芪龙方抑制实验性大鼠胃癌发生及抗始发突变的作用△
作者：施波 付招娣 李燕 陈飞松 刘晋生 任蜀兵 徐春军
单位：施波 付招娣 李燕，中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所(北京100050)；陈飞松 刘晋生 任蜀兵 徐春，军北京市中医研究所
关键词：芪龙方；抗癌作用；胃癌
中草药/990122 摘 要 芪龙方能显著降低MNNG诱发的新生大鼠慢性萎缩性胃炎、胃粘膜异型增生及腺胃癌的发生率，且呈剂量依赖性。证明芪龙方具有较好的癌化学预防作用。芪龙方对致突变物诱导的TA98、TA102的回复突变率和环磷酰胺诱发的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成率有显著的抑制作用。提示芪龙方对于癌的始发阶段有较强的抑制作用。
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在全部恶性肿瘤死亡构成比中居第一位。据统计，我国每年死于胃癌的患者超过16万，自1978年以来，胃癌的防治研究一直被列为国家重点攻关课题〔1〕。胃癌的发展有较长的潜伏期，慢性萎缩性胃炎及胃粘膜异型增生被认为是胃癌癌前疾病或癌前状态，是向胃癌发展的过渡性病变。故有效地防治胃癌癌前疾病，阻断或逆转其发展是防治胃癌发生的重要环节。
, 百拇医药
芪龙(胃平Ⅱ号)方是北京市中医研究所治疗胃癌癌前疾病的经验方剂，由黄芪、龙葵、黄芩、党参、丹参、甘草等组成，具有健脾益气、清热活血、解毒之功效。芪龙方治疗600多例慢性萎缩性胃炎、胃粘膜肠上皮化生、异型增生等症，临床痊愈率21%，显效率47%。在临床获得确切疗效的基础上，我们进一步研究芪龙方对致癌剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱发新生大鼠的胃癌癌前疾病和胃癌的预防作用，并探讨芪龙方抗癌始发突变的作用。
1 材料
1.1 芪龙方液：水提醇沉制成100%浓度的液体，即1 mL相当于1 g生药，高压灭菌后备用。增生平：购自中国医学科学院肿瘤研究所，以无菌水配制成0.5 g/mL。
1.2 实验动物：Wistar新生大鼠、18～22 g NIH雄性小鼠，中国医科院动物所提供。
1.3 细菌菌种：鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型TA98、TA102，购自中国生物制品检定所。
, 百拇医药
1.4 主要试剂：MNNG，Sigma公司产品。DMSO，天津化学试剂一厂产品；环磷酰胺(CTX)，上海第十二药厂。代谢酶活化系统S9及混合液等由本室自制。
2 方法
2.1 诱发胃癌癌前疾病及分组、给药方法：取新生3 d的Wistar大鼠，每鼠以新鲜配制的MNNG溶液40 μg/(0.1 mL*d) ig，连续10 d〔2，3〕。新生鼠 ig后放回母鼠笼中喂养，至出生第21日断乳后，随机分组，雌雄分笼饲养，开始ig给药。空白对照组大鼠给予生理盐水1 mL/100 g体重，芪龙方高、中、低剂量3个实验组分别给予芪龙方液1、0.5和0.25 mL/100 g体重。阳性药对照治疗组给予0.5 g/mL的增生平液1 mL/100 g体重。各实验组均每日ig 1次，连续给药24周后停药，于第56周处死各组动物。取大鼠胃用中性福尔马林固定，石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色。病理学观察各标本出现的病变。
, 百拇医药
2.2 抗Ames试验：采用平板掺入实验方法〔4〕。反应系统含菌液0.1 mL，致突变物柔红霉素50 μL，加入顶层培养基2 mL，混匀后倒入已铺设低限葡萄糖琼脂培养基的平皿，于37 ℃温箱中培养48 h，计数每皿回变菌落数。按下式计算回复突变抑制率：
回复突变抑制率(%)＝(阳性对照组回变菌落数-受试药物组回变菌落数)/阳性对照组回变菌落数×100%。
2.3 抗小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成〔4〕：将NIH小鼠随机分组，每组10只，分别设阴性对照组、环磷酰胺阳性药对照组、芪龙方实验各组。后者分别ig芪龙方液0.1、0.2、0.4 mL/10 g体重，共给药4 d。除阴性对照组外，其余各组小鼠于第4天ip环磷酰胺100 mg/kg 1次，24 h后处死动物，取其股骨骨髓细胞涂片，Giemsa染色，油镜下计数骨髓嗜多染红细胞(PCE)1 000个，计数含微核的PCE。按公式计算芪龙方组的PCE微核形成抑制率。
, 百拇医药
抑制率(%)＝(阳性对照组微核PCE-给药组微核PCE)/阳性对照组微核PCE×100%。
3 结果
3.1 对MNNG诱发的大鼠胃癌癌前疾病和胃癌的抑制作用：实验至第56周，结果见表1。
表1 对MNNG诱发的大鼠胃癌癌前疾病及胃癌的防治作用(病变标本数/被检总标本数) 组 别
剂量
(mL/kg)
实验1
实验2
萎缩性胃炎
异型增生
, 百拇医药
%
胃腺瘤、腺癌
%
萎缩性胃炎
异型增生
%
胃腺瘤、腺癌
%
空白对照
-
76/82
93
31/82
, 百拇医药
38
80/85
94
33/85
39
芪龙方
2.5
34/88
39*
16/88
18*
35/84
41*
, 百拇医药
17/84
20*
5
20/85
24*
10/85
12*
22/81
27*
13/81
16*
10
, http://www.100md.com
12/81
15*
6/81
7*
15/82
18*
8/82
10*
增生平
5
21/84
25*
, 百拇医药
12/84
14*
23/84
27*
12/84
14*
与空白对照组比较：*P<0.05
表1显示芪龙方对MNNG诱发的大鼠胃癌及癌前疾病有较好的防治作用，2次实验芪龙方液各组使实验模型动物发生胃腺瘤、腺癌及慢性萎缩性胃炎伴异型增生的百分率显著下降，并呈现剂量效应关系。按等药物剂量计算，其抑制作用强度与增生平相当。
3.2 抗柔红霉素诱变TA98作用观察：芪龙方对柔红霉素诱变的TA98突变有明显的抑制作用，且呈较好的浓度-效应关系。在80 μL/皿原液的剂量下，抑制率为52.3%，抗致突变作用肯定，见表2。
, http://www.100md.com
表2 抗柔红霉素诱变TA98菌的作用 组别(浓度/皿)
回变菌落数(
±s)
抑制率
(%)
阴性对照 -
46±12.0
柔红霉素(10 μg)
1120±132.0
芪龙方(20 μL)+柔红霉素(10 μg)
1088±279.6
, 百拇医药
6.2
(40 μL)+柔红霉素(10 μg)
913±101.0*
18.5
(80 μL)+柔红霉素(10 μg)
513±17.0**
52.3
与柔红霉素组比较：**P<0.01
3.3 抗丝裂霉素C诱变TA102作用：芪龙方液在20 μL/皿浓度时抗丝裂霉素C诱发的TA102突变的抑制率为43.3%，在80 μL/皿原液的浓度下，抑制率达76.0%，抑制作用十分显著并显示浓度效应关系，见表3。表3 抗丝裂霉素C诱变TA102菌的作用 组别(浓度/皿)
, 百拇医药
回变菌落数(±s)
抑制率
(%)
阴性对照 -
231±29.7
丝裂霉素C(16 μg)
2256±64.0
芪龙方(20 μL)+丝裂霉素C (16 μg)
1279±50.0
43.3**
, 百拇医药
(40 μL)+丝裂霉素C (16 μg)
836±148.7
62.9**
(80 μL)+丝裂霉素C (16 μg)
541±59.0
76.0**
与丝裂霉素C组比较：**P<0.01
3.4 致突变作用观察：芪龙方液在有效抗Ames试验的浓度下无自身致突变作用，见表4。
表4 芪龙方自身致突变作用(±s) 组别
, 百拇医药
(浓度/皿)
TA98回变菌落数
TA102回变菌落数
空白对照
-
168±11.8
166±12.4
芪龙方
20 μL
159±10.1
161±11.3
40 μL
, 百拇医药
166±14.7
169±9.1
80 μL
174±16.2
170±13.6
3.5 抗微核形成作用观察：表5显示NIH小鼠灌服各剂量的芪龙方液4 d后，由环磷酰胺诱发的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核增多明显受到抑制，并呈现较好的剂量效应关系。0.1 mL/10 g的芪龙方液即能使环磷酰胺诱导的微核形成率达36.1%，并呈显著性统计学差异(P<0.05)。表5 抗小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成的作用 组别(剂量/鼠)
形成微核
PCE/1000 PCE
, http://www.100md.com
抑制率
(%)
阴性对照 -
3.7±2.34
环磷酰胺(CTX)(100 μg/kg)
38.0±7.27
芪龙方
(0.1 mL/10 g)+CTX(100 mg/kg)
24.3±3.43
36.1*
(0.2 mL/10 g)+CTX(100 mg/kg)
, 百拇医药
22.0±4.56
42.1**
(0.4 mL/10 g)+CTX(100 mg/kg)
15.3±3.27
59.7**
PCE：骨髓嗜多染红细胞；
与环磷酰胺组比较：*P<0.05 **P<0.01
4 讨论
芪龙方对MNNG诱发的新生大鼠胃癌癌前疾病和胃癌有较好的防治作用，结果显示芪龙方各剂量组能显著降低MNNG诱发的大鼠第56周的胃粘膜异型增生、胃腺瘤和腺胃癌的发生率。芪龙方的作用总是高剂量>中剂量>低剂量，呈现一定的剂量效应关系。
, 百拇医药
癌的发生是一个漫长的过程，至少经过始发、促癌及演进三个阶段。对于癌的化学预防来说，控制始发突变和促癌极为重要〔5〕。抗Ames试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核抑制是癌化学预防药研究经典的抗致突变实验法。芪龙方能显著抑制丝裂霉素C和柔红霉素的致突变作用，而自身则无突变作用；预先给小鼠口服不同剂量的芪龙方液，可明显降低环磷酰胺诱发微核形成率，并呈一定的剂量效应关系。微核试验是检测化学诱变剂引起染色体损伤的一种快速方法。当化学诱变剂使染色体受到损伤后，在细胞有丝分裂后期丧失着色点的染色体或染色体碎片被子代细胞排除而形成微核游离于细胞中。染色体结构的这种改变可为遗传物质的损伤提供易于评定的形态学证据。
芪龙方不但疗效好，长期应用还未发现毒副作用。本研究证明芪龙方防治MNNG诱发的大鼠胃癌和胃癌癌前疾病较为理想，又有较好的抗癌始发突变作用。因此深入研究其作用机制，并将芪龙方开发成治疗胃癌癌前疾病的新药，是我们今后努力的方向。
*Address:Shi Bo,Institute of Materia Medica ,Chinese Academy of Medical Sciences ,Chinese Xiehe Medical University,Beiji
, 百拇医药
作者简介:施波 副研究员.1993年在上海第二医科大学心血管内科获博士学位.1993年8月进入中国医学科学院药物研究所博士后流动站,在肿瘤药理学专家韩锐教授指导下工作,主要从事抗肿瘤新药的开发和药理学研究.曾获黑龙江省卫生厅科技进步奖1项,北京市科技进步奖1项及吴介平杨森1项.
△国家自然科学基金及北京市科委资助课题
参考文献
[1] 韩 锐主编.肿瘤化学预防及药物治疗.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1991：582
[2] 邓大君，等.中华病理学杂志，1994，23(5)：293
[3] Sumi Y, et al.GANN，1978，69：805
[4] 韩 锐主编.新抗癌药物研究及实验技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997：303
[5] Lippman, S M, et al.J Clin Oncology, 1994，12(4):851
(1998-01-18 收稿), http://www.100md.com
单位：施波 付招娣 李燕，中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所(北京100050)；陈飞松 刘晋生 任蜀兵 徐春，军北京市中医研究所
关键词：芪龙方；抗癌作用；胃癌
中草药/990122 摘 要 芪龙方能显著降低MNNG诱发的新生大鼠慢性萎缩性胃炎、胃粘膜异型增生及腺胃癌的发生率，且呈剂量依赖性。证明芪龙方具有较好的癌化学预防作用。芪龙方对致突变物诱导的TA98、TA102的回复突变率和环磷酰胺诱发的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成率有显著的抑制作用。提示芪龙方对于癌的始发阶段有较强的抑制作用。
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在全部恶性肿瘤死亡构成比中居第一位。据统计，我国每年死于胃癌的患者超过16万，自1978年以来，胃癌的防治研究一直被列为国家重点攻关课题〔1〕。胃癌的发展有较长的潜伏期，慢性萎缩性胃炎及胃粘膜异型增生被认为是胃癌癌前疾病或癌前状态，是向胃癌发展的过渡性病变。故有效地防治胃癌癌前疾病，阻断或逆转其发展是防治胃癌发生的重要环节。
, 百拇医药
芪龙(胃平Ⅱ号)方是北京市中医研究所治疗胃癌癌前疾病的经验方剂，由黄芪、龙葵、黄芩、党参、丹参、甘草等组成，具有健脾益气、清热活血、解毒之功效。芪龙方治疗600多例慢性萎缩性胃炎、胃粘膜肠上皮化生、异型增生等症，临床痊愈率21%，显效率47%。在临床获得确切疗效的基础上，我们进一步研究芪龙方对致癌剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱发新生大鼠的胃癌癌前疾病和胃癌的预防作用，并探讨芪龙方抗癌始发突变的作用。
1 材料
1.1 芪龙方液：水提醇沉制成100%浓度的液体，即1 mL相当于1 g生药，高压灭菌后备用。增生平：购自中国医学科学院肿瘤研究所，以无菌水配制成0.5 g/mL。
1.2 实验动物：Wistar新生大鼠、18～22 g NIH雄性小鼠，中国医科院动物所提供。
1.3 细菌菌种：鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型TA98、TA102，购自中国生物制品检定所。
, 百拇医药
1.4 主要试剂：MNNG，Sigma公司产品。DMSO，天津化学试剂一厂产品；环磷酰胺(CTX)，上海第十二药厂。代谢酶活化系统S9及混合液等由本室自制。
2 方法
2.1 诱发胃癌癌前疾病及分组、给药方法：取新生3 d的Wistar大鼠，每鼠以新鲜配制的MNNG溶液40 μg/(0.1 mL*d) ig，连续10 d〔2，3〕。新生鼠 ig后放回母鼠笼中喂养，至出生第21日断乳后，随机分组，雌雄分笼饲养，开始ig给药。空白对照组大鼠给予生理盐水1 mL/100 g体重，芪龙方高、中、低剂量3个实验组分别给予芪龙方液1、0.5和0.25 mL/100 g体重。阳性药对照治疗组给予0.5 g/mL的增生平液1 mL/100 g体重。各实验组均每日ig 1次，连续给药24周后停药，于第56周处死各组动物。取大鼠胃用中性福尔马林固定，石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色。病理学观察各标本出现的病变。
, 百拇医药
2.2 抗Ames试验：采用平板掺入实验方法〔4〕。反应系统含菌液0.1 mL，致突变物柔红霉素50 μL，加入顶层培养基2 mL，混匀后倒入已铺设低限葡萄糖琼脂培养基的平皿，于37 ℃温箱中培养48 h，计数每皿回变菌落数。按下式计算回复突变抑制率：
回复突变抑制率(%)＝(阳性对照组回变菌落数-受试药物组回变菌落数)/阳性对照组回变菌落数×100%。
2.3 抗小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成〔4〕：将NIH小鼠随机分组，每组10只，分别设阴性对照组、环磷酰胺阳性药对照组、芪龙方实验各组。后者分别ig芪龙方液0.1、0.2、0.4 mL/10 g体重，共给药4 d。除阴性对照组外，其余各组小鼠于第4天ip环磷酰胺100 mg/kg 1次，24 h后处死动物，取其股骨骨髓细胞涂片，Giemsa染色，油镜下计数骨髓嗜多染红细胞(PCE)1 000个，计数含微核的PCE。按公式计算芪龙方组的PCE微核形成抑制率。
, 百拇医药
抑制率(%)＝(阳性对照组微核PCE-给药组微核PCE)/阳性对照组微核PCE×100%。
3 结果
3.1 对MNNG诱发的大鼠胃癌癌前疾病和胃癌的抑制作用：实验至第56周，结果见表1。
表1 对MNNG诱发的大鼠胃癌癌前疾病及胃癌的防治作用(病变标本数/被检总标本数) 组 别
剂量
(mL/kg)
实验1
实验2
萎缩性胃炎
异型增生
, 百拇医药
%
胃腺瘤、腺癌
%
萎缩性胃炎
异型增生
%
胃腺瘤、腺癌
%
空白对照
-
76/82
93
31/82
, 百拇医药
38
80/85
94
33/85
39
芪龙方
2.5
34/88
39*
16/88
18*
35/84
41*
, 百拇医药
17/84
20*
5
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24*
10/85
12*
22/81
27*
13/81
16*
10
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12/81
15*
6/81
7*
15/82
18*
8/82
10*
增生平
5
21/84
25*
, 百拇医药
12/84
14*
23/84
27*
12/84
14*
与空白对照组比较：*P<0.05
表1显示芪龙方对MNNG诱发的大鼠胃癌及癌前疾病有较好的防治作用，2次实验芪龙方液各组使实验模型动物发生胃腺瘤、腺癌及慢性萎缩性胃炎伴异型增生的百分率显著下降，并呈现剂量效应关系。按等药物剂量计算，其抑制作用强度与增生平相当。
3.2 抗柔红霉素诱变TA98作用观察：芪龙方对柔红霉素诱变的TA98突变有明显的抑制作用，且呈较好的浓度-效应关系。在80 μL/皿原液的剂量下，抑制率为52.3%，抗致突变作用肯定，见表2。
, http://www.100md.com
表2 抗柔红霉素诱变TA98菌的作用 组别(浓度/皿)
回变菌落数(
±s)抑制率
(%)
阴性对照 -
46±12.0
柔红霉素(10 μg)
1120±132.0
芪龙方(20 μL)+柔红霉素(10 μg)
1088±279.6
, 百拇医药
6.2
(40 μL)+柔红霉素(10 μg)
913±101.0*
18.5
(80 μL)+柔红霉素(10 μg)
513±17.0**
52.3
与柔红霉素组比较：**P<0.01
3.3 抗丝裂霉素C诱变TA102作用：芪龙方液在20 μL/皿浓度时抗丝裂霉素C诱发的TA102突变的抑制率为43.3%，在80 μL/皿原液的浓度下，抑制率达76.0%，抑制作用十分显著并显示浓度效应关系，见表3。表3 抗丝裂霉素C诱变TA102菌的作用 组别(浓度/皿)
, 百拇医药
回变菌落数(
±s)抑制率
(%)
阴性对照 -
231±29.7
丝裂霉素C(16 μg)
2256±64.0
芪龙方(20 μL)+丝裂霉素C (16 μg)
1279±50.0
43.3**
, 百拇医药
(40 μL)+丝裂霉素C (16 μg)
836±148.7
62.9**
(80 μL)+丝裂霉素C (16 μg)
541±59.0
76.0**
与丝裂霉素C组比较：**P<0.01
3.4 致突变作用观察：芪龙方液在有效抗Ames试验的浓度下无自身致突变作用，见表4。
表4 芪龙方自身致突变作用(
±s) 组别, 百拇医药
(浓度/皿)
TA98回变菌落数
TA102回变菌落数
空白对照
-
168±11.8
166±12.4
芪龙方
20 μL
159±10.1
161±11.3
40 μL
, 百拇医药
166±14.7
169±9.1
80 μL
174±16.2
170±13.6
3.5 抗微核形成作用观察：表5显示NIH小鼠灌服各剂量的芪龙方液4 d后，由环磷酰胺诱发的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核增多明显受到抑制，并呈现较好的剂量效应关系。0.1 mL/10 g的芪龙方液即能使环磷酰胺诱导的微核形成率达36.1%，并呈显著性统计学差异(P<0.05)。表5 抗小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成的作用 组别(剂量/鼠)
形成微核
PCE/1000 PCE
, http://www.100md.com
抑制率
(%)
阴性对照 -
3.7±2.34
环磷酰胺(CTX)(100 μg/kg)
38.0±7.27
芪龙方
(0.1 mL/10 g)+CTX(100 mg/kg)
24.3±3.43
36.1*
(0.2 mL/10 g)+CTX(100 mg/kg)
, 百拇医药
22.0±4.56
42.1**
(0.4 mL/10 g)+CTX(100 mg/kg)
15.3±3.27
59.7**
PCE：骨髓嗜多染红细胞；
与环磷酰胺组比较：*P<0.05 **P<0.01
4 讨论
芪龙方对MNNG诱发的新生大鼠胃癌癌前疾病和胃癌有较好的防治作用，结果显示芪龙方各剂量组能显著降低MNNG诱发的大鼠第56周的胃粘膜异型增生、胃腺瘤和腺胃癌的发生率。芪龙方的作用总是高剂量>中剂量>低剂量，呈现一定的剂量效应关系。
, 百拇医药
癌的发生是一个漫长的过程，至少经过始发、促癌及演进三个阶段。对于癌的化学预防来说，控制始发突变和促癌极为重要〔5〕。抗Ames试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核抑制是癌化学预防药研究经典的抗致突变实验法。芪龙方能显著抑制丝裂霉素C和柔红霉素的致突变作用，而自身则无突变作用；预先给小鼠口服不同剂量的芪龙方液，可明显降低环磷酰胺诱发微核形成率，并呈一定的剂量效应关系。微核试验是检测化学诱变剂引起染色体损伤的一种快速方法。当化学诱变剂使染色体受到损伤后，在细胞有丝分裂后期丧失着色点的染色体或染色体碎片被子代细胞排除而形成微核游离于细胞中。染色体结构的这种改变可为遗传物质的损伤提供易于评定的形态学证据。
芪龙方不但疗效好，长期应用还未发现毒副作用。本研究证明芪龙方防治MNNG诱发的大鼠胃癌和胃癌癌前疾病较为理想，又有较好的抗癌始发突变作用。因此深入研究其作用机制，并将芪龙方开发成治疗胃癌癌前疾病的新药，是我们今后努力的方向。
*Address:Shi Bo,Institute of Materia Medica ,Chinese Academy of Medical Sciences ,Chinese Xiehe Medical University,Beiji
, 百拇医药
作者简介:施波 副研究员.1993年在上海第二医科大学心血管内科获博士学位.1993年8月进入中国医学科学院药物研究所博士后流动站,在肿瘤药理学专家韩锐教授指导下工作,主要从事抗肿瘤新药的开发和药理学研究.曾获黑龙江省卫生厅科技进步奖1项,北京市科技进步奖1项及吴介平杨森1项.
△国家自然科学基金及北京市科委资助课题
参考文献
[1] 韩 锐主编.肿瘤化学预防及药物治疗.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1991：582
[2] 邓大君，等.中华病理学杂志，1994，23(5)：293
[3] Sumi Y, et al.GANN，1978，69：805
[4] 韩 锐主编.新抗癌药物研究及实验技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997：303
[5] Lippman, S M, et al.J Clin Oncology, 1994，12(4):851
(1998-01-18 收稿), http://www.100md.com