变形链球菌表面粘结素与唾液受体结合特异性的初步研究
作者：詹玲 刘天佳 傅明德 岳松龄 周学东
单位：詹玲 刘天佳 岳松龄 周学东(610041 成都，华西医科大学口腔医学院)，傅明德(基础医学生化教研室)
关键词：链球菌，变异；受体，免疫
中华口腔医学杂志990105 【摘要】 目的 研究变形链球菌表面粘结素与唾液受体间的对应结合关系。方法 采用3H标记的变形链球菌(简称变链)竞争性粘附抑制实验及自行设计的间接酶联免疫受体结合实验，检测纯化唾液受体与纯化变链表面粘结素间的结合特异性及其强度。结果 唾液IgA降解片段和相对分子质量为13 000的酸性蛋白仅促进变链粘附，唾液淀粉酶具有促进粘附及抗粘附双重作用。相对分子质量为127 000的变链表面粘结素及GTF组分分别可竞争抑制变链对IgA降解片段及淀粉酶的粘附，蛋白质P1和相对分子质量为117 000的粘结素可同时竞争抑制变链对此二种唾液组分的粘附；间接酶联免疫受体结合实验表明各变链粘结素不与IgA降解片段有效结合。结论 变链在牙面的粘附是多种粘结素与唾液受体共同作用的结果。
, 百拇医药
A study on the conjugation of Streptococcus
mutans adhesins and its salivary receptors
ZHAN Ling,LIU Tianjia，FU Mingde, et al.
School of Stomatology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To investigate the conjugation specificity of Streptococcus mutans' adhesins and their salivary receptors. Methods Include purified salivary receptor or adhesin competitive bacteria adhesion inhibition test and enzyme linked immuno-receptor assay (ELIRA) on S. mutans WD9463A. Results Salivary amylases can both enhance and competitively inhibit the adhesion of the strain to HA, while IgA degraded fragments and MW=13 000 protein only promote its adhesion. P1 and a 117 000 surface protein of WD9463A both inhibit adhesion of the strain to IgA degraded fragments and salivary amylases. An 127 000 protein of WD9463A and a kind of GTFase inhibit its adhesion to IgA degraded fragments and salivary amylases respectively. No conjugation was found between IgA degraded fragments and the adhesins, while reaction between amylases and the adhesins had basically accordance with adhesion inhibition test. Conclusion The adhesion of S. mutans is a result of reaction between multireceptors and multiadhesins.
, 百拇医药
【Key words】 Streptococus，mutans Receptors，immunologic
变形链球菌(血清型C，以下简称变链)对牙面的粘附是其表面粘结素与牙面唾液获得性膜(salivary acquried pellicle, SAP)受体的特异性结合，了解其结合的特异性，可为特异性地抑制该菌在牙面的粘附、控制菌斑形成及防治龋病的发生提供理论基础。目前，对变链牙面粘附机理的研究已成为国内外龋病研究的热点，但有关粘附受体配体结合特异性的研究却很少[1，2]。我们通过对纯化变链表面粘结素及其SAP受体对变链粘附的竞争抑制实验和酶联免疫受体粘附实验，探讨了变链粘附受体配体结合的特异性，以期深入认识变链在牙面粘附初始阶段的分子机理。
材料和方法
一、变链SAP受体、表面粘结素的来源及鉴定
, http://www.100md.com
变链SAP受体从实验性SAP中纯化，变链表面粘结素从细菌培养上清中纯化，二者分别经PAGE、SDS-PAGE、IEP-PAGE确认为单一蛋白质组分。此外还采用淀粉酶活性测定、GTF活性测定、免疫双扩散实验、氨基酸组分分析以及细菌粘附或粘附竞争抑制实验鉴定、筛选受体或粘结素。我们选用了8种变链SAP受体和4种变链粘结素成分[3]进行研究，其组分名称及成分见表1、2。
表1 游离SAP组分对细菌粘附的竞争
抑制实验结果(
，cpm) 包被成分
包被成分组成
阴性对照
阳性
, 百拇医药
对照
实验
组
抑制率
(%)
SAG1D1
非糖酰化淀粉酶
684
2 041
1 371
49
SAG2
糖酰化淀粉酶
, 百拇医药
684
2 168
1 074
73
SAG3
糖酰化淀粉酶
684
2 627
637
100
SBG1D1
IgA降解片段
501
, http://www.100md.com
1 288
1 089
25
SBG2D1
IgA降解片段
501
1 406
1 363
5
SBG3D1
糖酰化淀粉酶
684
2 040
, http://www.100md.com
1 066
72
SBG4
糖酰化淀粉酶
684
1 264
601
100*
SBG3D2
酸性蛋白(13 000)
501
933
960
, http://www.100md.com
0**
注：SAP：唾液获得性膜；抑制率(%)=[1-(实验组-阴性对照组)/(阳性对照组-阴性对照组)]×100%；*当实验组<阴性对照组时，抑制率为100%；**当实验组>阳性对照组时，抑制率为0表2 变链表面粘结素对其与SAP受体粘附的竞争抑制实验 抑制成分
抑制成分组成
粘附抑制率(%)
SBG1D1
SBG2D1
SBG3D1
SAG1D1
SAG3
, 百拇医药
SBG4
阳性对照组
人血清白蛋白
0
0
0
0
0
0
MD3S1
127 000糖蛋白
73
69
, http://www.100md.com
44
32
43
5
MD3S2
P1
75
77
91
99
81
81
MD3S3
GTF
, 百拇医药
47
59
94
75
61
34
MD5S1
117 000蛋白
87
50
95
91
53
, 百拇医药 70
二、细菌粘附实验
1. 细菌的培养及标记：将变链(C)地方株WD9463A接种于含370 MBq/L3H-胸腺嘧啶核苷的TPY培养基中，微需氧(80%N2、10%CO2、10%H2)37℃培养18小时，离心收集菌细胞，KCl缓冲液洗3次，将菌细胞悬浮于含5 g/L人血清白蛋白的KCl缓冲液中，550nm调A=0.62。
2. 纯SAP组分对细菌粘附的竞争抑制实验：用纯化的SAP组分(0.1 g/L)包被HA，洗3次，加人血清白蛋白封闭，后加入80 μl菌悬液和20 μl纯化SAP组分(0.5 g/L)，阳性对照组则加入菌液和20 μl 人血清白蛋白 (0.5g/L)37℃旋转1小时，洗3次后进行液闪计数，阴性对照组用KCl缓冲液包被HA，其余步骤同阳性对照组。实验均用双孔法。
, 百拇医药
3. 变链表面粘结素对细菌粘附的竞争抑制实验：用纯化SAP组分包被HA，人血清白蛋白封闭后加入纯化变链表面粘结素100 μl(0.5 g/L)，37℃旋转1小时，对照组加100 μl 人血清白蛋白，洗3次，加菌悬液100 μl，处理1小时，洗涤后进行液闪计数。阳性对照及阴性对照分别用全唾液和KCl缓冲液包被HA。实验均用双孔法。
三、间接酶联免疫受体结合实验(ELIRA)
此方法根据ELISA实验原理建立，用于直接测定变链表面蛋白与唾液受体间的结合。实验组、阴性和阳性对照组分别用100 μl 纯化SAP组分(2.5 mg/L)、包被缓冲液或纯化变链表面粘结素(10 mg/L)，4℃过夜，洗3次，1%牛血清白蛋白37℃封闭1小时，洗3次，前两组加入100 μl与阳性对照组一致的纯化变链表面粘结素，阳性对照组加入洗涤液，37℃保温1小时，洗3次后加入100 μl兔抗变链表面蛋白粗纯品血清(1:200)37℃保温2小时，洗涤, 加入100 μl HRP-羊抗兔IgG(1:5 000) 37℃保温2小时，洗5次, 加入底物液反应30 min，2 mol/L硫酸终止反应，以波长492 nm进行比色。
, 百拇医药
结果
一、纯SAP组分对变链粘附的竞争抑制实验结果
由表1可见，游离唾液淀粉酶组分可不同程度抑制变链粘附，其中SAG3和SBG4几乎可完全阻断变链粘附；而IgA降解片段及相对分子质量为13 000的酸性蛋白的作用很弱。
二、变链表面粘结素对变链粘附的竞争抑制实验结果
由表2可见，相对分子质量为127 000的表面蛋白可强烈抑制变链对IgA降解片段的粘附；蛋白P1对细菌及5种唾液成分的粘附均有较强抑制作用；GTF组分主要竞争抑制细菌与淀粉酶的粘附；相对分子质量为117 000的蛋白可强烈抑制细菌对一IgA片段及2种淀粉酶的粘附。
三、酶联免疫受体粘附实验结果
由表3可见，4种变链粘结素组份均不与SBG1D1，SBG2D1发生有效结合；MD3S2，MD3S3，MD5S1可与4种淀粉酶组份有效结合。
, 百拇医药
表3 粘附相关蛋白ELIRA测定结果 包被成分
SBG
1D1
SBG
2D1
SBG
3D1
SBG4
SAG
1D1
SAG3
MD3S1
1.2
, 百拇医药
0.7
1.7
1.4
1.3
1.5
MD3S2
2.0
1.8
5.4
4.9
3.0
7.2
MD3S3
, 百拇医药
1.3
1.0
4.2
3.7
2.2
4.2
MD5S1
1.8
1.8
4.0
4.3
3.0
3.4
, 百拇医药
注：此表中的测定结果为阳性对照组与阴性对照组的光吸收值之比，当比值>2.1时为阳性
讨论
一、变链粘附隐匿受体的存在及唾液淀粉酶组分在其粘附中的双重作用
本研究发现，IgA降解片段及相对分子质量为13 000的酸性蛋白在吸附于HA上时可促进变链的粘附，但不竞争抑制其粘附；在直接测定变链表面蛋白与各种唾液受体间的结合关系的ELIRA实验中，它们也不与任何一种测试的变链表面粘结素成分有效结合，提示它们为变链在牙面的隐匿受体，IgA片段的促粘附作用也许不是通过抗原抗体反应进行的，它具有高度的特异性。作者在过去的研究中还发现唾液中的IgA成分呈现出多型性，而不同表型的IgA在变链粘附中的作用亦不同，IgA降解片段SBG1D1及SBG2D1可促进变链粘附，而其它IgA组分则作用很弱[3]，提示口腔内细菌产生的IgA酶的降解作用可减少SIgA的抗粘附作用，并增强它对粘附的促进作用。由于这类受体不诱导细菌凝集，故不利于细菌的清除，因此在细菌对牙面的粘附中有十分重要的作用。本实验中还发现几种唾液淀粉酶组分既能明显促进变链对HA的粘附，又可有效地竞争抑制其粘附，说明它们在变链粘附中具有双重作用。其中两种酶组分在低浓度时即可完全阻断细菌粘附，提示其抗粘附作用更为重要。
, 百拇医药
二、变链表面粘结素与其唾液受体结合特异性的初步研究
我们通过纯化变链表面粘结素对该菌与纯化SAP组分包被HA粘附的竞争抑制实验发现：变链表面相对分子质量为127 000粘结素可有效抑制该菌对唾液IgA降解片段的粘附，提示其以IgA降解片段为受体；P1和相对分子质量为117 000的表面蛋白则可同时有效抑制细菌对IgA降解片段和唾液淀粉酶组分的粘附，提示它们可能有两类受体；而GTF酶组分MD353主要抑制细菌与淀粉酶的粘附，故主要以淀粉酶为受体。这一结果提示变链在牙面的粘附是多种粘结素与多种受体共同作用的结果。
参考文献
[1] Russell MW, Mansso-Rahemtulla B. Interaction between surface protein antigens of Streptococcus mutans and human salivary components. Oral Microbiol Immunol，1989， 4:106-111.
[2] 黄定明，罗宗莲，周学东，等.变链球菌表面蛋白P1对人唾液接受器的研究.华西口腔医学杂志，1995，13：160-162.
[3] 詹玲，傅明德，刘天佳，等.变形链球菌对唾液获得性膜粘附机理的研究.Ⅱ.变形链球菌表面粘结素的筛选及分离纯化.华西口腔医学杂志，1998，16:76-79.
(收稿：1998-04-10 修回：1998-09-14), 百拇医药
单位：詹玲 刘天佳 岳松龄 周学东(610041 成都，华西医科大学口腔医学院)，傅明德(基础医学生化教研室)
关键词：链球菌，变异；受体，免疫
中华口腔医学杂志990105 【摘要】 目的 研究变形链球菌表面粘结素与唾液受体间的对应结合关系。方法 采用3H标记的变形链球菌(简称变链)竞争性粘附抑制实验及自行设计的间接酶联免疫受体结合实验，检测纯化唾液受体与纯化变链表面粘结素间的结合特异性及其强度。结果 唾液IgA降解片段和相对分子质量为13 000的酸性蛋白仅促进变链粘附，唾液淀粉酶具有促进粘附及抗粘附双重作用。相对分子质量为127 000的变链表面粘结素及GTF组分分别可竞争抑制变链对IgA降解片段及淀粉酶的粘附，蛋白质P1和相对分子质量为117 000的粘结素可同时竞争抑制变链对此二种唾液组分的粘附；间接酶联免疫受体结合实验表明各变链粘结素不与IgA降解片段有效结合。结论 变链在牙面的粘附是多种粘结素与唾液受体共同作用的结果。
, 百拇医药
A study on the conjugation of Streptococcus
mutans adhesins and its salivary receptors
ZHAN Ling,LIU Tianjia，FU Mingde, et al.
School of Stomatology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To investigate the conjugation specificity of Streptococcus mutans' adhesins and their salivary receptors. Methods Include purified salivary receptor or adhesin competitive bacteria adhesion inhibition test and enzyme linked immuno-receptor assay (ELIRA) on S. mutans WD9463A. Results Salivary amylases can both enhance and competitively inhibit the adhesion of the strain to HA, while IgA degraded fragments and MW=13 000 protein only promote its adhesion. P1 and a 117 000 surface protein of WD9463A both inhibit adhesion of the strain to IgA degraded fragments and salivary amylases. An 127 000 protein of WD9463A and a kind of GTFase inhibit its adhesion to IgA degraded fragments and salivary amylases respectively. No conjugation was found between IgA degraded fragments and the adhesins, while reaction between amylases and the adhesins had basically accordance with adhesion inhibition test. Conclusion The adhesion of S. mutans is a result of reaction between multireceptors and multiadhesins.
, 百拇医药
【Key words】 Streptococus，mutans Receptors，immunologic
变形链球菌(血清型C，以下简称变链)对牙面的粘附是其表面粘结素与牙面唾液获得性膜(salivary acquried pellicle, SAP)受体的特异性结合，了解其结合的特异性，可为特异性地抑制该菌在牙面的粘附、控制菌斑形成及防治龋病的发生提供理论基础。目前，对变链牙面粘附机理的研究已成为国内外龋病研究的热点，但有关粘附受体配体结合特异性的研究却很少[1，2]。我们通过对纯化变链表面粘结素及其SAP受体对变链粘附的竞争抑制实验和酶联免疫受体粘附实验，探讨了变链粘附受体配体结合的特异性，以期深入认识变链在牙面粘附初始阶段的分子机理。
材料和方法
一、变链SAP受体、表面粘结素的来源及鉴定
, http://www.100md.com
变链SAP受体从实验性SAP中纯化，变链表面粘结素从细菌培养上清中纯化，二者分别经PAGE、SDS-PAGE、IEP-PAGE确认为单一蛋白质组分。此外还采用淀粉酶活性测定、GTF活性测定、免疫双扩散实验、氨基酸组分分析以及细菌粘附或粘附竞争抑制实验鉴定、筛选受体或粘结素。我们选用了8种变链SAP受体和4种变链粘结素成分[3]进行研究，其组分名称及成分见表1、2。
表1 游离SAP组分对细菌粘附的竞争
抑制实验结果(
，cpm) 包被成分包被成分组成
阴性对照
阳性
, 百拇医药
对照
实验
组
抑制率
(%)
SAG1D1
非糖酰化淀粉酶
684
2 041
1 371
49
SAG2
糖酰化淀粉酶
, 百拇医药
684
2 168
1 074
73
SAG3
糖酰化淀粉酶
684
2 627
637
100
SBG1D1
IgA降解片段
501
, http://www.100md.com
1 288
1 089
25
SBG2D1
IgA降解片段
501
1 406
1 363
5
SBG3D1
糖酰化淀粉酶
684
2 040
, http://www.100md.com
1 066
72
SBG4
糖酰化淀粉酶
684
1 264
601
100*
SBG3D2
酸性蛋白(13 000)
501
933
960
, http://www.100md.com
0**
注：SAP：唾液获得性膜；抑制率(%)=[1-(实验组-阴性对照组)/(阳性对照组-阴性对照组)]×100%；*当实验组<阴性对照组时，抑制率为100%；**当实验组>阳性对照组时，抑制率为0表2 变链表面粘结素对其与SAP受体粘附的竞争抑制实验 抑制成分
抑制成分组成
粘附抑制率(%)
SBG1D1
SBG2D1
SBG3D1
SAG1D1
SAG3
, 百拇医药
SBG4
阳性对照组
人血清白蛋白
0
0
0
0
0
0
MD3S1
127 000糖蛋白
73
69
, http://www.100md.com
44
32
43
5
MD3S2
P1
75
77
91
99
81
81
MD3S3
GTF
, 百拇医药
47
59
94
75
61
34
MD5S1
117 000蛋白
87
50
95
91
53
, 百拇医药 70
二、细菌粘附实验
1. 细菌的培养及标记：将变链(C)地方株WD9463A接种于含370 MBq/L3H-胸腺嘧啶核苷的TPY培养基中，微需氧(80%N2、10%CO2、10%H2)37℃培养18小时，离心收集菌细胞，KCl缓冲液洗3次，将菌细胞悬浮于含5 g/L人血清白蛋白的KCl缓冲液中，550nm调A=0.62。
2. 纯SAP组分对细菌粘附的竞争抑制实验：用纯化的SAP组分(0.1 g/L)包被HA，洗3次，加人血清白蛋白封闭，后加入80 μl菌悬液和20 μl纯化SAP组分(0.5 g/L)，阳性对照组则加入菌液和20 μl 人血清白蛋白 (0.5g/L)37℃旋转1小时，洗3次后进行液闪计数，阴性对照组用KCl缓冲液包被HA，其余步骤同阳性对照组。实验均用双孔法。
, 百拇医药
3. 变链表面粘结素对细菌粘附的竞争抑制实验：用纯化SAP组分包被HA，人血清白蛋白封闭后加入纯化变链表面粘结素100 μl(0.5 g/L)，37℃旋转1小时，对照组加100 μl 人血清白蛋白，洗3次，加菌悬液100 μl，处理1小时，洗涤后进行液闪计数。阳性对照及阴性对照分别用全唾液和KCl缓冲液包被HA。实验均用双孔法。
三、间接酶联免疫受体结合实验(ELIRA)
此方法根据ELISA实验原理建立，用于直接测定变链表面蛋白与唾液受体间的结合。实验组、阴性和阳性对照组分别用100 μl 纯化SAP组分(2.5 mg/L)、包被缓冲液或纯化变链表面粘结素(10 mg/L)，4℃过夜，洗3次，1%牛血清白蛋白37℃封闭1小时，洗3次，前两组加入100 μl与阳性对照组一致的纯化变链表面粘结素，阳性对照组加入洗涤液，37℃保温1小时，洗3次后加入100 μl兔抗变链表面蛋白粗纯品血清(1:200)37℃保温2小时，洗涤, 加入100 μl HRP-羊抗兔IgG(1:5 000) 37℃保温2小时，洗5次, 加入底物液反应30 min，2 mol/L硫酸终止反应，以波长492 nm进行比色。
, 百拇医药
结果
一、纯SAP组分对变链粘附的竞争抑制实验结果
由表1可见，游离唾液淀粉酶组分可不同程度抑制变链粘附，其中SAG3和SBG4几乎可完全阻断变链粘附；而IgA降解片段及相对分子质量为13 000的酸性蛋白的作用很弱。
二、变链表面粘结素对变链粘附的竞争抑制实验结果
由表2可见，相对分子质量为127 000的表面蛋白可强烈抑制变链对IgA降解片段的粘附；蛋白P1对细菌及5种唾液成分的粘附均有较强抑制作用；GTF组分主要竞争抑制细菌与淀粉酶的粘附；相对分子质量为117 000的蛋白可强烈抑制细菌对一IgA片段及2种淀粉酶的粘附。
三、酶联免疫受体粘附实验结果
由表3可见，4种变链粘结素组份均不与SBG1D1，SBG2D1发生有效结合；MD3S2，MD3S3，MD5S1可与4种淀粉酶组份有效结合。
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表3 粘附相关蛋白ELIRA测定结果 包被成分
SBG
1D1
SBG
2D1
SBG
3D1
SBG4
SAG
1D1
SAG3
MD3S1
1.2
, 百拇医药
0.7
1.7
1.4
1.3
1.5
MD3S2
2.0
1.8
5.4
4.9
3.0
7.2
MD3S3
, 百拇医药
1.3
1.0
4.2
3.7
2.2
4.2
MD5S1
1.8
1.8
4.0
4.3
3.0
3.4
, 百拇医药
注：此表中的测定结果为阳性对照组与阴性对照组的光吸收值之比，当比值>2.1时为阳性
讨论
一、变链粘附隐匿受体的存在及唾液淀粉酶组分在其粘附中的双重作用
本研究发现，IgA降解片段及相对分子质量为13 000的酸性蛋白在吸附于HA上时可促进变链的粘附，但不竞争抑制其粘附；在直接测定变链表面蛋白与各种唾液受体间的结合关系的ELIRA实验中，它们也不与任何一种测试的变链表面粘结素成分有效结合，提示它们为变链在牙面的隐匿受体，IgA片段的促粘附作用也许不是通过抗原抗体反应进行的，它具有高度的特异性。作者在过去的研究中还发现唾液中的IgA成分呈现出多型性，而不同表型的IgA在变链粘附中的作用亦不同，IgA降解片段SBG1D1及SBG2D1可促进变链粘附，而其它IgA组分则作用很弱[3]，提示口腔内细菌产生的IgA酶的降解作用可减少SIgA的抗粘附作用，并增强它对粘附的促进作用。由于这类受体不诱导细菌凝集，故不利于细菌的清除，因此在细菌对牙面的粘附中有十分重要的作用。本实验中还发现几种唾液淀粉酶组分既能明显促进变链对HA的粘附，又可有效地竞争抑制其粘附，说明它们在变链粘附中具有双重作用。其中两种酶组分在低浓度时即可完全阻断细菌粘附，提示其抗粘附作用更为重要。
, 百拇医药
二、变链表面粘结素与其唾液受体结合特异性的初步研究
我们通过纯化变链表面粘结素对该菌与纯化SAP组分包被HA粘附的竞争抑制实验发现：变链表面相对分子质量为127 000粘结素可有效抑制该菌对唾液IgA降解片段的粘附，提示其以IgA降解片段为受体；P1和相对分子质量为117 000的表面蛋白则可同时有效抑制细菌对IgA降解片段和唾液淀粉酶组分的粘附，提示它们可能有两类受体；而GTF酶组分MD353主要抑制细菌与淀粉酶的粘附，故主要以淀粉酶为受体。这一结果提示变链在牙面的粘附是多种粘结素与多种受体共同作用的结果。
参考文献
[1] Russell MW, Mansso-Rahemtulla B. Interaction between surface protein antigens of Streptococcus mutans and human salivary components. Oral Microbiol Immunol，1989， 4:106-111.
[2] 黄定明，罗宗莲，周学东，等.变链球菌表面蛋白P1对人唾液接受器的研究.华西口腔医学杂志，1995，13：160-162.
[3] 詹玲，傅明德，刘天佳，等.变形链球菌对唾液获得性膜粘附机理的研究.Ⅱ.变形链球菌表面粘结素的筛选及分离纯化.华西口腔医学杂志，1998，16:76-79.
(收稿：1998-04-10 修回：1998-09-14), 百拇医药