应用克隆杂交和聚合酶链反应技术检测TDH基因
作者：王保龙 董辉军
单位：王保龙 安徽省临床检验中心， 安徽 合肥 230001；董辉军 安徽省立医院
关键词：副溶血弧菌；克隆杂交；聚合酶链反应
疾病控制杂志990106
【摘要】 目的 建立快速、敏感、特异和精确的方法检测致病性副溶血弧菌(VP)。方法 在耐热溶血毒素(TDH)结构基因序列的基础上，自行设计探针和引物，应用克隆杂交方法检测30株不同来源的VP，同时对10株不同KP反应的VP DNA行PCR-TDH检测。 结果 30例实验菌株，26例KP阳性株克隆杂交出现阳性信号，其余4例杂交阴性(2例KP弱阳性、2例KP阴性)。用PCR检测的10株VP中，6例KP阳性株TDH基因均阳性，但有1株KP弱阳性和1株KP阴性株也呈TDH基因阳性。PCR阳性结果均用Southern blot法证实。 结论 应用克隆杂交技术检测TDH基因在合适的条件下能有效地鉴别致病性与非致病性VP。PCR检测TDH基因为研究VP的致病机理奠定基础，在临床上可作为一种检测致病性VP的快速敏感的初筛试验。
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【中图分类号】 R378.3； R446 【文献标识码】 A 【文章编号】 1008-6013(1999)01-0016-03
Detection of TDH gene with colony hybridization and PCR
Wang Baolong, Dong Huijun.
Centre of Clinical Laboratory Science of Anhui, Hefei 230001, China
【Abstract】 Objective To establish fast, sensitive and precise methods for detecting Kanagawa phenomenon(KP)-positive vibrio parahaemolyticus(VP). Methods Synthetic oligodeoxyri-bonucleotid was used in the colony hybridization test to examine thermostable direct hemolysim(TDH) gene, and polymerase chain reaction(PCR) was also used to detect TDH gene. Results 30 strains VP including different KP reactions and serotypes were detected with colony hybridization, 26 strains were positive, the others were negative. All the positive strains were in accordence with the traditional KP test, but 2 strains which were weak-positive in KP test were negative. 6 KP-positive strains, 2 KP-negative strains and 2 KP-weak-positive strains were tested with PCR for the TDH gene. All the KP-positive strains were TDH gene positive. At the same time, 1 KP weak-positive strain and 1 KP-negative strain were also gene positive. These PCR positive results were confirmed with Southern blot. Conclusions Under optimal conditions, the probe was capable of detecting KP-positive VP and distinguishing pathogenic VP from inpathogenic VP. Detecting TDH gene by PCR was helpful in understanding the pathogenic mechanism of VP and benefical in quickly screenning pathogenicity VP in clinic, it also increases the sensitivity and specificity.
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【Key words】 vibrio parahaemolyticus(VP); colony hybridization; polymerase chain reaction(PCR)
副溶血弧菌(VP)可引起食物中毒或急性胃肠炎。其致病机理至今尚不明确，目前一般认为该菌产生的热稳定性溶血毒素(TDH)是重要的毒力因子。TDH可在莪萋氏血平板上产生一种特殊的β溶血现象，称作Kanagawa现象(KP阳性)。临床上分离出的副溶血弧菌株几乎都是KP阳性；因此通常认为KP阳性株为产毒株，KP阴性为非产毒株。分子生物学研究证明，所有的KP阳性株都同时携带tdh1和tdh2两种基因[1]，86%的KP弱阳性和16%的KP阴性株携带tdh3和tdh4基因[2]。tdh是一个基因家族，各成员的基因结构有着高度的同源性[3]。本文的引物和探针就是在TDH结构基因序列的基础上设计的[4]。
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1 材料与方法
1.1 菌株来源 30株实验菌株中28株来源于临床标本，2株来源于海洋环境(由上海市卫生防疫站提供)，均经生物化学和盐耐受性试验确定为副溶血弧菌。
1.2 试剂材料 诊断因子血清(O1～O13)和K1～K71由上海市卫生防疫站提供)，Taq DNA多聚酶、γ-32P-ATP、T4多聚核苷酸激酶；480型PCR扩增仪(PE公司产品)，尼龙膜。
1.3 实验方法
1.3.1 Kanagawa(神奈川)试验及血清学分型 Kanagawa试验：按传统方法以KP阳性标准株作阳性对照；血清学分型：采用玻片凝集试验。
, 百拇医药 1.3.2 细菌DNA制备 参照文献2介绍的方法提取和制备。
1.3.3 PCR检测TDH基因方法的建立 按文献1报道的基因序列自行设计引物：上游引物：5′-GAGGTCTCTGACTTTTGGAC-3′；下游引物：5′-TTGGATATACACATTACCAA-3′(由中科院上海细胞所合成)。PCR扩增反应：各步温度及时间为变性94℃ 1 min，退火55℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，40个循环，最后一个循环在72℃维持5 min。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳：电压为220 V，电流为200 mA，琼脂浓度为1.8%。Southern杂交：将电泳后的琼脂糖凝胶经变性、转移和固定等处理后，做杂交试验。45℃杂交过夜，用2×ssc 55℃洗膜30 min，空气晾干，-80℃曝光过夜，放射自显影。寡核苷酸探针序列为5′-GAAACTCCAGAATATTTTGT用γ-32P-ATP 5′末端法标记。特异性及敏感性试验：分别采用正常人白细胞DNA、大肠埃希氏菌DNA，创伤弧菌DNA及阳性对照株20564(O13∶K65)DNA和空白对照进行了扩增试验，用以考察特异性。将纯化的KP阳性标准20564(O13∶K65)DNA用双蒸水进行系列稀释，然后在100 μl标准PCR反应体系中分别加入DNA；1 μg、10-1 μg、10-2 μg、10-3 μg、10-4 μg、10-5 μg，用上述同样的条件扩增40个循环，用来测定敏感度。
, 百拇医药
1.3.4 合成特异性寡核苷酸探针检测KP阳性副溶血弧菌 (1)菌苔在尼龙膜上印迹：将30株副溶血弧菌及大肠埃希氏菌、链球菌、清水弧菌、河弧菌各1株点种于LB平板上37℃培养过夜，再作印迹、变性和固定等处理。(2)探针的合成、标记与纯化：采用亚磷酸酰胺法在App Lied Biosystem 381A DNA合成仪上合成，序列为5′-GCATATGAGAGTGGTAGTGG-3′。用γ-32P-ATP 5′末端法标记，G-50 Sephadex层析法纯化。(3)点杂交：将制备好的尼龙膜放在6×ssc内浸泡5 min后取出，45℃预杂交3 h，然后更换杂交液(预杂交液+标记的探针)45℃杂交过液。取出膜用6×ssc 55℃洗涤1 h，更换新鲜的6×ssc， 55℃再洗1 h，然后用2×ssc室温浸泡5 min，空气中晾干，-80℃曝光放射自显影[5]。
2 结果
2.1 Kanagawa试验及血清学分型 30株副溶血弧菌分属不同的血清型。1株未检出K抗原，1株未检出O抗原，2株KP弱阳性，2株KP阴性，余26株均为KP阳性。
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2.2 PCR检测TDH基因
2.2.1 PCR扩增产物琼脂糖电泳及Southern杂交 实验对6株KP阳性，2株KP弱阳性及2株KP阴性共10株副溶血弧菌DNA进行了TDH基因检测，其中6株副溶血弧菌KP阳性菌扩增产物均出现360 bp的条带，长度与设计的目的基因片断相同，1例KP弱阳性和1例KP阴性株亦出现360 bp的扩增条带。上述8条PCR扩增阳性条带Southern杂交均出现阳性信号，表明有8株副溶血弧菌携带TDH基因(图1、图2)。
图1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳条带
2、3为KP阴性菌，6、7为KP弱阳性菌，其余均为KP阳性菌，11为阳性对照，12为阴性对照。
, 百拇医药
图2 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳条带Southern杂交
8条360 bp扩增条带杂交信号均呈阳性反应
2.2.2 敏感性及特异性试验 在100 μl标准PCR反应体系中，PCR检测TDH基因的敏感性达10-6 μg。除KP阳性标准株20564 DNA出现360 bp扩增电泳条带外，大肠埃希氏菌、创伤弧菌及人白细胞DNA均未见扩增条带，表明设计的引物是TDH基因特异的。
2.3 特异性寡核苷酸探针点杂交 55℃为最合适的洗膜温度。在此条件下，26株KP阳性菌均杂交信号阳性，2例KP弱阳性和2例KP阴性菌杂交信号均阴性，其余4株用来考察试验特异性的非副溶血弧菌杂交信号也均阴性。结果表明，合成的寡核苷酸探针具有特异性，能够作为一种新的检测KP阳性副溶血弧菌的方法(表1)。
表1 寡核苷酸探针克隆杂交结果 菌株数
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KP
洗涤信号温度(℃)
45
50
55
60
24
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1
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1(大肠杆菌)
N
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1(清水弧菌)
N
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1(河弧菌)
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1(链球菌)
N
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3 讨论
3.1 30株副溶血弧菌分属不同的血清型，有1株未检出K抗原，1株未检出O抗原，原因是可能存在新的O、K抗原，有待于进一步研究。从KP试验结果和血清型关系来看，副溶血弧菌血清型同致病性无相关性。
, 百拇医药
3.2 引物的设计 实验选择TDH基因编码区作为模板，跨度为360 bp。在编码区TDH基因家族各成员间有着高度的同源性，相似率达95%以上。上游引物与tdh2仅在5′端有一个碱基的错配，同其他拷贝的TDH基因完全互补。下游引物同所有拷贝的TDH基因完全互补。引物经基因库检索证明同其他病原体基因组无交叉同源性，是TDH基因特异的。实验中有1株KP弱阳性及1株KP阴性菌亦携带TDH基因，但无明显的溶血活性，原因可能是目前的体外培养条件不利于TDH进行有效的转录或翻译，有待进一步研究。
3.3 特异性寡核苷酸探针的设计 实验所合成的探针位于TDH基因的编码区，是在tdh2基础上设计的，探针同tdh1、tdh2完全互补，同其他拷贝的TDH基因都存在一定的错配，因tdh1和tdh2基因是KP阳性菌所携带的，故本文所建立的克隆杂交法可作为检测KP阳性副溶血弧菌的一种新方法。
, 百拇医药
3.4 TDH基因检测的意义 TDH基因的检测能够帮助了解TDH基因在弧菌中的分布，为TDH致病机理及遗传学研究奠定基础，在临床上可作为鉴定副溶血弧菌产毒株(TDH)快速的初筛试验，为卫生防疫、食品卫生检疫部门提供一种快速筛选食物中毒病原毒素TDH的新方法。
3.5 特异性寡核苷酸探针鉴别KP阳性副溶血弧菌的临床意义 虽然本实验结果是以KP为参照，实验条件的摸索是建立在KP试验基础上，但其较KP试验有下列优点：(1)较KP试验方便，KP试验每块莪萋氏平板只能做1株菌，费力、费时，而探针杂交法能在一张膜上同时对几十甚至上百株细菌作试验，利于流行病学调查；(2)结果稳定、特异性强，不受体外培养条件的影响。
作者简介:王保龙，男，36岁，硕士
参考文献
[1] Nishibuchi M, Kaper JB. Duplication and variation of the thermostable direct haemolysin(tdh) gene in vibro parahaemolyticus. Mol Microbio, 1990，4(1):87～99.
, 百拇医药
[2] Baba K, Shirai H, Terai A, et al. Similarity of the TDH gene-bearing plasmids of Vibrio cholerae non-O1 and Vibrio parahaemolyticus. Microb Pathogea, 1991，10(1):61～70.
[3] Terai A, Shirai H, Yoshida O, et al. Nucleotide sequence of the thermos-table direct haemolysin gene of vibrio mimicus and its evolutiorary relationship with the tdh genes of vibrio parahaemolyticus. FEMS Microbio Lett, 1990，71(2):319～323.
[4] Yamasakl S. The haemolysin similar to the thermostable direct haemolysin of vibrio parahaemolyticus. FEMS Microbio Lett, 1991，80(3):259.
[5] 王保龙，黄尊波.合成特异性寡核苷酸探针检测KP阳性副溶血弧菌.中华医学检验杂志，1994，17(5)：272～273.
收稿日期 1998-12-30, http://www.100md.com
单位：王保龙 安徽省临床检验中心， 安徽 合肥 230001；董辉军 安徽省立医院
关键词：副溶血弧菌；克隆杂交；聚合酶链反应
疾病控制杂志990106
【摘要】 目的 建立快速、敏感、特异和精确的方法检测致病性副溶血弧菌(VP)。方法 在耐热溶血毒素(TDH)结构基因序列的基础上，自行设计探针和引物，应用克隆杂交方法检测30株不同来源的VP，同时对10株不同KP反应的VP DNA行PCR-TDH检测。 结果 30例实验菌株，26例KP阳性株克隆杂交出现阳性信号，其余4例杂交阴性(2例KP弱阳性、2例KP阴性)。用PCR检测的10株VP中，6例KP阳性株TDH基因均阳性，但有1株KP弱阳性和1株KP阴性株也呈TDH基因阳性。PCR阳性结果均用Southern blot法证实。 结论 应用克隆杂交技术检测TDH基因在合适的条件下能有效地鉴别致病性与非致病性VP。PCR检测TDH基因为研究VP的致病机理奠定基础，在临床上可作为一种检测致病性VP的快速敏感的初筛试验。
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【中图分类号】 R378.3； R446 【文献标识码】 A 【文章编号】 1008-6013(1999)01-0016-03
Detection of TDH gene with colony hybridization and PCR
Wang Baolong, Dong Huijun.
Centre of Clinical Laboratory Science of Anhui, Hefei 230001, China
【Abstract】 Objective To establish fast, sensitive and precise methods for detecting Kanagawa phenomenon(KP)-positive vibrio parahaemolyticus(VP). Methods Synthetic oligodeoxyri-bonucleotid was used in the colony hybridization test to examine thermostable direct hemolysim(TDH) gene, and polymerase chain reaction(PCR) was also used to detect TDH gene. Results 30 strains VP including different KP reactions and serotypes were detected with colony hybridization, 26 strains were positive, the others were negative. All the positive strains were in accordence with the traditional KP test, but 2 strains which were weak-positive in KP test were negative. 6 KP-positive strains, 2 KP-negative strains and 2 KP-weak-positive strains were tested with PCR for the TDH gene. All the KP-positive strains were TDH gene positive. At the same time, 1 KP weak-positive strain and 1 KP-negative strain were also gene positive. These PCR positive results were confirmed with Southern blot. Conclusions Under optimal conditions, the probe was capable of detecting KP-positive VP and distinguishing pathogenic VP from inpathogenic VP. Detecting TDH gene by PCR was helpful in understanding the pathogenic mechanism of VP and benefical in quickly screenning pathogenicity VP in clinic, it also increases the sensitivity and specificity.
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【Key words】 vibrio parahaemolyticus(VP); colony hybridization; polymerase chain reaction(PCR)
副溶血弧菌(VP)可引起食物中毒或急性胃肠炎。其致病机理至今尚不明确，目前一般认为该菌产生的热稳定性溶血毒素(TDH)是重要的毒力因子。TDH可在莪萋氏血平板上产生一种特殊的β溶血现象，称作Kanagawa现象(KP阳性)。临床上分离出的副溶血弧菌株几乎都是KP阳性；因此通常认为KP阳性株为产毒株，KP阴性为非产毒株。分子生物学研究证明，所有的KP阳性株都同时携带tdh1和tdh2两种基因[1]，86%的KP弱阳性和16%的KP阴性株携带tdh3和tdh4基因[2]。tdh是一个基因家族，各成员的基因结构有着高度的同源性[3]。本文的引物和探针就是在TDH结构基因序列的基础上设计的[4]。
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1 材料与方法
1.1 菌株来源 30株实验菌株中28株来源于临床标本，2株来源于海洋环境(由上海市卫生防疫站提供)，均经生物化学和盐耐受性试验确定为副溶血弧菌。
1.2 试剂材料 诊断因子血清(O1～O13)和K1～K71由上海市卫生防疫站提供)，Taq DNA多聚酶、γ-32P-ATP、T4多聚核苷酸激酶；480型PCR扩增仪(PE公司产品)，尼龙膜。
1.3 实验方法
1.3.1 Kanagawa(神奈川)试验及血清学分型 Kanagawa试验：按传统方法以KP阳性标准株作阳性对照；血清学分型：采用玻片凝集试验。
, 百拇医药 1.3.2 细菌DNA制备 参照文献2介绍的方法提取和制备。
1.3.3 PCR检测TDH基因方法的建立 按文献1报道的基因序列自行设计引物：上游引物：5′-GAGGTCTCTGACTTTTGGAC-3′；下游引物：5′-TTGGATATACACATTACCAA-3′(由中科院上海细胞所合成)。PCR扩增反应：各步温度及时间为变性94℃ 1 min，退火55℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，40个循环，最后一个循环在72℃维持5 min。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳：电压为220 V，电流为200 mA，琼脂浓度为1.8%。Southern杂交：将电泳后的琼脂糖凝胶经变性、转移和固定等处理后，做杂交试验。45℃杂交过夜，用2×ssc 55℃洗膜30 min，空气晾干，-80℃曝光过夜，放射自显影。寡核苷酸探针序列为5′-GAAACTCCAGAATATTTTGT用γ-32P-ATP 5′末端法标记。特异性及敏感性试验：分别采用正常人白细胞DNA、大肠埃希氏菌DNA，创伤弧菌DNA及阳性对照株20564(O13∶K65)DNA和空白对照进行了扩增试验，用以考察特异性。将纯化的KP阳性标准20564(O13∶K65)DNA用双蒸水进行系列稀释，然后在100 μl标准PCR反应体系中分别加入DNA；1 μg、10-1 μg、10-2 μg、10-3 μg、10-4 μg、10-5 μg，用上述同样的条件扩增40个循环，用来测定敏感度。
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1.3.4 合成特异性寡核苷酸探针检测KP阳性副溶血弧菌 (1)菌苔在尼龙膜上印迹：将30株副溶血弧菌及大肠埃希氏菌、链球菌、清水弧菌、河弧菌各1株点种于LB平板上37℃培养过夜，再作印迹、变性和固定等处理。(2)探针的合成、标记与纯化：采用亚磷酸酰胺法在App Lied Biosystem 381A DNA合成仪上合成，序列为5′-GCATATGAGAGTGGTAGTGG-3′。用γ-32P-ATP 5′末端法标记，G-50 Sephadex层析法纯化。(3)点杂交：将制备好的尼龙膜放在6×ssc内浸泡5 min后取出，45℃预杂交3 h，然后更换杂交液(预杂交液+标记的探针)45℃杂交过液。取出膜用6×ssc 55℃洗涤1 h，更换新鲜的6×ssc， 55℃再洗1 h，然后用2×ssc室温浸泡5 min，空气中晾干，-80℃曝光放射自显影[5]。
2 结果
2.1 Kanagawa试验及血清学分型 30株副溶血弧菌分属不同的血清型。1株未检出K抗原，1株未检出O抗原，2株KP弱阳性，2株KP阴性，余26株均为KP阳性。
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2.2 PCR检测TDH基因
2.2.1 PCR扩增产物琼脂糖电泳及Southern杂交 实验对6株KP阳性，2株KP弱阳性及2株KP阴性共10株副溶血弧菌DNA进行了TDH基因检测，其中6株副溶血弧菌KP阳性菌扩增产物均出现360 bp的条带，长度与设计的目的基因片断相同，1例KP弱阳性和1例KP阴性株亦出现360 bp的扩增条带。上述8条PCR扩增阳性条带Southern杂交均出现阳性信号，表明有8株副溶血弧菌携带TDH基因(图1、图2)。
图1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳条带
2、3为KP阴性菌，6、7为KP弱阳性菌，其余均为KP阳性菌，11为阳性对照，12为阴性对照。
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图2 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳条带Southern杂交
8条360 bp扩增条带杂交信号均呈阳性反应
2.2.2 敏感性及特异性试验 在100 μl标准PCR反应体系中，PCR检测TDH基因的敏感性达10-6 μg。除KP阳性标准株20564 DNA出现360 bp扩增电泳条带外，大肠埃希氏菌、创伤弧菌及人白细胞DNA均未见扩增条带，表明设计的引物是TDH基因特异的。
2.3 特异性寡核苷酸探针点杂交 55℃为最合适的洗膜温度。在此条件下，26株KP阳性菌均杂交信号阳性，2例KP弱阳性和2例KP阴性菌杂交信号均阴性，其余4株用来考察试验特异性的非副溶血弧菌杂交信号也均阴性。结果表明，合成的寡核苷酸探针具有特异性，能够作为一种新的检测KP阳性副溶血弧菌的方法(表1)。
表1 寡核苷酸探针克隆杂交结果 菌株数
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洗涤信号温度(℃)
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3 讨论
3.1 30株副溶血弧菌分属不同的血清型，有1株未检出K抗原，1株未检出O抗原，原因是可能存在新的O、K抗原，有待于进一步研究。从KP试验结果和血清型关系来看，副溶血弧菌血清型同致病性无相关性。
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3.2 引物的设计 实验选择TDH基因编码区作为模板，跨度为360 bp。在编码区TDH基因家族各成员间有着高度的同源性，相似率达95%以上。上游引物与tdh2仅在5′端有一个碱基的错配，同其他拷贝的TDH基因完全互补。下游引物同所有拷贝的TDH基因完全互补。引物经基因库检索证明同其他病原体基因组无交叉同源性，是TDH基因特异的。实验中有1株KP弱阳性及1株KP阴性菌亦携带TDH基因，但无明显的溶血活性，原因可能是目前的体外培养条件不利于TDH进行有效的转录或翻译，有待进一步研究。
3.3 特异性寡核苷酸探针的设计 实验所合成的探针位于TDH基因的编码区，是在tdh2基础上设计的，探针同tdh1、tdh2完全互补，同其他拷贝的TDH基因都存在一定的错配，因tdh1和tdh2基因是KP阳性菌所携带的，故本文所建立的克隆杂交法可作为检测KP阳性副溶血弧菌的一种新方法。
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3.4 TDH基因检测的意义 TDH基因的检测能够帮助了解TDH基因在弧菌中的分布，为TDH致病机理及遗传学研究奠定基础，在临床上可作为鉴定副溶血弧菌产毒株(TDH)快速的初筛试验，为卫生防疫、食品卫生检疫部门提供一种快速筛选食物中毒病原毒素TDH的新方法。
3.5 特异性寡核苷酸探针鉴别KP阳性副溶血弧菌的临床意义 虽然本实验结果是以KP为参照，实验条件的摸索是建立在KP试验基础上，但其较KP试验有下列优点：(1)较KP试验方便，KP试验每块莪萋氏平板只能做1株菌，费力、费时，而探针杂交法能在一张膜上同时对几十甚至上百株细菌作试验，利于流行病学调查；(2)结果稳定、特异性强，不受体外培养条件的影响。
作者简介:王保龙，男，36岁，硕士
参考文献
[1] Nishibuchi M, Kaper JB. Duplication and variation of the thermostable direct haemolysin(tdh) gene in vibro parahaemolyticus. Mol Microbio, 1990，4(1):87～99.
, 百拇医药
[2] Baba K, Shirai H, Terai A, et al. Similarity of the TDH gene-bearing plasmids of Vibrio cholerae non-O1 and Vibrio parahaemolyticus. Microb Pathogea, 1991，10(1):61～70.
[3] Terai A, Shirai H, Yoshida O, et al. Nucleotide sequence of the thermos-table direct haemolysin gene of vibrio mimicus and its evolutiorary relationship with the tdh genes of vibrio parahaemolyticus. FEMS Microbio Lett, 1990，71(2):319～323.
[4] Yamasakl S. The haemolysin similar to the thermostable direct haemolysin of vibrio parahaemolyticus. FEMS Microbio Lett, 1991，80(3):259.
[5] 王保龙，黄尊波.合成特异性寡核苷酸探针检测KP阳性副溶血弧菌.中华医学检验杂志，1994，17(5)：272～273.
收稿日期 1998-12-30, http://www.100md.com