新城鸡瘟病毒激活巨噬细胞释放一氧化氮及对肝癌瘤株细胞毒活性的研究*
作者：白莲花 刘倩 李娟 陈乃玲
单位：北京军区总医院全军肝病研究所，北京 100700
关键词：新城鸡瘟病毒；巨噬细胞；一氧化氮；肝癌
军医进修学院学报990116 摘要 目的：分析新城鸡瘟病毒Lossta系(NDV-L)对小鼠腹腔巨噬细胞是否具有激活作用并对其机制进行探讨。方法：采用电镜、氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)和Griess方法。结果：①NDV-L与小鼠腹腔巨噬细胞(PEM)作用 24h后，光镜和扫描镜均显示细胞明显增大和伪足伸出；②被NDV-L作用的PEMф与3H-标记的H22靶细胞作用 24h后，发现具有明显的细胞毒杀伤效应，且该效应与阳性对照组〔卡介苗、细菌内毒素联合激活的PEMф(BCG-LPS-PEMф)〕的杀伤效应接近；③收集NDV-L与PEMф作用 24h上清进行检测，发现一氧化氮(NO)分泌量增高。结论：被NDV-L激活的PEMф对肿瘤细胞的细胞毒效应与其分泌NO有关。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 735.7
The experimental study of the cytotoxicity ofmurine peritoneal elicitmacrophage infected by newcastledisease virus strain
Bai Lianhua, Liuqian, Lijuan, Chen Nailing
(Institute of Liverdisease Beijing Armygeneralhospital of PLA, Beijing 100700)
Abstract Objective：The cytotoxicity ofmurine peritoneal elicitmacrophage(PEMф) infected by NDV-L was studied in vitro.Methods:This study was carried out by electronicmicroscope, 3H-TdR andgriess assay.Results：(1)Under the opticalmicroscope and scan electronicmicroscope, the shape of the PEMф changedmarkedly comparing with the controlgroup, while the NDV-L infected PEMф for 24hours;(2)When the activated PEMф infected by NDV-L acted onh22 and P815 tumor cells, a significant tumorcidal effect was found and the cytotoxicity was nearly the same as that in the positivegroup (BCG-LPS-PEMф);(3)while infectingmurine PEMф for 24hours, NDV-L could induce the PEMф releasing nitric oxide (NO).Conclusion:The PEMф activated by NDV-Lmay killh22 and P815 tumor cells and this function seems to be related with NO releasing.
, 百拇医药
Key words newcastledisease virus;Macrophage;nitric oxide;liver cancer
恶性肿瘤的生物学疗法(Biotherapy)已被认为是治疗恶性肿瘤的第四大模式〔1〕，而巨噬细胞在肿瘤生物学治疗中的作用也日益受到关注。但是未经激活的巨噬细胞抗瘤作用极弱。虽然近年来应用胞壁酰三肽磷酯酰乙醇胺(MTP-PE)等激活剂，大大提高了其激活效能〔2〕，但仍存在毒副作用大，体内半衰期短、制作复杂和不易全身用药等问题〔3〕。为了解决这些问题，我们选择新城鸡瘟病毒Losota系(Newcastledisease Virus Losota Strain, NDV-L)激活巨噬细胞(Peritoneal Elicitmacrophage, PEMф)，观察了NDV-L激活的PEMф对肝癌瘤株(H22)靶细胞的杀伤效应，并对其部分机制进行了探讨。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 动物 615 近交系小鼠，体重 18～22g,8～10 周龄，引自中国医学科学院实验动物中心，于本室饲养、繁殖。
1.2 肿瘤细胞系 H22为小鼠腹水型肝癌细胞系。引自大连医科大学病理教研室。于本室长期保种、传代，冻存使用；P815小鼠肥大细胞瘤，来源同上。
1.3 病毒株 NDV-L血凝效价HAU：1：1280，半数鸡胚感染量EID50为 10-8/0.2ml，引自中国兽医药品监察所，在本室常规培养，扩增、鉴定、定量。
1.4 主要药品和试剂 硫乙醇酸钠培养基(北京红星生物化学制品厂，批号 930424)；BCG(卡介苗，卫生部上海生物制品研究所，批号9005184)；四唑盐(MTT，Chmico)；3H-TdR(中国原子能科学研究所，批号921023，37MBq/ml，比度 740gBq/mmol)；亚硝酸钠(北京刘李店化工厂)；对氨基苯磺酰胺(北京东四化学试剂商店)；双氢二乙胺(NED，北京芳草医药化工研制公司)；Griess试剂(1%对氨基苯磺酰胺和 1% NED1∶1 混合，用前新鲜配制)；LPS(细菌内毒素，和光纯药工业株式会社)。
, 百拇医药
1.5 小鼠腹腔渗出性巨噬细胞(PEMф)的制备 主要参照文献〔4〕。腹腔注射无菌 3% 硫乙醇醋钠(TG)培养基 3ml，3d后用Hank液冲洗腹腔，收集PEMф，洗涤后加入RPMI1640 培养基于 37°C，5% CO2培养箱中贴壁 2h，洗去非贴壁细胞，经非特异性酯酶染色后，确定 95% 以上为巨噬细胞。
1.6 小鼠PEMф与NDV-L作用后的形态学 将小鼠PEMф调至5×106/ml与NDV-L(EID5010-8/0.2ml)作用 24h后，在光镜下观察，而后用 2.5% 戌二醛固定，制成扫描电镜标本，在扫描电镜下观察。
1.7 NDV-L对小鼠PEMф感染性测定 辣根过氧化物酶(HRP)间接染色法〔5〕。简单过程为：将感染NDV-L不同时间的PEMф离心涂片，并以非感染NDV-L的PEMф作为对照。加兔抗NDV-L抗血清(效价为：1∶32)，37°C温合中温育 30min后放入 4°C冰箱过夜。次日洗净后加入HRP标记的羊抗兔IgG抗体(1∶500 稀释)，放入 37°C温合中温育 1h，洗净后加入 3，3-二氨基联苯胺底物(DAB)，室温显色 15min后在光镜下计算染色阳性细胞百分率。
, 百拇医药
1.8 NDV-L诱导小鼠)PEMф释放NO的制备 收集正常 615近交系小鼠PEMф，贴壁后感染NDV-L，剂量为 0.2ml(EID5010-8)，37°C吸附 4h后弃病毒液，Hanks液洗 3 次，加无血清培养液，37°C，5%CO2孵育培养 24h，收集上清于-30°C贮存备用。
1.9 BCG-LPS诱导小鼠PEMф释放NO的制备 用 2×106UBCG腹腔注射 615 系小鼠，14d 后收集PEMф，调细胞浓度为 5×106/ml，37°C，5%CO2孵育箱贴壁 2h，除去未贴壁细胞，用Hanks液洗 3 次，加LPS(10ug/ml)的无血清培养液，37°C，5%CO2孵育箱中 2h，收集上清液于-30°C贮存备用。
1.10 NO检测方法 用平底 96 孔塑料板(Sigma公司)设空白对照孔加蒸馏水 0.1ml；待检样品孔 0.1ml；阳性对照孔 0.1ml(加BCG-LPS-PEMф上清)；标准孔各 0.1ml(将 100μmol/L亚硫酸钠标准液稀释成 320μmol/L、160μmol/L、80μmol/L、40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L和 5μmol/L)；每份样品三个复孔，各孔内加入Griess试剂 0.1ml，室温显色 10min，在酶联仪上测OD值，波长为 570 nm。以标准品值为纵坐标，标准品含量为横坐标绘制标准曲线，根据被测样品的值从标准曲线上查出样品中亚硝酸钠的含量，即可推算出NO水平。
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1.11 NDV-L感染的PEMф的细胞毒活性实验 主要参照文献〔6〕方法。将经NDV-L感染 24h的PEMф调到 2×106个/ml，将用3H-TdR标记的H22靶细胞和P815靶细胞调到 1×105/ml，按效靶比为 20∶1 加样，各加 100ml/孔到 96 孔板中，置 37°C，5%CO2培养箱中培养 48h，用多头细胞收集器将细胞收集到 49 型滤纸片上，再用液体闪烁计数仪测其放射量(CPM值)，每份样品三个复孔，并与阴性对照组(单纯NDV-L，PEMф组)和阳性对照组(BCG-LPS-PEMф)进行对照，按下列公式计算PEMф的杀瘤活性。
Mфa：为激活的Mф Mфb：为未激活的Mф
2 结果
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2.1 NDV-L吸附于小鼠PEMф的表面并进入PEMф内 小鼠PEMф在体外受NDV-L感染不同时间后，用HRP间接酶免疫法和透射电镜观察。发现NDV-L感染PEMф 4h后即可稳定地吸附在细胞表面，当感染 24h后，不在PEMф表面和细胞浆内均有NDV-L颗粒。
2.2 NDV-L感染的PEMф形态学特征 NDV-L与PEMф作用 24～48h后，光镜下显示细胞明显增大，多数细胞伸出伪足，与阳性对照组BCG-LPS-PEMф的形态相似。而未经NDV-L感染的PEMф均为圆形，只有少量细胞伸出伪足；扫描电镜显示，经NDV-L感染 24h的PEMф体积变大，边缘粗糙，有伪足，而未经NDV-L感染的PEMф边缘光滑，仅呈小棘状突起，两者在形态学上明显不同。且NDV-L-PEMф形态与阳性对照组BCG-LPS-PEMф的也颇相似(附图)。
附图 不同组别小鼠PEMф培养 24h扫描电镜形态
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(×4.00K，40kV)
左：PEMф培养 24h；
中：NDV-L与PEMф作用 24h；
右：BCG-LPS-PEMф
2.3 NDV-L感染的小鼠PEMф对肝癌细胞H22的体外杀伤效应 将被NDV-L感染 24h的PEMф与3H-TdR标记的同基因型肝癌细胞(H22)和异基因型瘤细胞(P815)在 37°C，5%CO2条件下共同培育 24h，发现NDV-L-PEMф对该两种癌细胞杀伤效应强于对照组，并与BCG-LPS-PEMф的杀伤效应接近。
2.4 NDV-L诱导小鼠PEMф释放一氧化氮(NO) 用NDV-L感染小鼠PEMф 24h后，收集上清，发现NDV-L能诱导小鼠PEMф释放NO分子(50μM/L)，且释放量与BCG-LPS-PEMф组的相当(56μmol/L)，并随着NDV-L滴度的增加(10-6～10-9)而增加(12～47μmol/L；但当NDV-L达到一定滴度时(10-6～10-9)，NO分子释放量维持在相对稳定水平(平均为 52μmol/L)，直到滴度增加到10-11时，NO分子释放量下降(9μmol/L)。
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3 讨论
巨噬细胞与肿瘤发生发展的关系目前受到关注〔7〕，更由于被激活的巨噬细胞才具备抗瘤活性的特点，因此，巨噬细胞激活剂的选择显得尤为重要。本文选择的NDV-L是副粘病毒的弱毒株，它依赖于其表面的植物血凝素和神经氨酸酶(HA)与PEMф吸附并以芽生方式释放于细胞外。本实验发现，当NDV-L感染PEMф 24h后，①形态学变化：光镜和扫描电镜均显示伪足伸出多于对照组，说明小鼠PEMф被NDV-L感染后活动增加。②被NDV-L感染的PEMф释放NO分子，且释放量与NDV-L滴度呈正比；当NDV-L滴度达到一定浓度时(EID5010-6～10-9/0.2ml)，PEMф的NO释放量不再增加，并维持在一个相对稳定的水平(49～56μmol/L)。众所周知，NO分子合成增多是巨噬细胞被激活的重要标志。③被NDV-L感染的PEMф具〔8〕有细胞毒活性。NDV-L感染 24h的PEMф对小鼠肝癌细胞系(H22)和小鼠肥大细胞瘤(P815)的杀伤效应明显强于非NDV-L感染的巨噬细胞对照组，并于BCG-LPS联合作用的巨噬细胞阳性对照组杀伤效应接近。因此，本实验以NDV-L作为巨噬细胞激活剂从形态学，细胞毒活性和释放NO分子三个方面给予证明，而NO的含量增高不仅为探讨NDV-L作用的PEMф抑瘤机制提供了实验依据，而且也为病毒应用于肿瘤的生物治疗提供了探索方向。
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* “九五”军队医药卫生科研基金资助项目，批准号 96D011
参考文献
[1]Monaco JJA.Molecularmodel ofmHC Class-I-restricted antigen processing.Immunology, 1992，13∶173
[2]Fidler IJ.Systemicmacrophage activation with liposomeentrapped immunomodulators for therapy of cancermetastatic.Forum Immunology, 1995，1∶199
[3]Fidler IJ.Macrophages andmetastasis-A Biological approach to cancer therapy.Cancer Res, 1985，45∶4714
, 百拇医药
[4]ManneldN.Macrophages as a source of tumoricidal activity.Infect Immun, 1980，30(2)∶523
[5]杨景山主编.医学细胞化学与细胞生物技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，北京，1993.103～104
[6]吴厚生，谢 琪，姜小玲等.3H-TdR法对肿瘤细胞杀伤活性的研究.上海免疫学杂志，1987，7∶230
[7]王海杰，谭玉珍，大桥俊夫.巨噬细胞的NO(Nitric Oxide)合成及其意义.免疫学杂志，1995，11∶265
[8]Angelini A.A study of interactions amongmarkers ofmacrophage function inmetastatic solid tumor: neopterin levels in relation to those of tumor necrosis factor-alpha and of soluble interleukin-2 receptor.J Biol Regulhomeost Agents, 1994，8∶32
(1998—09—04收稿，1998—10—05修回), http://www.100md.com
单位：北京军区总医院全军肝病研究所，北京 100700
关键词：新城鸡瘟病毒；巨噬细胞；一氧化氮；肝癌
军医进修学院学报990116 摘要 目的：分析新城鸡瘟病毒Lossta系(NDV-L)对小鼠腹腔巨噬细胞是否具有激活作用并对其机制进行探讨。方法：采用电镜、氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)和Griess方法。结果：①NDV-L与小鼠腹腔巨噬细胞(PEM)作用 24h后，光镜和扫描镜均显示细胞明显增大和伪足伸出；②被NDV-L作用的PEMф与3H-标记的H22靶细胞作用 24h后，发现具有明显的细胞毒杀伤效应，且该效应与阳性对照组〔卡介苗、细菌内毒素联合激活的PEMф(BCG-LPS-PEMф)〕的杀伤效应接近；③收集NDV-L与PEMф作用 24h上清进行检测，发现一氧化氮(NO)分泌量增高。结论：被NDV-L激活的PEMф对肿瘤细胞的细胞毒效应与其分泌NO有关。
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中国图书资料分类法分类号 R 735.7
The experimental study of the cytotoxicity ofmurine peritoneal elicitmacrophage infected by newcastledisease virus strain
Bai Lianhua, Liuqian, Lijuan, Chen Nailing
(Institute of Liverdisease Beijing Armygeneralhospital of PLA, Beijing 100700)
Abstract Objective：The cytotoxicity ofmurine peritoneal elicitmacrophage(PEMф) infected by NDV-L was studied in vitro.Methods:This study was carried out by electronicmicroscope, 3H-TdR andgriess assay.Results：(1)Under the opticalmicroscope and scan electronicmicroscope, the shape of the PEMф changedmarkedly comparing with the controlgroup, while the NDV-L infected PEMф for 24hours;(2)When the activated PEMф infected by NDV-L acted onh22 and P815 tumor cells, a significant tumorcidal effect was found and the cytotoxicity was nearly the same as that in the positivegroup (BCG-LPS-PEMф);(3)while infectingmurine PEMф for 24hours, NDV-L could induce the PEMф releasing nitric oxide (NO).Conclusion:The PEMф activated by NDV-Lmay killh22 and P815 tumor cells and this function seems to be related with NO releasing.
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Key words newcastledisease virus;Macrophage;nitric oxide;liver cancer
恶性肿瘤的生物学疗法(Biotherapy)已被认为是治疗恶性肿瘤的第四大模式〔1〕，而巨噬细胞在肿瘤生物学治疗中的作用也日益受到关注。但是未经激活的巨噬细胞抗瘤作用极弱。虽然近年来应用胞壁酰三肽磷酯酰乙醇胺(MTP-PE)等激活剂，大大提高了其激活效能〔2〕，但仍存在毒副作用大，体内半衰期短、制作复杂和不易全身用药等问题〔3〕。为了解决这些问题，我们选择新城鸡瘟病毒Losota系(Newcastledisease Virus Losota Strain, NDV-L)激活巨噬细胞(Peritoneal Elicitmacrophage, PEMф)，观察了NDV-L激活的PEMф对肝癌瘤株(H22)靶细胞的杀伤效应，并对其部分机制进行了探讨。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 动物 615 近交系小鼠，体重 18～22g,8～10 周龄，引自中国医学科学院实验动物中心，于本室饲养、繁殖。
1.2 肿瘤细胞系 H22为小鼠腹水型肝癌细胞系。引自大连医科大学病理教研室。于本室长期保种、传代，冻存使用；P815小鼠肥大细胞瘤，来源同上。
1.3 病毒株 NDV-L血凝效价HAU：1：1280，半数鸡胚感染量EID50为 10-8/0.2ml，引自中国兽医药品监察所，在本室常规培养，扩增、鉴定、定量。
1.4 主要药品和试剂 硫乙醇酸钠培养基(北京红星生物化学制品厂，批号 930424)；BCG(卡介苗，卫生部上海生物制品研究所，批号9005184)；四唑盐(MTT，Chmico)；3H-TdR(中国原子能科学研究所，批号921023，37MBq/ml，比度 740gBq/mmol)；亚硝酸钠(北京刘李店化工厂)；对氨基苯磺酰胺(北京东四化学试剂商店)；双氢二乙胺(NED，北京芳草医药化工研制公司)；Griess试剂(1%对氨基苯磺酰胺和 1% NED1∶1 混合，用前新鲜配制)；LPS(细菌内毒素，和光纯药工业株式会社)。
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1.5 小鼠腹腔渗出性巨噬细胞(PEMф)的制备 主要参照文献〔4〕。腹腔注射无菌 3% 硫乙醇醋钠(TG)培养基 3ml，3d后用Hank液冲洗腹腔，收集PEMф，洗涤后加入RPMI1640 培养基于 37°C，5% CO2培养箱中贴壁 2h，洗去非贴壁细胞，经非特异性酯酶染色后，确定 95% 以上为巨噬细胞。
1.6 小鼠PEMф与NDV-L作用后的形态学 将小鼠PEMф调至5×106/ml与NDV-L(EID5010-8/0.2ml)作用 24h后，在光镜下观察，而后用 2.5% 戌二醛固定，制成扫描电镜标本，在扫描电镜下观察。
1.7 NDV-L对小鼠PEMф感染性测定 辣根过氧化物酶(HRP)间接染色法〔5〕。简单过程为：将感染NDV-L不同时间的PEMф离心涂片，并以非感染NDV-L的PEMф作为对照。加兔抗NDV-L抗血清(效价为：1∶32)，37°C温合中温育 30min后放入 4°C冰箱过夜。次日洗净后加入HRP标记的羊抗兔IgG抗体(1∶500 稀释)，放入 37°C温合中温育 1h，洗净后加入 3，3-二氨基联苯胺底物(DAB)，室温显色 15min后在光镜下计算染色阳性细胞百分率。
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1.8 NDV-L诱导小鼠)PEMф释放NO的制备 收集正常 615近交系小鼠PEMф，贴壁后感染NDV-L，剂量为 0.2ml(EID5010-8)，37°C吸附 4h后弃病毒液，Hanks液洗 3 次，加无血清培养液，37°C，5%CO2孵育培养 24h，收集上清于-30°C贮存备用。
1.9 BCG-LPS诱导小鼠PEMф释放NO的制备 用 2×106UBCG腹腔注射 615 系小鼠，14d 后收集PEMф，调细胞浓度为 5×106/ml，37°C，5%CO2孵育箱贴壁 2h，除去未贴壁细胞，用Hanks液洗 3 次，加LPS(10ug/ml)的无血清培养液，37°C，5%CO2孵育箱中 2h，收集上清液于-30°C贮存备用。
1.10 NO检测方法 用平底 96 孔塑料板(Sigma公司)设空白对照孔加蒸馏水 0.1ml；待检样品孔 0.1ml；阳性对照孔 0.1ml(加BCG-LPS-PEMф上清)；标准孔各 0.1ml(将 100μmol/L亚硫酸钠标准液稀释成 320μmol/L、160μmol/L、80μmol/L、40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L和 5μmol/L)；每份样品三个复孔，各孔内加入Griess试剂 0.1ml，室温显色 10min，在酶联仪上测OD值，波长为 570 nm。以标准品值为纵坐标，标准品含量为横坐标绘制标准曲线，根据被测样品的值从标准曲线上查出样品中亚硝酸钠的含量，即可推算出NO水平。
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1.11 NDV-L感染的PEMф的细胞毒活性实验 主要参照文献〔6〕方法。将经NDV-L感染 24h的PEMф调到 2×106个/ml，将用3H-TdR标记的H22靶细胞和P815靶细胞调到 1×105/ml，按效靶比为 20∶1 加样，各加 100ml/孔到 96 孔板中，置 37°C，5%CO2培养箱中培养 48h，用多头细胞收集器将细胞收集到 49 型滤纸片上，再用液体闪烁计数仪测其放射量(CPM值)，每份样品三个复孔，并与阴性对照组(单纯NDV-L，PEMф组)和阳性对照组(BCG-LPS-PEMф)进行对照，按下列公式计算PEMф的杀瘤活性。
Mфa：为激活的Mф Mфb：为未激活的Mф
2 结果
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2.1 NDV-L吸附于小鼠PEMф的表面并进入PEMф内 小鼠PEMф在体外受NDV-L感染不同时间后，用HRP间接酶免疫法和透射电镜观察。发现NDV-L感染PEMф 4h后即可稳定地吸附在细胞表面，当感染 24h后，不在PEMф表面和细胞浆内均有NDV-L颗粒。
2.2 NDV-L感染的PEMф形态学特征 NDV-L与PEMф作用 24～48h后，光镜下显示细胞明显增大，多数细胞伸出伪足，与阳性对照组BCG-LPS-PEMф的形态相似。而未经NDV-L感染的PEMф均为圆形，只有少量细胞伸出伪足；扫描电镜显示，经NDV-L感染 24h的PEMф体积变大，边缘粗糙，有伪足，而未经NDV-L感染的PEMф边缘光滑，仅呈小棘状突起，两者在形态学上明显不同。且NDV-L-PEMф形态与阳性对照组BCG-LPS-PEMф的也颇相似(附图)。
附图 不同组别小鼠PEMф培养 24h扫描电镜形态
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(×4.00K，40kV)
左：PEMф培养 24h；
中：NDV-L与PEMф作用 24h；
右：BCG-LPS-PEMф
2.3 NDV-L感染的小鼠PEMф对肝癌细胞H22的体外杀伤效应 将被NDV-L感染 24h的PEMф与3H-TdR标记的同基因型肝癌细胞(H22)和异基因型瘤细胞(P815)在 37°C，5%CO2条件下共同培育 24h，发现NDV-L-PEMф对该两种癌细胞杀伤效应强于对照组，并与BCG-LPS-PEMф的杀伤效应接近。
2.4 NDV-L诱导小鼠PEMф释放一氧化氮(NO) 用NDV-L感染小鼠PEMф 24h后，收集上清，发现NDV-L能诱导小鼠PEMф释放NO分子(50μM/L)，且释放量与BCG-LPS-PEMф组的相当(56μmol/L)，并随着NDV-L滴度的增加(10-6～10-9)而增加(12～47μmol/L；但当NDV-L达到一定滴度时(10-6～10-9)，NO分子释放量维持在相对稳定水平(平均为 52μmol/L)，直到滴度增加到10-11时，NO分子释放量下降(9μmol/L)。
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3 讨论
巨噬细胞与肿瘤发生发展的关系目前受到关注〔7〕，更由于被激活的巨噬细胞才具备抗瘤活性的特点，因此，巨噬细胞激活剂的选择显得尤为重要。本文选择的NDV-L是副粘病毒的弱毒株，它依赖于其表面的植物血凝素和神经氨酸酶(HA)与PEMф吸附并以芽生方式释放于细胞外。本实验发现，当NDV-L感染PEMф 24h后，①形态学变化：光镜和扫描电镜均显示伪足伸出多于对照组，说明小鼠PEMф被NDV-L感染后活动增加。②被NDV-L感染的PEMф释放NO分子，且释放量与NDV-L滴度呈正比；当NDV-L滴度达到一定浓度时(EID5010-6～10-9/0.2ml)，PEMф的NO释放量不再增加，并维持在一个相对稳定的水平(49～56μmol/L)。众所周知，NO分子合成增多是巨噬细胞被激活的重要标志。③被NDV-L感染的PEMф具〔8〕有细胞毒活性。NDV-L感染 24h的PEMф对小鼠肝癌细胞系(H22)和小鼠肥大细胞瘤(P815)的杀伤效应明显强于非NDV-L感染的巨噬细胞对照组，并于BCG-LPS联合作用的巨噬细胞阳性对照组杀伤效应接近。因此，本实验以NDV-L作为巨噬细胞激活剂从形态学，细胞毒活性和释放NO分子三个方面给予证明，而NO的含量增高不仅为探讨NDV-L作用的PEMф抑瘤机制提供了实验依据，而且也为病毒应用于肿瘤的生物治疗提供了探索方向。
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* “九五”军队医药卫生科研基金资助项目，批准号 96D011
参考文献
[1]Monaco JJA.Molecularmodel ofmHC Class-I-restricted antigen processing.Immunology, 1992，13∶173
[2]Fidler IJ.Systemicmacrophage activation with liposomeentrapped immunomodulators for therapy of cancermetastatic.Forum Immunology, 1995，1∶199
[3]Fidler IJ.Macrophages andmetastasis-A Biological approach to cancer therapy.Cancer Res, 1985，45∶4714
, 百拇医药
[4]ManneldN.Macrophages as a source of tumoricidal activity.Infect Immun, 1980，30(2)∶523
[5]杨景山主编.医学细胞化学与细胞生物技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，北京，1993.103～104
[6]吴厚生，谢 琪，姜小玲等.3H-TdR法对肿瘤细胞杀伤活性的研究.上海免疫学杂志，1987，7∶230
[7]王海杰，谭玉珍，大桥俊夫.巨噬细胞的NO(Nitric Oxide)合成及其意义.免疫学杂志，1995，11∶265
[8]Angelini A.A study of interactions amongmarkers ofmacrophage function inmetastatic solid tumor: neopterin levels in relation to those of tumor necrosis factor-alpha and of soluble interleukin-2 receptor.J Biol Regulhomeost Agents, 1994，8∶32
(1998—09—04收稿，1998—10—05修回), http://www.100md.com