ABO基因型检验及其法医学应用研究
作者：邱 宁 李万水 陈 松 张大安
单位：公安部第二研究所，北京100038
关键词：PCR；ABO血型系统；基因型；扩增产物限制片段长度多态性(Amp-RFLP)
ABO基因型检验及其法医学应用研究 邱 宁 李万水 陈 松 张大安 【摘要】目的 采用PCR技术对ABO血型系统进行基因型检验。方法 选择最佳扩增条件进行四引物复合扩增，用限制性内切酶KpnI和AluI分别酶解扩增产物，电泳分离、银染显色法检验ABO基因型。结果 对270例血斑、20例混合斑、20根毛发(有毛囊)、12份唾液斑等不同的生物检材进行了分型，与血清学方法检验结果相符。结论 该方法能够应用于法医学的检验。
The study and application on genotype of the ABO blood groups Qiu Ning, Li Wanshui, Chen Song, et al. Institute of Forensic Sciences, Ministry of Public Security, Beijing 100038
, 百拇医药
【Abstract】Objective To detect genotype ABO blood groups using the polymerize chain reaction (PCR). Methods After four primers coamplification, the PCR products were digested by Kpn I and Alu I, followed by 8% polyacrylamide gel to separate and silver staining. Results The genotypes of 270 bloodstains, 20 mix stains， 20 hair roots, 12 saliva stains were compatible with their serotypes. Conclusion The method described here has been applied to forensic casework successfully.
, 百拇医药
【Key Words】PCR ABO Blood group system Genotype Amp-RFLP
ABO血型系统是第一个被发现的人类遗传标记系统，在输血、亲子鉴定、人类学研究、法医物证检验等领域中有着非常重要的应用价值。对于ABO血型，传统的检验方法是对抗原或抗体进行检验，在法医物证中最为常用的方法是检验抗原物质。由于ABO血型抗原是糖脂或糖蛋白，因此检验时易受抗原活性的强弱、抗体的特异性以及微生物的污染等因素的影响。对于性犯罪中的混合斑检验，传统血清学方法有很大的局限性，使这一难题长期得不到很好的解决。
1990～1993年，Yamamoto[1～6]报道了ABO基因的苷酸序列，查清了各等位基因的差异，能够测定ABO基因。从目前所报道的文献来看，测定ABO基因型的方法主要有3类：(1)扩增产物限制性片段长度多态性(AmpRFLP)[7，8]；(2)用等位基因特异寡核苷酸引物(ASOP)扩增[9]；(3)单链构象多态性(SSCP)[10]。
, 百拇医药
本文选择最佳扩增条件进行四引物复合扩增，用限制性内切酶KpnI和AluI分别酶解扩增产物，电泳分离、银染显色法检验ABO基因型，简便可靠。对血斑、混合斑、毛发、唾液斑等不同的生物检材进行了分型研究，与血清学方法检验结果相符。该方法能够应用于法医学的检验。
材料和方法
(一)实验仪器及试剂
1.实验仪器
(1)DNA热循环仪(Bio-Rad公司)
(2)电泳仪及小型电泳槽(Bio-Rad公司)
2.主要试剂
(1)引物
, 百拇医药
P1: 5’-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3’
P2：5’-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3’
P3：5’-GTGGAGATCCTGACTCCGCTG-3’
P4：5’-CACCGACCCCCCGAAGAAC-3’
(2)Taq DNA聚合酶(PE-Cetus公司)
(3)dNTP(华美生物制品工程公司)
(4)内切酶KpnI(Biolabs公司)
(5)内切酶AluI(Promega公司)
, 百拇医药
(6)Chelex-100(Bio-Rad公司)
(7)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂(Bio-Rad公司)
(二)样品采集及处理
1.样品采集
无关个体血样270份、混合斑20份(同时采集男女性血液)、唾液斑12份、毛发(有毛囊)20根，均由自愿者提供。
2.样品处理
按文献[11～13]的方法，从血液、混合斑、微量血液(斑)、单根毛囊及唾液中提取DNA。
(三)DNA的扩增
PCR在25μl的反应体系中进行：50mM KCl,10mMTris-HCl pH8.3,1.5mM MgCl2,0.01mg/ml白明胶，200μM的每种dNTP,0.2μM的每种引物，1～10ngDNA,95℃热变性2min后加入0.5U Taq DNA聚合酶，置于DNA热循环仪中进行扩增。扩增程序为：95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环结束后再72℃外延伸3min。
, 百拇医药
(四)扩增产物的酶解
扩增产物的酶解在PCR反应体系中进行，直接加入2.5U KpnI和2.5U AluI，37℃酶解1h。
(五)扩增产物的检测
用8%T，5%C，0.75mm厚的小型垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色的方法[11]检测扩增产物。凝胶用583型干胶机(Bio-Rad公司)干燥保存。
结 果
ABO基因位点定位于人类染色体9q34上，该基因有A，B，O 3个等位基因，O基因缺失第261位核苷酸(G)，A基因和B基因在第297，526，657，703，796，803，930位核苷酸有替换。由于其在cDNA序列上的差异，能够用PCR方法分析ABO血型系统的基因型。本文根据第261位核苷酸(G)缺失和第703位核苷酸替换(G→A)产生出两个酶切位点，设计出4个引物：P1位于cDNA第235位，P2位于基因内非编码插入序列，P3位于cDNA第663位，P4位于cDNA第803位。
, 百拇医药
用引物P1，P2进行扩增，产生200bp(A或B)或199bp(O)的片段。199bp片段是由于cDNA第261位核苷酸(G)缺失造成的，从而产生KpnI的酶切位点(GGTAC↓C)，O基因扩增产物经酶切后产生172和27bp的片段，而A或B基因产物不能被KpnI酶切。
用引物P3，P4进行扩增，产生159bp的片段。由于A，B基因的cDNA第703位核苷酸的替换(G→A)，从而产生出AluI的酶切位点(AG↓CT)，B基因扩增产物经酶切后产生118和41bp的片段。A基因扩增产物159bp不能被AluI酶切。
本文经过反复摸索，选择最佳扩增条件进行4引物复合扩增，产物在PCR反应体系中进行酶解，操作方便，结果稳定。如图1所示ABO基因的6种基因型。由于本方法是直接测定基因型，杂合子AO，BO很容易与纯合子AA，BB区分开来，增加了分型，提高了个人识别能力，增强了ABO血型在办案中的应用价值。
, http://www.100md.com
经对270例血斑的ABO基因型进行分析，所得的ABO基因型与血清学方法检验结果相同(见表1)。
表1 ABO血型与基因型的比较
Table 1 Comparison of ABO types between serotyping and genotyping
表现型
基因型
例数
合计
A
AA
12
, 百拇医药 74
AO
62
B
BB
16
87
BO
71
AB
AB
26
26
O
, http://www.100md.com
OO
83
83
M 1 2 3 4 5 6
图1 ABO血型系统基因型检测结果
Fig 1 The results of ABO genotypes
(M. PGEM/Hae Ⅲ 1.AA 2.AO 3.BB 4.BO
5.OO 6.AB)
, 百拇医药 另外，对20例单根毛发的毛囊、12例唾液的分型研究，结果与表型相符。该方法能够应用于法医学的检验。
某年内蒙古某市一女青年被强奸。经检验，受害人为A型，混合斑为A型精斑。当地公安局送来三名嫌疑人赵某(A型)、王某(O型)、李某(A型)的鲜血，要求我处检验。经我处检验，混合斑中精子的基因型为AO型，三嫌疑人的基因型分别为AA、OO、AO型，遂排除赵某、王某。后经DNA指纹图检验，认定精斑为李某所留。
多年来，法医物证检验ABO血型的方法，包括检测抗体或抗原物质，局限性很大，特别是对于困扰法医物证多年的混合斑检验，效果不太理想。本文通过二步分离法从20例混合斑提取精子DNA，直接测定精子ABO基因型，结果与相应的男性血液ABO基因型相同，不受女性阴道分泌物污染的影响，在法医物证检验中能够发挥极其重要的作用。
参考文献
, http://www.100md.com
1.Yamamoto F, Clausen H, White T, et al. Molecular genetic basis of the histo-blood ABO system. Nature, 1990,345:229～233
2.Yamamoto F, Hakomori S. Sugar-nucleotide donor specificity of histo-blood group A and B transferases is based on amino acid substitution. J Bio Chem, 1990,265:19257～19262
3.Yamamoto F, Marken J, Tsuji T, et al. Cloning and characterization of DNA complementarity to human DUP-GaINAc: Fucal → 2Gala → 3Gal-Nac transferase (histo-blood group A transferase) mRNA. J Bio Chem, 1990,265(2):1146～1151
, 百拇医药
4.Yamamoto F, McNeill PD, Yamamoto M, et al. Molecular genetic analysis of the ABO blood group system: 1. Weak subgroups: A3 and B3 alleles. Vox Sanguinis, 1993,64:116～119
5.Yamamoto F, McNeill PD, Yamamoto M, et al. Molecular genetic analysis of the ABO blood group system: 3.AX and B(A) alleles. Vox Sanguinis, 1993,64:171～174
6.Yamamoto F, McNeill PD, Yamamoto M, et al. Molecular genetic analysis of the ABO blood group system: 4. Another type of O allele. Vox Sanguinis, 1993,64:175～178
, 百拇医药
7.Lee JCI, Chang JG, et al.ABO genotyping by poly-merase chain reaction. J Forensic Sci,1992,37(5):1269～1275
8.Herrin G. A simplified amplification procedure for two regions of the glycosyl transferase (ABO blood group) gene. J Forensic Sci, 1996,41(1):138～141
9.Crouse C, Vincek V. Identification of ABO alleles on forensic-type specimens using rapid ABO genotyping. Bio Techniques, 1995,18(3):478～483
, 百拇医药
10.Akane A, Yoshimura S, Yoshida M, et al. ABO genotyping following a single PCR amplification. J Forensic Sci, 1996,41(2):272～274
11.李伯龄，丁焰，倪锦堂.pMCT118位点扩增片段长度多态性及其应用.中国法医学杂志，1991，6(3)：132～134
12.李伯龄，倪锦堂，储小兰，等.用α-珠蛋白-3' HVR探针研究DNA指纹图.中国法医学杂志，1989，4(1)：5～8
13.陈松，李伯龄，倪锦堂，等.p33.6位点扩增片段长度多态性的法医学应用.中国法医学杂志，1994，9(1)：31～33
(收稿：1998-11-20，修回：1998-12-21)
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单位：公安部第二研究所，北京100038
关键词：PCR；ABO血型系统；基因型；扩增产物限制片段长度多态性(Amp-RFLP)
ABO基因型检验及其法医学应用研究 邱 宁 李万水 陈 松 张大安 【摘要】目的 采用PCR技术对ABO血型系统进行基因型检验。方法 选择最佳扩增条件进行四引物复合扩增，用限制性内切酶KpnI和AluI分别酶解扩增产物，电泳分离、银染显色法检验ABO基因型。结果 对270例血斑、20例混合斑、20根毛发(有毛囊)、12份唾液斑等不同的生物检材进行了分型，与血清学方法检验结果相符。结论 该方法能够应用于法医学的检验。
The study and application on genotype of the ABO blood groups Qiu Ning, Li Wanshui, Chen Song, et al. Institute of Forensic Sciences, Ministry of Public Security, Beijing 100038
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【Abstract】Objective To detect genotype ABO blood groups using the polymerize chain reaction (PCR). Methods After four primers coamplification, the PCR products were digested by Kpn I and Alu I, followed by 8% polyacrylamide gel to separate and silver staining. Results The genotypes of 270 bloodstains, 20 mix stains， 20 hair roots, 12 saliva stains were compatible with their serotypes. Conclusion The method described here has been applied to forensic casework successfully.
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【Key Words】PCR ABO Blood group system Genotype Amp-RFLP
ABO血型系统是第一个被发现的人类遗传标记系统，在输血、亲子鉴定、人类学研究、法医物证检验等领域中有着非常重要的应用价值。对于ABO血型，传统的检验方法是对抗原或抗体进行检验，在法医物证中最为常用的方法是检验抗原物质。由于ABO血型抗原是糖脂或糖蛋白，因此检验时易受抗原活性的强弱、抗体的特异性以及微生物的污染等因素的影响。对于性犯罪中的混合斑检验，传统血清学方法有很大的局限性，使这一难题长期得不到很好的解决。
1990～1993年，Yamamoto[1～6]报道了ABO基因的苷酸序列，查清了各等位基因的差异，能够测定ABO基因。从目前所报道的文献来看，测定ABO基因型的方法主要有3类：(1)扩增产物限制性片段长度多态性(AmpRFLP)[7，8]；(2)用等位基因特异寡核苷酸引物(ASOP)扩增[9]；(3)单链构象多态性(SSCP)[10]。
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本文选择最佳扩增条件进行四引物复合扩增，用限制性内切酶KpnI和AluI分别酶解扩增产物，电泳分离、银染显色法检验ABO基因型，简便可靠。对血斑、混合斑、毛发、唾液斑等不同的生物检材进行了分型研究，与血清学方法检验结果相符。该方法能够应用于法医学的检验。
材料和方法
(一)实验仪器及试剂
1.实验仪器
(1)DNA热循环仪(Bio-Rad公司)
(2)电泳仪及小型电泳槽(Bio-Rad公司)
2.主要试剂
(1)引物
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P1: 5’-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3’
P2：5’-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3’
P3：5’-GTGGAGATCCTGACTCCGCTG-3’
P4：5’-CACCGACCCCCCGAAGAAC-3’
(2)Taq DNA聚合酶(PE-Cetus公司)
(3)dNTP(华美生物制品工程公司)
(4)内切酶KpnI(Biolabs公司)
(5)内切酶AluI(Promega公司)
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(6)Chelex-100(Bio-Rad公司)
(7)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂(Bio-Rad公司)
(二)样品采集及处理
1.样品采集
无关个体血样270份、混合斑20份(同时采集男女性血液)、唾液斑12份、毛发(有毛囊)20根，均由自愿者提供。
2.样品处理
按文献[11～13]的方法，从血液、混合斑、微量血液(斑)、单根毛囊及唾液中提取DNA。
(三)DNA的扩增
PCR在25μl的反应体系中进行：50mM KCl,10mMTris-HCl pH8.3,1.5mM MgCl2,0.01mg/ml白明胶，200μM的每种dNTP,0.2μM的每种引物，1～10ngDNA,95℃热变性2min后加入0.5U Taq DNA聚合酶，置于DNA热循环仪中进行扩增。扩增程序为：95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环结束后再72℃外延伸3min。
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(四)扩增产物的酶解
扩增产物的酶解在PCR反应体系中进行，直接加入2.5U KpnI和2.5U AluI，37℃酶解1h。
(五)扩增产物的检测
用8%T，5%C，0.75mm厚的小型垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色的方法[11]检测扩增产物。凝胶用583型干胶机(Bio-Rad公司)干燥保存。
结 果
ABO基因位点定位于人类染色体9q34上，该基因有A，B，O 3个等位基因，O基因缺失第261位核苷酸(G)，A基因和B基因在第297，526，657，703，796，803，930位核苷酸有替换。由于其在cDNA序列上的差异，能够用PCR方法分析ABO血型系统的基因型。本文根据第261位核苷酸(G)缺失和第703位核苷酸替换(G→A)产生出两个酶切位点，设计出4个引物：P1位于cDNA第235位，P2位于基因内非编码插入序列，P3位于cDNA第663位，P4位于cDNA第803位。
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用引物P1，P2进行扩增，产生200bp(A或B)或199bp(O)的片段。199bp片段是由于cDNA第261位核苷酸(G)缺失造成的，从而产生KpnI的酶切位点(GGTAC↓C)，O基因扩增产物经酶切后产生172和27bp的片段，而A或B基因产物不能被KpnI酶切。
用引物P3，P4进行扩增，产生159bp的片段。由于A，B基因的cDNA第703位核苷酸的替换(G→A)，从而产生出AluI的酶切位点(AG↓CT)，B基因扩增产物经酶切后产生118和41bp的片段。A基因扩增产物159bp不能被AluI酶切。
本文经过反复摸索，选择最佳扩增条件进行4引物复合扩增，产物在PCR反应体系中进行酶解，操作方便，结果稳定。如图1所示ABO基因的6种基因型。由于本方法是直接测定基因型，杂合子AO，BO很容易与纯合子AA，BB区分开来，增加了分型，提高了个人识别能力，增强了ABO血型在办案中的应用价值。
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经对270例血斑的ABO基因型进行分析，所得的ABO基因型与血清学方法检验结果相同(见表1)。
表1 ABO血型与基因型的比较
Table 1 Comparison of ABO types between serotyping and genotyping
表现型
基因型
例数
合计
A
AA
12
, 百拇医药 74
AO
62
B
BB
16
87
BO
71
AB
AB
26
26
O
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OO
83
83
M 1 2 3 4 5 6
图1 ABO血型系统基因型检测结果
Fig 1 The results of ABO genotypes
(M. PGEM/Hae Ⅲ 1.AA 2.AO 3.BB 4.BO
5.OO 6.AB)
, 百拇医药 另外，对20例单根毛发的毛囊、12例唾液的分型研究，结果与表型相符。该方法能够应用于法医学的检验。
某年内蒙古某市一女青年被强奸。经检验，受害人为A型，混合斑为A型精斑。当地公安局送来三名嫌疑人赵某(A型)、王某(O型)、李某(A型)的鲜血，要求我处检验。经我处检验，混合斑中精子的基因型为AO型，三嫌疑人的基因型分别为AA、OO、AO型，遂排除赵某、王某。后经DNA指纹图检验，认定精斑为李某所留。
多年来，法医物证检验ABO血型的方法，包括检测抗体或抗原物质，局限性很大，特别是对于困扰法医物证多年的混合斑检验，效果不太理想。本文通过二步分离法从20例混合斑提取精子DNA，直接测定精子ABO基因型，结果与相应的男性血液ABO基因型相同，不受女性阴道分泌物污染的影响，在法医物证检验中能够发挥极其重要的作用。
参考文献
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1.Yamamoto F, Clausen H, White T, et al. Molecular genetic basis of the histo-blood ABO system. Nature, 1990,345:229～233
2.Yamamoto F, Hakomori S. Sugar-nucleotide donor specificity of histo-blood group A and B transferases is based on amino acid substitution. J Bio Chem, 1990,265:19257～19262
3.Yamamoto F, Marken J, Tsuji T, et al. Cloning and characterization of DNA complementarity to human DUP-GaINAc: Fucal → 2Gala → 3Gal-Nac transferase (histo-blood group A transferase) mRNA. J Bio Chem, 1990,265(2):1146～1151
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4.Yamamoto F, McNeill PD, Yamamoto M, et al. Molecular genetic analysis of the ABO blood group system: 1. Weak subgroups: A3 and B3 alleles. Vox Sanguinis, 1993,64:116～119
5.Yamamoto F, McNeill PD, Yamamoto M, et al. Molecular genetic analysis of the ABO blood group system: 3.AX and B(A) alleles. Vox Sanguinis, 1993,64:171～174
6.Yamamoto F, McNeill PD, Yamamoto M, et al. Molecular genetic analysis of the ABO blood group system: 4. Another type of O allele. Vox Sanguinis, 1993,64:175～178
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7.Lee JCI, Chang JG, et al.ABO genotyping by poly-merase chain reaction. J Forensic Sci,1992,37(5):1269～1275
8.Herrin G. A simplified amplification procedure for two regions of the glycosyl transferase (ABO blood group) gene. J Forensic Sci, 1996,41(1):138～141
9.Crouse C, Vincek V. Identification of ABO alleles on forensic-type specimens using rapid ABO genotyping. Bio Techniques, 1995,18(3):478～483
, 百拇医药
10.Akane A, Yoshimura S, Yoshida M, et al. ABO genotyping following a single PCR amplification. J Forensic Sci, 1996,41(2):272～274
11.李伯龄，丁焰，倪锦堂.pMCT118位点扩增片段长度多态性及其应用.中国法医学杂志，1991，6(3)：132～134
12.李伯龄，倪锦堂，储小兰，等.用α-珠蛋白-3' HVR探针研究DNA指纹图.中国法医学杂志，1989，4(1)：5～8
13.陈松，李伯龄，倪锦堂，等.p33.6位点扩增片段长度多态性的法医学应用.中国法医学杂志，1994，9(1)：31～33
(收稿：1998-11-20，修回：1998-12-21)
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