathol Biol Paris, 1995, 43 (10): 897
3 Steinman RM. Dendritic cells and immune-based therapies. Exp hematol, 1996,24(8): 859
4 Sallusto F, Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by culture human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin-4 and down-regulated by tumor necrosis factor α. J Exp Med，1994，179:1109
, 百拇医药
5 Thomas R, Davis LS, Lipsky PE. Comparative accessory cell function of human peripheral blood dendritic cells and monocytes. J Immunol，1993，151:6840
6 Zhou LJ, Tedder TF. Human blood dendritic cells selectively express CD83, a member of the immunoglobulin superfamily. J Immunol，1995，154:3821
7 李明松,袁爱力.肝癌患者外周血树突状细胞免疫状态的研究.中国癌症杂志 , 1998, 8(2):85
8 Hmbilin TJ. From dendritic cells to vaccines.Lacent,1996, 16: 705
(收稿日期：1998-06-14), 百拇医药