武汉汉族人群短串联重复序列D5S818，D7S820位点多态性研究
作者：杨庆恩 余纯应 陈 慧 杨荣芝
单位：同济医科大学法医学系，武汉430030
关键词：
法律与医学杂志990103 【摘要】目的 研究D5S818，D7S820的多态性及法医学应用价值。方法 应用聚合酶链反应(PCR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及银染显带技术对武汉地区汉族232例无关个体作D5S818，D7S820位点分型调查。结果 D5S818和D7S820位点分别检出8个和6个等位基因，获汉族人群基因频率分布。二位点基因型频率分布符合HardyWeinberg平衡。位点杂合度分别为0.8121和0.7934，个人识别能力分别为0.9416和0.9255，非父排除率分别为0.5842和0.5816。结论 D5S818和D7S820 STR位点均是高杂合度、高鉴别能力的遗传标记系统，在法医学个人识别和亲子鉴定中有较高实用价值。
, 百拇医药
Polymorphism of STR loci D5S818 and D7S820 in Wuhan Han Population Yang Qingen, Yu Chunying, Chen Fui, et al. Faculty of Forensic Medicine, Tong Ji Medical University. Wuhan 430030
【Abstract】Objective To investigate the genetic polymorphism of STR loci D5S818 and D7S820 and its availability in forensic science. Methods 232 unrelative individuals of Han population living in Wuhan were examined using PCR followed by PAGE and silver stains. Results 8 alleles of D5S818 and 6 alleles of D7S820 were identified respectively. The patter of allele frequencies in D5S818 and D7S820 in Han population were obtained. The distribution of genotypes in both loci are good agreement with Hardy-Weinberg equilibrium. The heterozyosity of D5S818 and D7S820 are 0.8121 and 0.7934; the DP value of D5S818 and D7S820 are 0.9416 and 0.9255; the Epp are 0.5842 and 0.5816, respectively. Conclusion The results in this study show that both D5S818 and D7S820 loci are valuable STR genetic marker system having high heterozyosity and DP, these can be used in forensic individualization and paternity test.
, 百拇医药
【Key Words】STR Polymorphism D5S818 D7S820
短串联重复(short tandem repeat,STR)在人类基因组中广泛分布，属微卫星序列。因为STR位点多态片段一般在400bp以下，故PCR扩增成功率高，适用于微量、陈旧甚至腐败检材的DNA分型鉴定。目前，从人类基因组中筛选高杂合度、高多态性STR位点是国内外法医学应用研究的热点之一。本文应用PCR，PAGE技术对STR位点D5S818，D7S820作了分型研究，对武汉地区汉族232例无关个体作群体调查，获得二位点的基因频率分布，对D5S818，D7S820位点的多态性及法医学应用作了简要地讨论，现报告如下。
材料与方法
一、材料
1.血样 武汉地区汉族无关个体232例EDTA抗凝静脉血样由武汉同济医院血库提供。
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2.同一个体的不同组织 脑、肌肉、肝、肾、脾、皮肤、心肌、毛根和血材料由法医尸检例中收集。男性和女性材料各2例。
3.亲子鉴定血样 33例亲子鉴定血样由法医鉴定案例中收集，5个2代18人家系血样由自愿者提供。
4.引物 由Bio-tech公司合成，引物序列如下[1]：
D5S818：引物1：5’GGGTGATTTTCCTCTTTGGT-3’
引物2：5’-TGATTCCAATCATAGCCACA-3’
D7S820：引物1：5’-TGTCATAGTTTAGAACGAACTAACG’
引物2：5’-CTGAGGTATCAAAAACTCAGAGG-3’
, 百拇医药
二、实验方法
1.DNA提取 用Chelex-100法提取[2]
2.PCR扩增 反应体系20μl，内含10mmol/L Tris-HCl,PH8.3，50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,200μmol/LdNTP,0.5u DNA聚合酶，引物各0.4μmol/L，模板DNA液8μl，加石腊油覆盖。
循环参数：96℃×2min×1cycle;94℃×1min/60℃×1min/70℃×1.5min×10cycles;90℃×1min/60℃×1min/70℃×1.5min×20cycles;70℃×30min×1cycle。
3.扩增产物检测 聚丙烯酰胺凝胶T6%，C5%，垂直电泳，凝胶缓冲液1×TBE(90mmol/L Tris,90mmol/L硼酸，2mmol/L EDTA),电极缓冲液0.5×TBE。每样品加等体积2×载样缓冲液(10mmol/L NaOH,90%甲酰胺，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯青FF)混匀，5000rpm离心1min，取2μl加样。
, 百拇医药
电泳条件：恒电压500V，电泳时间60min。银染以10%乙酸固定8min，双蒸水洗涤2次，每次2min，1.5%硝酸银染色20min，3%碳酸钠显带，10%乙酸固定3min，最后以双蒸水洗涤2min。
4.分子量标记和等位基因梯阶对照 电泳分离设置50bp梯阶对照和Φ174/HaeⅢ分子量标准对照，确定位点多态片段大小范围。选择数个已知基因型杂合子血样，要求包括该位点所有等位基因，调整DNA液浓度至50ng/μl左右，各取相同体积混合，然后取4μl混合物作PCR扩增，扩增产物即包括所有基因，作为位点的等位基因梯阶对照。
结 果
1.等位基因片段的确定 参照50bp梯阶对照及Φ174/HaeⅢ分子量标准，确定位点多态片段大小范围。D5S818位点多态片段长度129bp～157bp，共检出8个等位基因，每相邻基因的片段相差4bp，按片段长度从小到大命名为n1～n8。D7S820位点片段范围205bp～225bp，共检出6个等位基因，各基因间相差4bp，以n1～n6分别命名(图1)。
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图1 D5S818和D7S820 STR位点基因型(正极在下)
Fig 1 Genotypes of D5S818 and D7S820 STR loci (anode at below)
左图：D7S820位点，自左至右：n1/n3,M(等位基因梯阶标记对照),n1/n4,n1/n5,n2/n6,M,n3/n6,n1/n5,n2/n4,M,n3/n5
Locus D7S820，from left to right：n1/n3,M(allelic ladder),n1/n4,n1/n5,n2
/n6,M,n3/n6,n1/n5,n2/n4,M,n3/n5
右图：D5S818位点，自左至右：n3/n4,M,n7/n8,n6,n4/n5,M,n3/n4,n2/n6,n1/n6,M,n7/n8
, http://www.100md.com
Locus D5S818，from left to right：n3/n4,M,n7/n8,n6,n4/n5,M,n3/n4,n2/n6,n1/n6,M,n7/n8
2.位点基因频率分布 记录D5S818，D7S820位点的232例血样DNA基因型，计算基因频率。对二位点基因型分布作卡方检验，基因型观察值与期望值的差异无显著性，与Hardy-Weinberg平衡吻合良好(表1，2)。
表1 汉族人群D5S818位点频率分布
Table 1 Frequency distribution of D5S818 locus in Han population 基因
n1
n2
n3
, http://www.100md.com
n4
n5
n6
n7
n8
基因数
基因频率(SE%)
n1
0
0
0
3
5
5
, http://www.100md.com
4
0
17
0.0366±0.9
n2
0
0
4
3
6
4
1
18
0.0388±0.9
, 百拇医药
n3
3
5
10
12
4
1
38
0.0819±1.3
n4
8
16
20
8
, http://www.100md.com
1
73
0.1573±1.7
n5
14
28
18
3
111
0.2392±2.0
n6
16
21
, 百拇医药
3
127
0.2737±2.1
n7
5
1
70
0.1509±1.7
n8
0
10
0.0216±0.7
合计
, 百拇医药
464
1.0000
(P>0.70)
表2 汉族人群D7S820位点频率分布
Table 2 Frequency distribution of D7S820 locus in Han population 基因
n1
n2
n3
n4
n5
n6
, 百拇医药
基因数
基因频率(±SE%)
n1
9
7
13
20
14
1
73
0.1573±1.7
n2
3
, http://www.100md.com
10
12
7
1
43
0.0927±1.4
n3
11
28
23
4
100
0.2155±1.9
, 百拇医药
n4
20
28
4
132
0.2845±2.1
n5
12
4
100
0.2155±1.9
n6
1
, 百拇医药
16
0.0345±0.9
合计
464
1.0000
(P>0.50)
3.D5S818，D7S820位点杂合度，个人识别能力，非父排除率，多态信息总量 计算结果见表3。
表3 D5S818和D7S820位点H，Dp，Pm，PE和PIC值
Table 3 The H, Dp, Pm, PE and PIC of STR loci D5S818 and D7S820 位点
, 百拇医药 基因数
Hobs.
Hexp.(SE%)
Dp
Pm
PE
PIC
D5S818
8
0.8017
0.8121±2.5
0.9416
0.0584
, 百拇医药
0.5842
0.7345
D7S820
6
0.7586
0.7934±2.7
0.9255
0.0745
0.5816
0.7365
4.同一个体各组织检测 同一个体的脑、肌肉、肝、肾、脾、皮肤、心肌、毛根和血作D5S818，D7S820位点的分型，位点基因型均为一致。5.亲子鉴定 收集的亲子鉴定33例中，经常规鉴定确定亲生关系21例，排除亲生关系12例。经D5S818和D7S820位点检测，在确定亲生关系的21例，二位点均不排除亲生关系；在12例排除亲生关系例中，D5S818位点排除非父8例。D7S820位点排除7例。
, 百拇医药
对5个2代18人家系作D5S818，D7S820分型，等位基因呈共显性遗传特征，传递均符合孟德尔分离律。在家系调查中观察的16次减数分裂，二位点均未见突变的片段长度等位基因。讨 论
短串联重复序列在人类基因组DNA中含量丰富，分布广泛。STR多态位点重复单位2～5bp，其中3bp，4bp重复的位点常作为法医学应用研究的重点。因为较短重复单位如2bp的位点，在PCR扩增过程中易出现酶滑脱(enzyme slippage)现象，扩增产物出现干扰判型的附加带；而较长重复单位位点的扩增效率相对要低。本文D5S818，D7S820位点均属4bp位点，分型结果稳定，可重复性好，符合理想STR位点的条件。
等位基因片段长度也是选择实用STR位点要考虑的一个因素。一般而言，片段越短，检测灵敏度要高，片段长度测量误差要小。D5S818和D7S820位点的等位基因片段均在300bp以下，实际应用效果良好。
, 百拇医药
对汉族232例无关个体分型，D5S818位点检出8个等位基因，D7S820检出6个，二位点的等位基因均以4bp为递增单位。Jin等对中国人群调查，D5S818检出6个基因，D7S820检出4个，明显比本文少，原因可能是样本量太少[1]。观察本次232例分型，二位点基因型频率分布与Hardy-Weinberg平衡吻合度良好。D5S818位点最常见基因型是n5/n6(频率0.1207)，D7S820为n3/n4和n4/n5(频率均为0.1207)。按基因频率大于0.05作为常见基因的标准，本文二个位点常见等位基因都是5个。
Gill等提出STR位点选择标准中，个人识别能力(Dp)应在0.9以上，位点杂合度(H)在0.7以上[3]，根据汉族人群调查结果，D5S818和D7S820均符合这一条件，属于高杂合度、高多态性STR位点。联合检测二STR位点，平均匹配概率(Pm)为0.0044，累积Dp值0.9956，累积PE值0.6602。由此可见，D5S818和D7S820在法医学个人识别和亲子鉴定中有较高实用价值。
, 百拇医药
对5个家系作D5S818，D7S820位点家系调查，证实二STR位点等位基因传递均符合孟德尔分离律，家系调查未发现突变基因。同一个体的不同组织分型基因型一致，未发现器官特异性。D5S818和D7S820的基因传递以及个体的同一性均符合法医学应用的基本条件。
参考文献
1.Jin L,Underhill PA,Buoncristiani M, et al. Defining microsatellite alleles by genotyping global indigenous human populations and non-human primates. J Forensic Sci, 1997,42(3):496
2.Walsh PS, Walsh DA, Hignchi R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques, 1991(10):506
3.Cill P. A new method of STR interpretation using inferential logic-development of a criminal intelligence database. Int J Leg Med, 1996,109:14
(收稿：1998-09-03，修回：1998-11-30)
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单位：同济医科大学法医学系，武汉430030
关键词：
法律与医学杂志990103 【摘要】目的 研究D5S818，D7S820的多态性及法医学应用价值。方法 应用聚合酶链反应(PCR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及银染显带技术对武汉地区汉族232例无关个体作D5S818，D7S820位点分型调查。结果 D5S818和D7S820位点分别检出8个和6个等位基因，获汉族人群基因频率分布。二位点基因型频率分布符合HardyWeinberg平衡。位点杂合度分别为0.8121和0.7934，个人识别能力分别为0.9416和0.9255，非父排除率分别为0.5842和0.5816。结论 D5S818和D7S820 STR位点均是高杂合度、高鉴别能力的遗传标记系统，在法医学个人识别和亲子鉴定中有较高实用价值。
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Polymorphism of STR loci D5S818 and D7S820 in Wuhan Han Population Yang Qingen, Yu Chunying, Chen Fui, et al. Faculty of Forensic Medicine, Tong Ji Medical University. Wuhan 430030
【Abstract】Objective To investigate the genetic polymorphism of STR loci D5S818 and D7S820 and its availability in forensic science. Methods 232 unrelative individuals of Han population living in Wuhan were examined using PCR followed by PAGE and silver stains. Results 8 alleles of D5S818 and 6 alleles of D7S820 were identified respectively. The patter of allele frequencies in D5S818 and D7S820 in Han population were obtained. The distribution of genotypes in both loci are good agreement with Hardy-Weinberg equilibrium. The heterozyosity of D5S818 and D7S820 are 0.8121 and 0.7934; the DP value of D5S818 and D7S820 are 0.9416 and 0.9255; the Epp are 0.5842 and 0.5816, respectively. Conclusion The results in this study show that both D5S818 and D7S820 loci are valuable STR genetic marker system having high heterozyosity and DP, these can be used in forensic individualization and paternity test.
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【Key Words】STR Polymorphism D5S818 D7S820
短串联重复(short tandem repeat,STR)在人类基因组中广泛分布，属微卫星序列。因为STR位点多态片段一般在400bp以下，故PCR扩增成功率高，适用于微量、陈旧甚至腐败检材的DNA分型鉴定。目前，从人类基因组中筛选高杂合度、高多态性STR位点是国内外法医学应用研究的热点之一。本文应用PCR，PAGE技术对STR位点D5S818，D7S820作了分型研究，对武汉地区汉族232例无关个体作群体调查，获得二位点的基因频率分布，对D5S818，D7S820位点的多态性及法医学应用作了简要地讨论，现报告如下。
材料与方法
一、材料
1.血样 武汉地区汉族无关个体232例EDTA抗凝静脉血样由武汉同济医院血库提供。
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2.同一个体的不同组织 脑、肌肉、肝、肾、脾、皮肤、心肌、毛根和血材料由法医尸检例中收集。男性和女性材料各2例。
3.亲子鉴定血样 33例亲子鉴定血样由法医鉴定案例中收集，5个2代18人家系血样由自愿者提供。
4.引物 由Bio-tech公司合成，引物序列如下[1]：
D5S818：引物1：5’GGGTGATTTTCCTCTTTGGT-3’
引物2：5’-TGATTCCAATCATAGCCACA-3’
D7S820：引物1：5’-TGTCATAGTTTAGAACGAACTAACG’
引物2：5’-CTGAGGTATCAAAAACTCAGAGG-3’
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二、实验方法
1.DNA提取 用Chelex-100法提取[2]
2.PCR扩增 反应体系20μl，内含10mmol/L Tris-HCl,PH8.3，50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,200μmol/LdNTP,0.5u DNA聚合酶，引物各0.4μmol/L，模板DNA液8μl，加石腊油覆盖。
循环参数：96℃×2min×1cycle;94℃×1min/60℃×1min/70℃×1.5min×10cycles;90℃×1min/60℃×1min/70℃×1.5min×20cycles;70℃×30min×1cycle。
3.扩增产物检测 聚丙烯酰胺凝胶T6%，C5%，垂直电泳，凝胶缓冲液1×TBE(90mmol/L Tris,90mmol/L硼酸，2mmol/L EDTA),电极缓冲液0.5×TBE。每样品加等体积2×载样缓冲液(10mmol/L NaOH,90%甲酰胺，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯青FF)混匀，5000rpm离心1min，取2μl加样。
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电泳条件：恒电压500V，电泳时间60min。银染以10%乙酸固定8min，双蒸水洗涤2次，每次2min，1.5%硝酸银染色20min，3%碳酸钠显带，10%乙酸固定3min，最后以双蒸水洗涤2min。
4.分子量标记和等位基因梯阶对照 电泳分离设置50bp梯阶对照和Φ174/HaeⅢ分子量标准对照，确定位点多态片段大小范围。选择数个已知基因型杂合子血样，要求包括该位点所有等位基因，调整DNA液浓度至50ng/μl左右，各取相同体积混合，然后取4μl混合物作PCR扩增，扩增产物即包括所有基因，作为位点的等位基因梯阶对照。
结 果
1.等位基因片段的确定 参照50bp梯阶对照及Φ174/HaeⅢ分子量标准，确定位点多态片段大小范围。D5S818位点多态片段长度129bp～157bp，共检出8个等位基因，每相邻基因的片段相差4bp，按片段长度从小到大命名为n1～n8。D7S820位点片段范围205bp～225bp，共检出6个等位基因，各基因间相差4bp，以n1～n6分别命名(图1)。
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图1 D5S818和D7S820 STR位点基因型(正极在下)
Fig 1 Genotypes of D5S818 and D7S820 STR loci (anode at below)
左图：D7S820位点，自左至右：n1/n3,M(等位基因梯阶标记对照),n1/n4,n1/n5,n2/n6,M,n3/n6,n1/n5,n2/n4,M,n3/n5
Locus D7S820，from left to right：n1/n3,M(allelic ladder),n1/n4,n1/n5,n2
/n6,M,n3/n6,n1/n5,n2/n4,M,n3/n5
右图：D5S818位点，自左至右：n3/n4,M,n7/n8,n6,n4/n5,M,n3/n4,n2/n6,n1/n6,M,n7/n8
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Locus D5S818，from left to right：n3/n4,M,n7/n8,n6,n4/n5,M,n3/n4,n2/n6,n1/n6,M,n7/n8
2.位点基因频率分布 记录D5S818，D7S820位点的232例血样DNA基因型，计算基因频率。对二位点基因型分布作卡方检验，基因型观察值与期望值的差异无显著性，与Hardy-Weinberg平衡吻合良好(表1，2)。
表1 汉族人群D5S818位点频率分布
Table 1 Frequency distribution of D5S818 locus in Han population 基因
n1
n2
n3
, http://www.100md.com
n4
n5
n6
n7
n8
基因数
基因频率(SE%)
n1
0
0
0
3
5
5
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4
0
17
0.0366±0.9
n2
0
0
4
3
6
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1
18
0.0388±0.9
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n3
3
5
10
12
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38
0.0819±1.3
n4
8
16
20
8
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1
73
0.1573±1.7
n5
14
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18
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0.2392±2.0
n6
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3
127
0.2737±2.1
n7
5
1
70
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n8
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10
0.0216±0.7
合计
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464
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(P>0.70)
表2 汉族人群D7S820位点频率分布
Table 2 Frequency distribution of D7S820 locus in Han population 基因
n1
n2
n3
n4
n5
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基因数
基因频率(±SE%)
n1
9
7
13
20
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1
73
0.1573±1.7
n2
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12
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0.0927±1.4
n3
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0.2845±2.1
n5
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n6
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合计
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(P>0.50)
3.D5S818，D7S820位点杂合度，个人识别能力，非父排除率，多态信息总量 计算结果见表3。
表3 D5S818和D7S820位点H，Dp，Pm，PE和PIC值
Table 3 The H, Dp, Pm, PE and PIC of STR loci D5S818 and D7S820 位点
, 百拇医药 基因数
Hobs.
Hexp.(SE%)
Dp
Pm
PE
PIC
D5S818
8
0.8017
0.8121±2.5
0.9416
0.0584
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0.5842
0.7345
D7S820
6
0.7586
0.7934±2.7
0.9255
0.0745
0.5816
0.7365
4.同一个体各组织检测 同一个体的脑、肌肉、肝、肾、脾、皮肤、心肌、毛根和血作D5S818，D7S820位点的分型，位点基因型均为一致。5.亲子鉴定 收集的亲子鉴定33例中，经常规鉴定确定亲生关系21例，排除亲生关系12例。经D5S818和D7S820位点检测，在确定亲生关系的21例，二位点均不排除亲生关系；在12例排除亲生关系例中，D5S818位点排除非父8例。D7S820位点排除7例。
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对5个2代18人家系作D5S818，D7S820分型，等位基因呈共显性遗传特征，传递均符合孟德尔分离律。在家系调查中观察的16次减数分裂，二位点均未见突变的片段长度等位基因。讨 论
短串联重复序列在人类基因组DNA中含量丰富，分布广泛。STR多态位点重复单位2～5bp，其中3bp，4bp重复的位点常作为法医学应用研究的重点。因为较短重复单位如2bp的位点，在PCR扩增过程中易出现酶滑脱(enzyme slippage)现象，扩增产物出现干扰判型的附加带；而较长重复单位位点的扩增效率相对要低。本文D5S818，D7S820位点均属4bp位点，分型结果稳定，可重复性好，符合理想STR位点的条件。
等位基因片段长度也是选择实用STR位点要考虑的一个因素。一般而言，片段越短，检测灵敏度要高，片段长度测量误差要小。D5S818和D7S820位点的等位基因片段均在300bp以下，实际应用效果良好。
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对汉族232例无关个体分型，D5S818位点检出8个等位基因，D7S820检出6个，二位点的等位基因均以4bp为递增单位。Jin等对中国人群调查，D5S818检出6个基因，D7S820检出4个，明显比本文少，原因可能是样本量太少[1]。观察本次232例分型，二位点基因型频率分布与Hardy-Weinberg平衡吻合度良好。D5S818位点最常见基因型是n5/n6(频率0.1207)，D7S820为n3/n4和n4/n5(频率均为0.1207)。按基因频率大于0.05作为常见基因的标准，本文二个位点常见等位基因都是5个。
Gill等提出STR位点选择标准中，个人识别能力(Dp)应在0.9以上，位点杂合度(H)在0.7以上[3]，根据汉族人群调查结果，D5S818和D7S820均符合这一条件，属于高杂合度、高多态性STR位点。联合检测二STR位点，平均匹配概率(Pm)为0.0044，累积Dp值0.9956，累积PE值0.6602。由此可见，D5S818和D7S820在法医学个人识别和亲子鉴定中有较高实用价值。
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对5个家系作D5S818，D7S820位点家系调查，证实二STR位点等位基因传递均符合孟德尔分离律，家系调查未发现突变基因。同一个体的不同组织分型基因型一致，未发现器官特异性。D5S818和D7S820的基因传递以及个体的同一性均符合法医学应用的基本条件。
参考文献
1.Jin L,Underhill PA,Buoncristiani M, et al. Defining microsatellite alleles by genotyping global indigenous human populations and non-human primates. J Forensic Sci, 1997,42(3):496
2.Walsh PS, Walsh DA, Hignchi R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques, 1991(10):506
3.Cill P. A new method of STR interpretation using inferential logic-development of a criminal intelligence database. Int J Leg Med, 1996,109:14
(收稿：1998-09-03，修回：1998-11-30)
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