反义c-myc、增殖细胞核抗原基因片断抑制血管平滑肌细胞相关基因表达
作者：边杰芳 张柏根 陈诗书 钱虎声
单位：200001 上海第二医科大学附属仁济医院血管外科[边杰芳(现在第四军医大学西京医院血管外科 710032)、张柏根、钱虎声]；上海第二医科大学人类基因治疗中心暨分子生物学实验室(陈诗书)
关键词：寡核苷酸类，反义；肌，平滑，血管；基因，myc；增殖细胞核抗原
中华医学杂志990103 【摘要】 目的 研究有效的防治血管术后再狭窄的方法，以及应用反义c-myc、增殖细胞核抗原(PCNA)基因片断来封闭其相应基因表达的可行性。方法 设计并合成c-myc、PCNA正义、反义及四个碱基错配的反义寡核苷酸，经体外稳定性检测和细胞转染实验证实其有效性后，分别作用于体外培养的血管平滑肌细胞(VSMCs)，应用逆转录PCR半定量测定及计算机图像分析的方法，观测其对c-myc、PCNA基因表达的影响。结果 设计合成的寡核苷酸在血清培养基中1～5天未被完全降解；寡核苷酸能顺利进入VSMCs内；10 μmol/L 浓度的反义c-myc、PCNA作用于VSMCs后1～5天，其相应的c-myc和PCNA基因表达减弱，计算机图像分析表明其表达产物与对照组相比差异有显著意义(P<0.05)，而正义和错配反义寡核苷酸无此效应(P>0.05)。结论 反义c-myc和PCNA寡核苷酸可通过抑制其相应基因表达来实现阻遏血管平滑肌细胞增殖。
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Antisense oligonucleotides inhibit c-myc and PCNA expression in the vascular smooth muscle cells BIAN Jiefang, ZHANG Baigen, CHEN Shishu, et al. Department of Vascular Surgery, Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001
【Abstract】 objective To study the methods for prevention and treatment of vascular restenosis. Methods We used two factors which result in hyperplasia of vascular smooth muscle cells (VSMCs) and applied antisense c-myc, PCNA oligonucleotides to attenuate the expression of their related gene. The sense, antisense, and mismatched oligomers for c-myc or PCNA were designed and synthesized. They were individually delivered to the cultured VSMCs after the oligomers were stable in culture medium for 5 days and could cross the plasma membranes into the cells. Using RT-PCR and the image analysis system, we observed the changes of both c-myc and PCNA gene expression in the VSMCs. Results Antisense c-myc and PCNA at a concentration of 10 μmol/L were able to inhibit the expression of c-myc and PCNA gene in VSMCs (P<0.05)，whereas the sense and the mismatched ones couldn′t inhibit the expression (P>0.05). Conclusion The antisense technique is an effective method for the inhibition of VSMCs proliferation.
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【Key words】 Oligonucleotides, antisense Muscle, smooth, vascular Genes, myc PCNA
(Natl Med J China, 1999, 79:10-14)
心脑和周围血管闭塞性疾病是严重威胁人类生命和健康的常见病，各种手术和介入方法的应用，可达到较好的治疗效果。但术后3～6个月内约有30%～50%患者发生再狭窄[1]，使其远期疗效受到严重削弱。研究表明，血管平滑肌细胞(VSMCs)过度增殖可能是再狭窄发生的主要原因[2]。因此，阻遏VSMCs过度增殖就成为防治再狭窄的关键。我们通过应用反义寡核苷酸技术特异抑制c-myc和PCNA基因表达，以达到抑制VSMCs增殖的目的。为防治血管再狭窄研究提供一条有效手段。
材料和方法
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一、材料
一、材料Wistar大鼠购自中国医学科学院上海寄生虫研究所；新生小牛血清(NBS)购自四季青公司；DMEM细胞培养液、RNA提取试剂盒(TRIzol)、逆转录酶(M-MLV)、Taq DNA聚合酶均购自Gibco-BRL公司；抗α-actin单克隆抗体、兔抗小鼠IgG/FITC购自丹麦DAKO公司；丙烯酰胺、地高辛标记物、抗地高辛抗体及其呈色试剂、100 bp DNA Ladder、RNA酶抑制剂均购自BOEHRINGER MANNHEIM公司；亚甲基双丙烯酰胺、焦磷酸二乙酯(DEPC)购自Fluka公司；超纯尿素、随机引物、dNTP购自 Promega公司；其余试剂均为进口分装或国产分析纯。
二、方法
1.VSMCs原代培养和鉴定：取Wistar大鼠胸主动脉，以贴块法建立原代培养细胞，传代培养至7～8代时，分装冻存；应用免疫组织化学法鉴定VSMCs内的α-actin蛋白，以区分开内皮细胞和纤维细胞等，荧光显微镜下观察(NIKONX-EFD型，日本)。
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2.寡核苷酸的设计、合成和纯化：根据大鼠c-myc和PCNA cDNA序列，分别选择其相应mRNA翻译起始位点AUG后15和18个碱基，设计出各自相应的正义、反义及错配寡核苷酸。c-myc：正义5′-ATGCCCCTCAAC*G*T*G-3′,反义5′-CACGTTG AGGGG*C*A*T-3′,错配
；PCNA：正义5′-TTTGAGGCACGCCTG*A*T*C-3′，反义5′-GATCAGGCGTGCCTC*A*A*A 3′，错配
(注：* 表示硫代磷酸修饰的碱基；-表示与反义序列错配的碱基)。DNA自动合成仪合成，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化。
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3.寡核苷酸在血清培养液中稳定性测定：将合成的寡核苷酸加入20%NBS DMEM中，使其终浓度为10 μmol/L，置37℃ 5% CO2培养箱内1～5天，取样进行变性PAGE凝胶电泳分析，溴乙啶染色，紫外灯下观察结果，摄片记录。
4.寡核苷酸转染VSMCs测定：在合成寡核苷酸5′末端最后一个碱基时连接上Amionlinker，使其另一端与地高辛结合；以10 μmol/L浓度，将标记好地高辛的寡核苷酸加入培养的VSMCs中，对照组加未标记的相应寡核苷酸，37℃ 5% CO2培养箱内培养2、4、10、16、24、36小时取出玻片，漂洗，干燥，固定；此后按地高辛标记原位杂交试剂盒说明书的免疫和呈色反应步骤进行；苏木精、伊红染色，脱水、透明、封片。
5.细胞处理及寡核苷酸导入：取直径为35 mm的六孔板，以1×105 VSMCs重悬于1ml 20%NBS DMEM培养液中转种，37℃、5% CO2培养箱内24小时，使细胞贴壁并生长达50%～60%融合。换0.5%NBS DMEM培养液血清饥饿培养48小时，使细胞生长同步化；血清饥饿培养24小时后，每孔分别加入一种相应的寡核苷酸，浓度为10 μmol/L，重复三次。空白对照组不加任何干预因素。血清饥饿培养结束后，改用20%NBS DMEM培养24小时，刺激细胞增殖。于刺激培养后1～5天取出，PBS漂洗，加入TRIzol 1 ml，-20℃冻存。
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6.按加入寡核苷酸的不同分为：对照组、反义组、正义组和错配反义组，每组分别为3例。
7.细胞总RNA提取：按TRIzol 试剂盒说明书操作，提取的RNA经电泳鉴定未被降解、SDU-68型紫外分光光度仪测定，A260/A280 >1.8。260 nm测吸光度A值，调整RNA浓度为1 μg/μl。
8.PCR引物设计：依大鼠c-myc、PCNA序列，按PCR引物设计要求，经计算机软件(PCRDESN)分析，设计出PCR扩增引物，序列为c-myc：5′-TGCTGCATGAAGAGACACCG-3′，5′-TTTCAACTGTTCTCGCCGTT-3′；PCNA：5′-GACACATACCGCTGCGATCG-3′，5′-TCACCACAGCATCTCCAATAT-3′。同时，根据其各自片断大小的不同，分别选用310 bp和540 bp β-actin作为内参照,序列为310 bp β-actin：5′-GAGCACCCTGTGCTGCTCACCCTAGG-3′，5′-GTGGTGGTGAAGCTGTAGCCACGCT-3′；540 bp β-actin：5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3′，5′-CTCTTTGATGTCACGCACGATT TC-3′。由上海生物工程公司合成，PAGE纯化。
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9.逆转录PCR反应：取RNA溶液2 μg加DEPC H2O至11.5 μl，按逆转录PCR试剂盒说明书步骤加入反应体系进行PCR扩增，每一反应体系加入c-myc或PCNA上、下游引物和一对内参照引物各1 μl(18 μmol/L)，PCR仪扩增条件：94℃ 45秒，60℃ 45秒，72℃ 90秒，共25次循环，最后72℃延伸10分钟，4℃储存。
10.电泳鉴定：配制2% 琼脂糖凝胶板，取PCR扩增产物20 μl，加入溴酚蓝上样液2 μl后上样，稳压电泳(5 v/cm)约1.5小时。将凝胶置入0.5 μg/ml溴乙啶水溶液中染色10分钟，紫外灯下观察、摄片。
11.图像分析：结果进行计算机图像分析，测定各个条带的灰度值，将每组所得图像灰度数据的均数作为校正参数，灰度值/组内均数求得数据结果。
12.统计学处理：图像分析所得数据都以均数±标准差表示，以组间t检验进行统计学处理。
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结果
1.VSMCs培养及鉴定：显微镜下观察血管平滑肌细胞培养和鉴定状况，结果表明细胞形态和α-actin功能良好。
2.寡核苷酸稳定性测定：寡核苷酸加入血清培养液后1～5天进行电泳分析，结果显示有清晰的条带存在，证实寡核苷酸在血清培养液中未被完全降解(图1)。
(1～5分别为寡核苷酸加入血清培养液后1～5天的情况)
图1 寡核苷酸变性PAGE凝胶电泳结果
3.寡核苷酸转染VSMCs测定：经过原位杂交检测，细胞浆内可见黑色颗粒存在，表明寡核苷酸能够进入细胞内(图2)，而对照组则无此表现(图3)。
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图2 地高辛标记寡核苷酸转染VSMCs(NBT/X-P染色，HE复染×200)
图3 未标记寡核苷酸转染VSMCs(NBT/X-P染色，HE复染×200)
4.细胞总RNA提取及鉴定：将提取的RNA作紫外分光光度计测定，结果A260/A280>1.8，且得率较高；细胞总RNA产物经变性胶电泳,证实RNA未被降解。
5.RT-PCR结果鉴定：RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，见500 bp～600 bp和300 bp～400 bp之间各有一条清晰的条带存在，符合PCR扩增引物设计569 bp产物的c-myc基因片断和307 bp产物的PCNA基因片断，说明其分别为c-myc和PCNA基因的表达产物且PCR实验条件适当(图4)。
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1：Marker(100 bp)；2，3：c-myc基因表达产物569 bp，β-actin内参照310 bp；
4，5：PCNA基因表达产物307 bp，β-actin内参照540 bp
图4 RT-PCR产物鉴定结果
6.基因表达结果分析：在加入不同寡核苷酸处理后各个时间点，分别进行RT-PCR，结果与对照组相比，反义寡核苷酸作用后，其相关myc、PCNA基因表达明显减弱(图5、6)。通过计算机图像分析，结果表明：除反义myc组第三天数据因标准差较大，与对照组没有显著差异外，其余各组差异均有显著意义P<0.05(表1)。说明反义寡核苷酸作用后，能有效抑制其相应基因表达。
表1 RT-PCR产物半定量分析(
±s) 组别
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例数
处理后时间(d)
1
2
3
4
5
对照组
3
1.093±0.059
1.095±0.031
1.101±0.083
1.202±0.073
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1.168±0.055
正义myc
3
1.108±0.031
1.081±0.067
1.069±0.031
1.247±0.206
1.092±0.058
错配myc
3
0.985±0.059
1.026±0.035
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1.037±0.166
0.985±0.110
1.052±0.087
反义myc
3
0.814±0.043*
0.799±0.098*
0.698±0.248
0.558±0.186*
0.689±0.137*
, http://www.100md.com 对照组
3
1.091±0.036
1.009±0.041
1.250±0.147
1.087±0.075
1.190±0.071
正义PCNA
3
1.183±0.069
1.047±0.150
1.155±0.059
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1.088±0.170
0.972±0.044
错配PCNA
3
1.135±0.018
1.122±0.082
0.917±0.050
0.850±0.142
1.039±0.053
反义PCNA
3
0.589±0.110*
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0.712±0.099*
0.677±0.083*
0.542±0.225*
0.811±0.063*
*：与对照组比较P<0.05
1，15：Marker(100 bp)；2：血清饥饿时；3，7，11，16，20：对照组，血清刺激后第1～5天(Day1～5)；4，8，12，17，21：正义组，Day1～5；
5，9，13，18，22：错配组，Day1～5；6，10，14，19，23：反义组，Day1～5。
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图5 c-myc基因表达结果
1，13：Marker(100 bp)；2：血清饥饿时；3，7，11，16，20：对照组，血清刺激后第1～5天(Day1～5)；4，8，12，17，21：正义组，Day1～5；
5，9，14，18，22：错配组，Day1～5；6，10，15，19，23：反义组，Day1～5。
图6 PCNA基因表达结果
讨论 体外人工合成的反义寡核苷酸可特异性与某些基因的DNA或mRNA结合，以阻止该基因的转录或翻译，达到削弱该基因功能的目的[3]。本研究就是利用针对c-myc、PCNA mRNA的三种不同寡核苷酸，比较他们对VSMCs中该类基因表达的影响。目前，反义机制尚未完全明了，尽管有报道[4]认为反义机制并非寡核苷酸进入细胞后与靶基因结合而发挥作用。但更多的研究报道仍倾向于碱基互补的反义机制学说[5]。因此，我们将检测寡核苷酸在血清培养基中保持稳定和有效转染细胞作为研究的前提条件。
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当VSMCs受外界因素刺激后，细胞内部通过一系列信号肽传导系统作用，启动细胞内调节细胞增殖的基因表达，最终导致细胞增殖。其中，细胞原癌基因和细胞周期调节基因在启动或维持细胞增殖过程中起着重要作用，通过测定这些基因的表达，可反映细胞增殖状态。
c-myc原癌基因与禽成髓细胞病毒MC29转化基因同源，它编码一种短暂的、与核磷蛋白结合的特异DNA序列来调节DNA转录。生长静止期的VSMCs在受到有丝分裂源刺激后2～4小时内迅速诱导c-myc表达至高峰期，随后，细胞内的c-myc基因表达几个细胞循环。因此，c-myc起着启动和维持细胞增殖的双重作用[6]。PCNA最初是作为一种核抗原加以描述的，随后证实它是DNA多聚酶δ的一个辅助亚单位，这种细胞循环特异蛋白在细胞分裂时协助DNA引导链和随从链的合成，阻遏PCNA基因的表达，可抑制VSMCs增殖与移行，但不会导致细胞死亡[7]；PCNA在细胞循环进入S期时表达，而处在G0/G1期的细胞则基本不表达[8]，因此，有人将其作为一种细胞增殖的标志[9]。我们选择c-myc、PCNA作为研究对象，通过反义技术，成功抑制其基因表达。
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对细胞内相关基因mRNA表达水平的检测，能了解该基因在细胞功能活动中作用是否活跃。RT-PCR是对细胞内某一特定基因序列进行大量扩增后，检测该基因mRNA在细胞中的表达水平，在实验条件控制一致时，可半定量对比细胞内mRNA含量的多寡，从而判断细胞基因的表达水
平[10]。我们的实验结果表明，细胞增殖不活跃时(血清饥饿培养时)，其c-myc和PCNA基因表达微弱，而细胞增殖时，该基因明显表达，且在刺激细胞增殖后短期就表达。我们通过加入针对c-myc和PCNA基因的不同寡核苷酸，观察到经反义寡核苷酸处理的VSMCs，其相关基因表达减弱，而正义和错配反义寡核苷酸处理后，与对照组相比变化不明显。这一结果说明反义寡核苷酸进入细胞后通过碱基互补的原则与靶mRNA结合，形成DNA：RNA杂交体，从而启动细胞内RNA酶(如RNase H等)，迅速将mRNA降解，使mRNA的翻译功能减弱或消失，不能产生有效的作用蛋白，由此来抑制靶基因的表达，进而抑制细胞增殖，以达到防治再狭窄的目的。
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本课题为国家自然科学基金资助项目(39470681)
参考文献
[1] Cross KS, Davies MG, el-Sanadiki MN, et al. Long-term human vein graft contractility and morphology: a functional and histopathological study of retrieved coronary vein grafts. Br J Surg, 1994, 81:699-705.
[2] Moggio RA, Ding JZ, Smith CJ, et al. Immediate-early gene expression in human saphenous veins harvested during coronary artery bypass graft operations. J Thorac Cardiovasc Surg, 1995, 110:209-213.
, http://www.100md.com
[3] Bennett MR, Schwartz SM. Antisense therapy for angioplasty restenosis: Some critical considerations. Circulation, 1995, 92:1981-1993.
[4] Burgess TL, Fisher EF, Ross SL, et al. The antiproliferative activity of c-myb and c-myc antisense oligonucleotides in smooth muscle cells is caused by a nonantisense mechanism. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92:4051-4055.
[5] Gunn J, Holt CM, Francis SE, et al. The effect of oligonucleotides to c-myb on vascular smooth muscle cell proliferation and neointima formation after porcine coronary angioplasty. Circ Res, 1997, 80:520-531.
, http://www.100md.com
[6] Bennett MR, Anglin S, McEwan JR, et al. Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation in vitro and in vivo by c-myc antisense oligodeoxynucleotides. J Clin Invest, 1994, 93:820-828.
[7] Simons M, Edelman ER, Rosenberg RD. Antisense proliferating cell nuclear antigen oligonucleotides inhibit intimal hyperplasia in a rat carotid artery injury model. J Clin Invest, 1994, 93:2351-2356.
[8] Pellicciari C, Danova M, Giordano M, et al. Expression of cell cycle related proteins--proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and statin--during adaptation and de-adaptation of EUE cells to a hypertonic medium. Cell Prolif, 1991, 24:469-479.
, http://www.100md.com
[9] Azrin MA, Mitchel JF, Bow LM, et al. Local delivery of c-myb antisense oligonucleotides during balloon angioplasty. Cathet Cardiovasc Diagn, 1997, 41:232-240.
[10] Goswami PC, Albee LD, Spitz DR, et al. A polymerase chain reaction assay for simultaneous detection and quantitation of proto-oncogene and GAPD mRNAs in different cell growth rates. Cell Prolif, 1997, 30:271-282.
收稿：1998-07-28 修回：1998-09-27, http://www.100md.com
单位：200001 上海第二医科大学附属仁济医院血管外科[边杰芳(现在第四军医大学西京医院血管外科 710032)、张柏根、钱虎声]；上海第二医科大学人类基因治疗中心暨分子生物学实验室(陈诗书)
关键词：寡核苷酸类，反义；肌，平滑，血管；基因，myc；增殖细胞核抗原
中华医学杂志990103 【摘要】 目的 研究有效的防治血管术后再狭窄的方法，以及应用反义c-myc、增殖细胞核抗原(PCNA)基因片断来封闭其相应基因表达的可行性。方法 设计并合成c-myc、PCNA正义、反义及四个碱基错配的反义寡核苷酸，经体外稳定性检测和细胞转染实验证实其有效性后，分别作用于体外培养的血管平滑肌细胞(VSMCs)，应用逆转录PCR半定量测定及计算机图像分析的方法，观测其对c-myc、PCNA基因表达的影响。结果 设计合成的寡核苷酸在血清培养基中1～5天未被完全降解；寡核苷酸能顺利进入VSMCs内；10 μmol/L 浓度的反义c-myc、PCNA作用于VSMCs后1～5天，其相应的c-myc和PCNA基因表达减弱，计算机图像分析表明其表达产物与对照组相比差异有显著意义(P<0.05)，而正义和错配反义寡核苷酸无此效应(P>0.05)。结论 反义c-myc和PCNA寡核苷酸可通过抑制其相应基因表达来实现阻遏血管平滑肌细胞增殖。
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Antisense oligonucleotides inhibit c-myc and PCNA expression in the vascular smooth muscle cells BIAN Jiefang, ZHANG Baigen, CHEN Shishu, et al. Department of Vascular Surgery, Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001
【Abstract】 objective To study the methods for prevention and treatment of vascular restenosis. Methods We used two factors which result in hyperplasia of vascular smooth muscle cells (VSMCs) and applied antisense c-myc, PCNA oligonucleotides to attenuate the expression of their related gene. The sense, antisense, and mismatched oligomers for c-myc or PCNA were designed and synthesized. They were individually delivered to the cultured VSMCs after the oligomers were stable in culture medium for 5 days and could cross the plasma membranes into the cells. Using RT-PCR and the image analysis system, we observed the changes of both c-myc and PCNA gene expression in the VSMCs. Results Antisense c-myc and PCNA at a concentration of 10 μmol/L were able to inhibit the expression of c-myc and PCNA gene in VSMCs (P<0.05)，whereas the sense and the mismatched ones couldn′t inhibit the expression (P>0.05). Conclusion The antisense technique is an effective method for the inhibition of VSMCs proliferation.
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【Key words】 Oligonucleotides, antisense Muscle, smooth, vascular Genes, myc PCNA
(Natl Med J China, 1999, 79:10-14)
心脑和周围血管闭塞性疾病是严重威胁人类生命和健康的常见病，各种手术和介入方法的应用，可达到较好的治疗效果。但术后3～6个月内约有30%～50%患者发生再狭窄[1]，使其远期疗效受到严重削弱。研究表明，血管平滑肌细胞(VSMCs)过度增殖可能是再狭窄发生的主要原因[2]。因此，阻遏VSMCs过度增殖就成为防治再狭窄的关键。我们通过应用反义寡核苷酸技术特异抑制c-myc和PCNA基因表达，以达到抑制VSMCs增殖的目的。为防治血管再狭窄研究提供一条有效手段。
材料和方法
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一、材料
一、材料Wistar大鼠购自中国医学科学院上海寄生虫研究所；新生小牛血清(NBS)购自四季青公司；DMEM细胞培养液、RNA提取试剂盒(TRIzol)、逆转录酶(M-MLV)、Taq DNA聚合酶均购自Gibco-BRL公司；抗α-actin单克隆抗体、兔抗小鼠IgG/FITC购自丹麦DAKO公司；丙烯酰胺、地高辛标记物、抗地高辛抗体及其呈色试剂、100 bp DNA Ladder、RNA酶抑制剂均购自BOEHRINGER MANNHEIM公司；亚甲基双丙烯酰胺、焦磷酸二乙酯(DEPC)购自Fluka公司；超纯尿素、随机引物、dNTP购自 Promega公司；其余试剂均为进口分装或国产分析纯。
二、方法
1.VSMCs原代培养和鉴定：取Wistar大鼠胸主动脉，以贴块法建立原代培养细胞，传代培养至7～8代时，分装冻存；应用免疫组织化学法鉴定VSMCs内的α-actin蛋白，以区分开内皮细胞和纤维细胞等，荧光显微镜下观察(NIKONX-EFD型，日本)。
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2.寡核苷酸的设计、合成和纯化：根据大鼠c-myc和PCNA cDNA序列，分别选择其相应mRNA翻译起始位点AUG后15和18个碱基，设计出各自相应的正义、反义及错配寡核苷酸。c-myc：正义5′-ATGCCCCTCAAC*G*T*G-3′,反义5′-CACGTTG AGGGG*C*A*T-3′,错配
；PCNA：正义5′-TTTGAGGCACGCCTG*A*T*C-3′，反义5′-GATCAGGCGTGCCTC*A*A*A 3′，错配(注：* 表示硫代磷酸修饰的碱基；-表示与反义序列错配的碱基)。DNA自动合成仪合成，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化。, 百拇医药
3.寡核苷酸在血清培养液中稳定性测定：将合成的寡核苷酸加入20%NBS DMEM中，使其终浓度为10 μmol/L，置37℃ 5% CO2培养箱内1～5天，取样进行变性PAGE凝胶电泳分析，溴乙啶染色，紫外灯下观察结果，摄片记录。
4.寡核苷酸转染VSMCs测定：在合成寡核苷酸5′末端最后一个碱基时连接上Amionlinker，使其另一端与地高辛结合；以10 μmol/L浓度，将标记好地高辛的寡核苷酸加入培养的VSMCs中，对照组加未标记的相应寡核苷酸，37℃ 5% CO2培养箱内培养2、4、10、16、24、36小时取出玻片，漂洗，干燥，固定；此后按地高辛标记原位杂交试剂盒说明书的免疫和呈色反应步骤进行；苏木精、伊红染色，脱水、透明、封片。
5.细胞处理及寡核苷酸导入：取直径为35 mm的六孔板，以1×105 VSMCs重悬于1ml 20%NBS DMEM培养液中转种，37℃、5% CO2培养箱内24小时，使细胞贴壁并生长达50%～60%融合。换0.5%NBS DMEM培养液血清饥饿培养48小时，使细胞生长同步化；血清饥饿培养24小时后，每孔分别加入一种相应的寡核苷酸，浓度为10 μmol/L，重复三次。空白对照组不加任何干预因素。血清饥饿培养结束后，改用20%NBS DMEM培养24小时，刺激细胞增殖。于刺激培养后1～5天取出，PBS漂洗，加入TRIzol 1 ml，-20℃冻存。
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6.按加入寡核苷酸的不同分为：对照组、反义组、正义组和错配反义组，每组分别为3例。
7.细胞总RNA提取：按TRIzol 试剂盒说明书操作，提取的RNA经电泳鉴定未被降解、SDU-68型紫外分光光度仪测定，A260/A280 >1.8。260 nm测吸光度A值，调整RNA浓度为1 μg/μl。
8.PCR引物设计：依大鼠c-myc、PCNA序列，按PCR引物设计要求，经计算机软件(PCRDESN)分析，设计出PCR扩增引物，序列为c-myc：5′-TGCTGCATGAAGAGACACCG-3′，5′-TTTCAACTGTTCTCGCCGTT-3′；PCNA：5′-GACACATACCGCTGCGATCG-3′，5′-TCACCACAGCATCTCCAATAT-3′。同时，根据其各自片断大小的不同，分别选用310 bp和540 bp β-actin作为内参照,序列为310 bp β-actin：5′-GAGCACCCTGTGCTGCTCACCCTAGG-3′，5′-GTGGTGGTGAAGCTGTAGCCACGCT-3′；540 bp β-actin：5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3′，5′-CTCTTTGATGTCACGCACGATT TC-3′。由上海生物工程公司合成，PAGE纯化。
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9.逆转录PCR反应：取RNA溶液2 μg加DEPC H2O至11.5 μl，按逆转录PCR试剂盒说明书步骤加入反应体系进行PCR扩增，每一反应体系加入c-myc或PCNA上、下游引物和一对内参照引物各1 μl(18 μmol/L)，PCR仪扩增条件：94℃ 45秒，60℃ 45秒，72℃ 90秒，共25次循环，最后72℃延伸10分钟，4℃储存。
10.电泳鉴定：配制2% 琼脂糖凝胶板，取PCR扩增产物20 μl，加入溴酚蓝上样液2 μl后上样，稳压电泳(5 v/cm)约1.5小时。将凝胶置入0.5 μg/ml溴乙啶水溶液中染色10分钟，紫外灯下观察、摄片。
11.图像分析：结果进行计算机图像分析，测定各个条带的灰度值，将每组所得图像灰度数据的均数作为校正参数，灰度值/组内均数求得数据结果。
12.统计学处理：图像分析所得数据都以均数±标准差表示，以组间t检验进行统计学处理。
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结果
1.VSMCs培养及鉴定：显微镜下观察血管平滑肌细胞培养和鉴定状况，结果表明细胞形态和α-actin功能良好。
2.寡核苷酸稳定性测定：寡核苷酸加入血清培养液后1～5天进行电泳分析，结果显示有清晰的条带存在，证实寡核苷酸在血清培养液中未被完全降解(图1)。
(1～5分别为寡核苷酸加入血清培养液后1～5天的情况)
图1 寡核苷酸变性PAGE凝胶电泳结果
3.寡核苷酸转染VSMCs测定：经过原位杂交检测，细胞浆内可见黑色颗粒存在，表明寡核苷酸能够进入细胞内(图2)，而对照组则无此表现(图3)。
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图2 地高辛标记寡核苷酸转染VSMCs(NBT/X-P染色，HE复染×200)
图3 未标记寡核苷酸转染VSMCs(NBT/X-P染色，HE复染×200)
4.细胞总RNA提取及鉴定：将提取的RNA作紫外分光光度计测定，结果A260/A280>1.8，且得率较高；细胞总RNA产物经变性胶电泳,证实RNA未被降解。
5.RT-PCR结果鉴定：RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，见500 bp～600 bp和300 bp～400 bp之间各有一条清晰的条带存在，符合PCR扩增引物设计569 bp产物的c-myc基因片断和307 bp产物的PCNA基因片断，说明其分别为c-myc和PCNA基因的表达产物且PCR实验条件适当(图4)。
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1：Marker(100 bp)；2，3：c-myc基因表达产物569 bp，β-actin内参照310 bp；
4，5：PCNA基因表达产物307 bp，β-actin内参照540 bp
图4 RT-PCR产物鉴定结果
6.基因表达结果分析：在加入不同寡核苷酸处理后各个时间点，分别进行RT-PCR，结果与对照组相比，反义寡核苷酸作用后，其相关myc、PCNA基因表达明显减弱(图5、6)。通过计算机图像分析，结果表明：除反义myc组第三天数据因标准差较大，与对照组没有显著差异外，其余各组差异均有显著意义P<0.05(表1)。说明反义寡核苷酸作用后，能有效抑制其相应基因表达。
表1 RT-PCR产物半定量分析(
±s) 组别, 百拇医药
例数
处理后时间(d)
1
2
3
4
5
对照组
3
1.093±0.059
1.095±0.031
1.101±0.083
1.202±0.073
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1.168±0.055
正义myc
3
1.108±0.031
1.081±0.067
1.069±0.031
1.247±0.206
1.092±0.058
错配myc
3
0.985±0.059
1.026±0.035
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1.037±0.166
0.985±0.110
1.052±0.087
反义myc
3
0.814±0.043*
0.799±0.098*
0.698±0.248
0.558±0.186*
0.689±0.137*
, http://www.100md.com 对照组
3
1.091±0.036
1.009±0.041
1.250±0.147
1.087±0.075
1.190±0.071
正义PCNA
3
1.183±0.069
1.047±0.150
1.155±0.059
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1.088±0.170
0.972±0.044
错配PCNA
3
1.135±0.018
1.122±0.082
0.917±0.050
0.850±0.142
1.039±0.053
反义PCNA
3
0.589±0.110*
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0.712±0.099*
0.677±0.083*
0.542±0.225*
0.811±0.063*
*：与对照组比较P<0.05
1，15：Marker(100 bp)；2：血清饥饿时；3，7，11，16，20：对照组，血清刺激后第1～5天(Day1～5)；4，8，12，17，21：正义组，Day1～5；
5，9，13，18，22：错配组，Day1～5；6，10，14，19，23：反义组，Day1～5。
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图5 c-myc基因表达结果
1，13：Marker(100 bp)；2：血清饥饿时；3，7，11，16，20：对照组，血清刺激后第1～5天(Day1～5)；4，8，12，17，21：正义组，Day1～5；
5，9，14，18，22：错配组，Day1～5；6，10，15，19，23：反义组，Day1～5。
图6 PCNA基因表达结果
讨论 体外人工合成的反义寡核苷酸可特异性与某些基因的DNA或mRNA结合，以阻止该基因的转录或翻译，达到削弱该基因功能的目的[3]。本研究就是利用针对c-myc、PCNA mRNA的三种不同寡核苷酸，比较他们对VSMCs中该类基因表达的影响。目前，反义机制尚未完全明了，尽管有报道[4]认为反义机制并非寡核苷酸进入细胞后与靶基因结合而发挥作用。但更多的研究报道仍倾向于碱基互补的反义机制学说[5]。因此，我们将检测寡核苷酸在血清培养基中保持稳定和有效转染细胞作为研究的前提条件。
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当VSMCs受外界因素刺激后，细胞内部通过一系列信号肽传导系统作用，启动细胞内调节细胞增殖的基因表达，最终导致细胞增殖。其中，细胞原癌基因和细胞周期调节基因在启动或维持细胞增殖过程中起着重要作用，通过测定这些基因的表达，可反映细胞增殖状态。
c-myc原癌基因与禽成髓细胞病毒MC29转化基因同源，它编码一种短暂的、与核磷蛋白结合的特异DNA序列来调节DNA转录。生长静止期的VSMCs在受到有丝分裂源刺激后2～4小时内迅速诱导c-myc表达至高峰期，随后，细胞内的c-myc基因表达几个细胞循环。因此，c-myc起着启动和维持细胞增殖的双重作用[6]。PCNA最初是作为一种核抗原加以描述的，随后证实它是DNA多聚酶δ的一个辅助亚单位，这种细胞循环特异蛋白在细胞分裂时协助DNA引导链和随从链的合成，阻遏PCNA基因的表达，可抑制VSMCs增殖与移行，但不会导致细胞死亡[7]；PCNA在细胞循环进入S期时表达，而处在G0/G1期的细胞则基本不表达[8]，因此，有人将其作为一种细胞增殖的标志[9]。我们选择c-myc、PCNA作为研究对象，通过反义技术，成功抑制其基因表达。
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对细胞内相关基因mRNA表达水平的检测，能了解该基因在细胞功能活动中作用是否活跃。RT-PCR是对细胞内某一特定基因序列进行大量扩增后，检测该基因mRNA在细胞中的表达水平，在实验条件控制一致时，可半定量对比细胞内mRNA含量的多寡，从而判断细胞基因的表达水
平[10]。我们的实验结果表明，细胞增殖不活跃时(血清饥饿培养时)，其c-myc和PCNA基因表达微弱，而细胞增殖时，该基因明显表达，且在刺激细胞增殖后短期就表达。我们通过加入针对c-myc和PCNA基因的不同寡核苷酸，观察到经反义寡核苷酸处理的VSMCs，其相关基因表达减弱，而正义和错配反义寡核苷酸处理后，与对照组相比变化不明显。这一结果说明反义寡核苷酸进入细胞后通过碱基互补的原则与靶mRNA结合，形成DNA：RNA杂交体，从而启动细胞内RNA酶(如RNase H等)，迅速将mRNA降解，使mRNA的翻译功能减弱或消失，不能产生有效的作用蛋白，由此来抑制靶基因的表达，进而抑制细胞增殖，以达到防治再狭窄的目的。
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本课题为国家自然科学基金资助项目(39470681)
参考文献
[1] Cross KS, Davies MG, el-Sanadiki MN, et al. Long-term human vein graft contractility and morphology: a functional and histopathological study of retrieved coronary vein grafts. Br J Surg, 1994, 81:699-705.
[2] Moggio RA, Ding JZ, Smith CJ, et al. Immediate-early gene expression in human saphenous veins harvested during coronary artery bypass graft operations. J Thorac Cardiovasc Surg, 1995, 110:209-213.
, http://www.100md.com
[3] Bennett MR, Schwartz SM. Antisense therapy for angioplasty restenosis: Some critical considerations. Circulation, 1995, 92:1981-1993.
[4] Burgess TL, Fisher EF, Ross SL, et al. The antiproliferative activity of c-myb and c-myc antisense oligonucleotides in smooth muscle cells is caused by a nonantisense mechanism. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92:4051-4055.
[5] Gunn J, Holt CM, Francis SE, et al. The effect of oligonucleotides to c-myb on vascular smooth muscle cell proliferation and neointima formation after porcine coronary angioplasty. Circ Res, 1997, 80:520-531.
, http://www.100md.com
[6] Bennett MR, Anglin S, McEwan JR, et al. Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation in vitro and in vivo by c-myc antisense oligodeoxynucleotides. J Clin Invest, 1994, 93:820-828.
[7] Simons M, Edelman ER, Rosenberg RD. Antisense proliferating cell nuclear antigen oligonucleotides inhibit intimal hyperplasia in a rat carotid artery injury model. J Clin Invest, 1994, 93:2351-2356.
[8] Pellicciari C, Danova M, Giordano M, et al. Expression of cell cycle related proteins--proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and statin--during adaptation and de-adaptation of EUE cells to a hypertonic medium. Cell Prolif, 1991, 24:469-479.
, http://www.100md.com
[9] Azrin MA, Mitchel JF, Bow LM, et al. Local delivery of c-myb antisense oligonucleotides during balloon angioplasty. Cathet Cardiovasc Diagn, 1997, 41:232-240.
[10] Goswami PC, Albee LD, Spitz DR, et al. A polymerase chain reaction assay for simultaneous detection and quantitation of proto-oncogene and GAPD mRNAs in different cell growth rates. Cell Prolif, 1997, 30:271-282.
收稿：1998-07-28 修回：1998-09-27, http://www.100md.com