外周血增殖的T细胞CD28分子表达和自身反应性*
作者：陈钰 张磊 杨舸
单位：陈钰 张磊：解放军总医院免疫学教研室，北京 100853；杨舸：解放军总医院口腔科，北京 100853
关键词：外周T细胞；CD28；分子；自身免疫应答
外周血增殖的T细胞CD28分子表达和自身反应性 摘要 目的：SEB诱导增殖的外周血T细胞是否具有正常T细胞的功能。方法：用超抗原刺激淋巴细胞生长；用流式细胞测定技术检查细胞表面CD4，CD8，CD28，T CD16的抗原表达量；加入同源，异源抗原检查自身反应性。结果：SEB能诱导外周血CD4+T细胞的增殖。随CD4+T细胞的增加，CD28分子表达上升。外周增殖的CD4+T细胞与胸腺内分化的T细胞相同，97% 以上的CD4+T细胞都表达CD28分子。但对CD16阳性的抗原提呈细胞的依赖性下降，并显示对自身抗原的识别能力增强。结论：外周活化的CD4+T细胞与胸腺内分化的CD4+T细胞功能不同。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 392.1
CD28molecular expression and autoimmunity in human peripheral blood T cells activation by SEB
Chen Yu, Zhang Lei, Yong Ge
(Department of Immunology, Institute of Clinicalmedicine, General Hospital of PLA, Beijing 100853)
Abstract Objective：We examined the characteristics of human peripheral blood T cells activation by superantigen-B(SEB), and try to know if the proliferous T cells are as same as entrothymic T cells.Methods:We analyzed CD4, CD8, CD16 and CD28molecular expression and autoimmunity of proliferous T cells by flow cytometry and cell culture. Results：Most of CD4+ T cells expressed CD28molecular The CD4+CD8+T cells aredifferent from extrothymic T cells. Thedependence for T cells to APC exhibiteddecrease and showed autoimmunity against to isogenous antigen.Conclusion:The function of CD4+T cells activation in peripheral blood aredifferent from the function of extrothymic T cells.
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Key words Peripheral T cell CD28 autoimmunity
免疫学研究的中心问题是机体的免疫系统如何识别“自己”与“非己”。能够识别“自己”与“非己”的最重要的免疫细胞是T淋巴细胞。T细胞是在胸腺内发育成熟，参与全身循环〔1〕。由于免疫耐受机制的存在，免疫系统对自身物质不进行攻击。但是，近年来发现很多条件能破坏自身免疫耐受机制，如由于胸腺内自身反应性T细胞没有完全被去除；由于克隆无知(Clonal ignorance)状态的解除，自身反应性T细胞识别自己抗原而被活化。同时共刺激因子不断表达，自身抗原不断提呈，致使自身免疫耐受机制崩溃；由于局部高浓度细胞因子的存在，细胞因子解除了T细胞对自身抗原的免疫不反应(Anergy)，以及由于Fas-FasL的参与，程序性细胞凋亡(Apop-
tosis)机能异常等等〔2，3〕。T细胞识别抗原至少需要两种信号，即由TcR介导的抗原特异性信号，和共刺激信号。已经知道在体外缺乏共刺激信号可使T细胞对抗原的不识别，导致免疫不反应〔4，5〕。目前发现T细胞表面的CD28 分子识别抗原提呈细胞(APC)上的B7-1(CD80)，和B7-2(CD86)是细胞活化的重要共刺激信号。本研究用超抗原葡萄球菌肠毒素B(SEB)诱导外周血T细胞的增殖，继续观察了新增殖的CD4+T细胞表面的分子表达及免疫应答特征。
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1 材料和方法
1.1 淋巴细胞制备 20～29 岁男性献血员外周静脉血(解放军307医院血液中心购入)经淋巴细胞分离液分离后获取淋巴细胞待用〔6〕。
1.2 同源、异源性抗原的制备 同一个体和不同个体的淋巴细胞以 1×106 细胞/ml悬浮于RPMI1640 培养液中置-30°C冻存，3d后解冻，离心 2 000r/20min，沉淀物用 RPMI1640悬浮至所需浓度，即 1×107/ml。
1.3 自身免疫应答反应的测定 1×106细胞/ml，0.1ml置 96 孔细胞培养板内，同时加入 0.1ml SEB(200ng/ml)，对照组加培养基。37°C， 5%CO2孵箱中培养 3d后再次加入抗原，即：100ng/ml SEB, 10μg/ml PHA，及1×106/ml 的细胞碎片作为同源抗原、异源抗原。同条件下继续培养 3d。MTT染色，490nm下测定，记录OD值。
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1.4 细胞表面分子表达的测定 SEB刺激前的淋巴细胞和刺激后不同时间的淋巴细胞1×106个，分别用抗CD4-FITC/CD8/PE抗体，抗CD16-FITC抗体，和抗CD28-PE抗体(PharMingen)，染色，用FACS Calibue(BD,USA)仪器测定，记取细胞 10 000 个，分析淋巴细胞群的CD4、CD8、CD28、CD16的阳性表达率。
2 结果
2.1 SEB诱导胸腺外CD4+T细胞的增殖及表面抗原表达 SEB诱导了外周血淋巴细胞的增殖，增殖的细胞是CD4+T细胞。它们由最初的 38.1% 增加到 48.5%(6d),n=11；CD8+T细胞数量未见变化。伴随CD4+T细胞的增加，CD28分子表达由 53.7%增加到 65.8%，n=6。所有增CD4+T细胞 97% 以上表达CD28 分子，与胸腺内分化的CD4+T细胞表达CD28分子的水平相同(表 1)。
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表 1 SEB诱导外周血CD4+T细胞增殖
及表面抗原表达(n=11,
±s)
SEB-刺激
(d)
抗 原 表 达 阳 性 率
CD4+
CD28+
CD4+CD28+
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0
38.1±5.9
53.7±6.3
34.56±2.6
6
48.5±5.6
65.8±9.6
48.14±7.56
2.2 CD16抗原的表达 SEB刺激后的 6d，淋巴细胞群以外的CD16 分子表达急剧下降，由 93.5% 下降到 26.0%，n=3。显示了外周T细胞的增殖与APC细胞的依赖关系下降(表 2)。 表 2 CD16阳性抗原表达率(n=3，
±s，%)
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SEB刺激(d)
CD16阳性率 n=3
0
93.5±2.73
6
25.9±1.19
2.3 胸腺外增殖的CD4+CD28+T细胞的应答反应 为了观察外周增殖的CD4+CD28+T细胞的免疫应答特征，在用SEB刺激后的 3d再次加入抗原：SEB，PHA，同源抗原和异源抗原。结果显示出它们不仅识别外源性抗原，对同源性抗原也表现了极大的反应性，P<0.01,n=6(附图)。
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附图 活性化CD4+T细胞的免疫应答特征
3 讨论
T细胞识别抗原需要一系列的信号才能产生免疫应答。单独靠TcR不能使大多数T细胞活化。通常APC必须提呈多种信号才能使T细胞活化〔7，8〕。在T细胞抗原识别活化过程中，CD28分子致关重要。实验用超抗原SEB诱导了外周血T细胞的大量增殖，增殖细胞是CD4+T细胞。它们由最初的 38.1%增加到 48.5%。伴随CD4+T细胞的增加，CD28的表达则大幅度增加，由 53.7% 增加到 65.8%，并且发现增殖CD4+T细胞大部分表达CD28(97%，表 1)。这与胸腺内分化T细胞相同〔9〕。然而CD16 的表达量明显降低，由 93.5%降低到 26.0%。SEB诱导T细胞活化时抗原提呈细胞是巨噬细胞而不是B细胞是已经知道的〔6〕；通常在巨噬细胞表面有CD16抗原表达。表 2显示出在SEB刺激后的6d，细胞大量增殖，此时，CD16的表达量在下降，有 93.5% 下降至 26.0%。暗示出外周增殖的T细胞与APC的依赖关系降低。附图的结果证明了外周活化的CD4+CD28+T细胞生物学功能与胸腺内发育成熟T细胞不同。它们不仅与外源性抗原反应，与自身抗原也表现了强烈的应答反应。
, 百拇医药
SEB诱导的外周血T细胞的自身反应性是病理性还是生理性反应?是否会造成自身免疫疾病?实验仍在进行。
*国家科学技术部基金资助项目，批准号 国科 (1997)-567
参考文献
[1]多田富雄.生命意味论.日本：新潮社，1997
[2]Schwartz RH, Costimulation of T lymphocytes: the role of CD28, CTLA-4, and B7-1/BB1 in Interleukin-2 production and immunotherapy. Cell, 1992，71(7)∶1065
[3]June CH, Bluestone JA,nadler LM et al. The B7 and CD28 receptor families. Immunol Today, 1994，15(7)∶321
, http://www.100md.com
[4]Aimin T, Thomas AJ, Brian JN et al. Suppression ofmurine allergic contactdermatitis by CTLA41g: Tolerance induction of Th2 responses requires additional blockade of CD40-ligand. J Immunol, 1996，157∶117
[5]Toyooka K,maruo S, Iwahori T. CD28 co-stimulatory signals induce IL-2 receptor expression on antigen-stimulated virgin T cells by an IL-2-independentmechanism. International Immunol, 1996，8(2)∶159
[6]陈钰，张云林，刘颖.超抗原诱导人外周血T淋巴细胞的增殖.军医进修学院学报，1996，17(2)∶79
, 百拇医药
[7]Schwartz RH. A cell culturemodel for T lymphocyte clonal anergy. Science, 1990，248∶1349
[8]Weaver CT, Unanue ER. The cosimulatory function of antigen-presenting cells. Immunol Today, 1990，11∶49
[9]Tan P, Anasetti C, Hansen JA et al. Induction of alloantigen-specific hyporesponsiveness in human T lymphocytes by bloking interaction of CD28 with itsnatural ligand B7/BB1. J Expmed，1993，177∶165
(1998—08—17收稿，1998—09—28修回), 百拇医药
单位：陈钰 张磊：解放军总医院免疫学教研室，北京 100853；杨舸：解放军总医院口腔科，北京 100853
关键词：外周T细胞；CD28；分子；自身免疫应答
外周血增殖的T细胞CD28分子表达和自身反应性 摘要 目的：SEB诱导增殖的外周血T细胞是否具有正常T细胞的功能。方法：用超抗原刺激淋巴细胞生长；用流式细胞测定技术检查细胞表面CD4，CD8，CD28，T CD16的抗原表达量；加入同源，异源抗原检查自身反应性。结果：SEB能诱导外周血CD4+T细胞的增殖。随CD4+T细胞的增加，CD28分子表达上升。外周增殖的CD4+T细胞与胸腺内分化的T细胞相同，97% 以上的CD4+T细胞都表达CD28分子。但对CD16阳性的抗原提呈细胞的依赖性下降，并显示对自身抗原的识别能力增强。结论：外周活化的CD4+T细胞与胸腺内分化的CD4+T细胞功能不同。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 392.1
CD28molecular expression and autoimmunity in human peripheral blood T cells activation by SEB
Chen Yu, Zhang Lei, Yong Ge
(Department of Immunology, Institute of Clinicalmedicine, General Hospital of PLA, Beijing 100853)
Abstract Objective：We examined the characteristics of human peripheral blood T cells activation by superantigen-B(SEB), and try to know if the proliferous T cells are as same as entrothymic T cells.Methods:We analyzed CD4, CD8, CD16 and CD28molecular expression and autoimmunity of proliferous T cells by flow cytometry and cell culture. Results：Most of CD4+ T cells expressed CD28molecular The CD4+CD8+T cells aredifferent from extrothymic T cells. Thedependence for T cells to APC exhibiteddecrease and showed autoimmunity against to isogenous antigen.Conclusion:The function of CD4+T cells activation in peripheral blood aredifferent from the function of extrothymic T cells.
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Key words Peripheral T cell CD28 autoimmunity
免疫学研究的中心问题是机体的免疫系统如何识别“自己”与“非己”。能够识别“自己”与“非己”的最重要的免疫细胞是T淋巴细胞。T细胞是在胸腺内发育成熟，参与全身循环〔1〕。由于免疫耐受机制的存在，免疫系统对自身物质不进行攻击。但是，近年来发现很多条件能破坏自身免疫耐受机制，如由于胸腺内自身反应性T细胞没有完全被去除；由于克隆无知(Clonal ignorance)状态的解除，自身反应性T细胞识别自己抗原而被活化。同时共刺激因子不断表达，自身抗原不断提呈，致使自身免疫耐受机制崩溃；由于局部高浓度细胞因子的存在，细胞因子解除了T细胞对自身抗原的免疫不反应(Anergy)，以及由于Fas-FasL的参与，程序性细胞凋亡(Apop-
tosis)机能异常等等〔2，3〕。T细胞识别抗原至少需要两种信号，即由TcR介导的抗原特异性信号，和共刺激信号。已经知道在体外缺乏共刺激信号可使T细胞对抗原的不识别，导致免疫不反应〔4，5〕。目前发现T细胞表面的CD28 分子识别抗原提呈细胞(APC)上的B7-1(CD80)，和B7-2(CD86)是细胞活化的重要共刺激信号。本研究用超抗原葡萄球菌肠毒素B(SEB)诱导外周血T细胞的增殖，继续观察了新增殖的CD4+T细胞表面的分子表达及免疫应答特征。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 淋巴细胞制备 20～29 岁男性献血员外周静脉血(解放军307医院血液中心购入)经淋巴细胞分离液分离后获取淋巴细胞待用〔6〕。
1.2 同源、异源性抗原的制备 同一个体和不同个体的淋巴细胞以 1×106 细胞/ml悬浮于RPMI1640 培养液中置-30°C冻存，3d后解冻，离心 2 000r/20min，沉淀物用 RPMI1640悬浮至所需浓度，即 1×107/ml。
1.3 自身免疫应答反应的测定 1×106细胞/ml，0.1ml置 96 孔细胞培养板内，同时加入 0.1ml SEB(200ng/ml)，对照组加培养基。37°C， 5%CO2孵箱中培养 3d后再次加入抗原，即：100ng/ml SEB, 10μg/ml PHA，及1×106/ml 的细胞碎片作为同源抗原、异源抗原。同条件下继续培养 3d。MTT染色，490nm下测定，记录OD值。
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1.4 细胞表面分子表达的测定 SEB刺激前的淋巴细胞和刺激后不同时间的淋巴细胞1×106个，分别用抗CD4-FITC/CD8/PE抗体，抗CD16-FITC抗体，和抗CD28-PE抗体(PharMingen)，染色，用FACS Calibue(BD,USA)仪器测定，记取细胞 10 000 个，分析淋巴细胞群的CD4、CD8、CD28、CD16的阳性表达率。
2 结果
2.1 SEB诱导胸腺外CD4+T细胞的增殖及表面抗原表达 SEB诱导了外周血淋巴细胞的增殖，增殖的细胞是CD4+T细胞。它们由最初的 38.1% 增加到 48.5%(6d),n=11；CD8+T细胞数量未见变化。伴随CD4+T细胞的增加，CD28分子表达由 53.7%增加到 65.8%，n=6。所有增CD4+T细胞 97% 以上表达CD28 分子，与胸腺内分化的CD4+T细胞表达CD28分子的水平相同(表 1)。
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表 1 SEB诱导外周血CD4+T细胞增殖
及表面抗原表达(n=11,
±s)SEB-刺激
(d)
抗 原 表 达 阳 性 率
CD4+
CD28+
CD4+CD28+
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0
38.1±5.9
53.7±6.3
34.56±2.6
6
48.5±5.6
65.8±9.6
48.14±7.56
2.2 CD16抗原的表达 SEB刺激后的 6d，淋巴细胞群以外的CD16 分子表达急剧下降，由 93.5% 下降到 26.0%，n=3。显示了外周T细胞的增殖与APC细胞的依赖关系下降(表 2)。 表 2 CD16阳性抗原表达率(n=3，
±s，%), http://www.100md.com
SEB刺激(d)
CD16阳性率 n=3
0
93.5±2.73
6
25.9±1.19
2.3 胸腺外增殖的CD4+CD28+T细胞的应答反应 为了观察外周增殖的CD4+CD28+T细胞的免疫应答特征，在用SEB刺激后的 3d再次加入抗原：SEB，PHA，同源抗原和异源抗原。结果显示出它们不仅识别外源性抗原，对同源性抗原也表现了极大的反应性，P<0.01,n=6(附图)。
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附图 活性化CD4+T细胞的免疫应答特征
3 讨论
T细胞识别抗原需要一系列的信号才能产生免疫应答。单独靠TcR不能使大多数T细胞活化。通常APC必须提呈多种信号才能使T细胞活化〔7，8〕。在T细胞抗原识别活化过程中，CD28分子致关重要。实验用超抗原SEB诱导了外周血T细胞的大量增殖，增殖细胞是CD4+T细胞。它们由最初的 38.1%增加到 48.5%。伴随CD4+T细胞的增加，CD28的表达则大幅度增加，由 53.7% 增加到 65.8%，并且发现增殖CD4+T细胞大部分表达CD28(97%，表 1)。这与胸腺内分化T细胞相同〔9〕。然而CD16 的表达量明显降低，由 93.5%降低到 26.0%。SEB诱导T细胞活化时抗原提呈细胞是巨噬细胞而不是B细胞是已经知道的〔6〕；通常在巨噬细胞表面有CD16抗原表达。表 2显示出在SEB刺激后的6d，细胞大量增殖，此时，CD16的表达量在下降，有 93.5% 下降至 26.0%。暗示出外周增殖的T细胞与APC的依赖关系降低。附图的结果证明了外周活化的CD4+CD28+T细胞生物学功能与胸腺内发育成熟T细胞不同。它们不仅与外源性抗原反应，与自身抗原也表现了强烈的应答反应。
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SEB诱导的外周血T细胞的自身反应性是病理性还是生理性反应?是否会造成自身免疫疾病?实验仍在进行。
*国家科学技术部基金资助项目，批准号 国科 (1997)-567
参考文献
[1]多田富雄.生命意味论.日本：新潮社，1997
[2]Schwartz RH, Costimulation of T lymphocytes: the role of CD28, CTLA-4, and B7-1/BB1 in Interleukin-2 production and immunotherapy. Cell, 1992，71(7)∶1065
[3]June CH, Bluestone JA,nadler LM et al. The B7 and CD28 receptor families. Immunol Today, 1994，15(7)∶321
, http://www.100md.com
[4]Aimin T, Thomas AJ, Brian JN et al. Suppression ofmurine allergic contactdermatitis by CTLA41g: Tolerance induction of Th2 responses requires additional blockade of CD40-ligand. J Immunol, 1996，157∶117
[5]Toyooka K,maruo S, Iwahori T. CD28 co-stimulatory signals induce IL-2 receptor expression on antigen-stimulated virgin T cells by an IL-2-independentmechanism. International Immunol, 1996，8(2)∶159
[6]陈钰，张云林，刘颖.超抗原诱导人外周血T淋巴细胞的增殖.军医进修学院学报，1996，17(2)∶79
, 百拇医药
[7]Schwartz RH. A cell culturemodel for T lymphocyte clonal anergy. Science, 1990，248∶1349
[8]Weaver CT, Unanue ER. The cosimulatory function of antigen-presenting cells. Immunol Today, 1990，11∶49
[9]Tan P, Anasetti C, Hansen JA et al. Induction of alloantigen-specific hyporesponsiveness in human T lymphocytes by bloking interaction of CD28 with itsnatural ligand B7/BB1. J Expmed，1993，177∶165
(1998—08—17收稿，1998—09—28修回), 百拇医药