内皮素-1(ET-1)在口腔粘膜下纤维性变中的表达水平
作者：许春姣 彭解英 刘蜀凡 方厂云
单位：许春姣 彭解英 刘蜀凡 方厂云 410078长沙，湖南医科大学附属湘雅医院
关键词：内皮素-1；口腔粘膜下纤维性变；形态计量学
临床口腔医学杂志990117 提 要 为探讨ET-1与口腔粘膜下纤维性变(OSF)的关系，应用免疫组化染色和图像分析技术，检测了OSF 30例、正常口腔粘膜(NOR)10例组织中ET-1的定位分布和含量。结果显示：①OSF组织中ET-1有异常表达，其免疫阳性物质主要分布于上皮棘细胞、基底细胞，间质成纤维细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞的胞浆胞膜上；②ET-1在OSF组织表达的阳性率及相对含量均显著高于NOR(P<0.01)；③OSF各期ET-1相对含量存在差别，其中早、中期上皮细胞ET-1相对含量显著高于晚期(P<0.05)。由此提示，ET-1可能参与了OSF的纤维化过程。
, http://www.100md.com
The Expression of Endothelin-1 (ET-1) in Oral Submucous Fibrosis Xu Chunjiao, et al. Department of Stomatology, Hunan Medical University,Changsha 410078
Abstract In order to urderstand whether ET-1 is involved in the pathology of oral submucous fibrosis (OSF),a sensitive immuno-histochemical and morphometric technique was adopted in the examination of the localization and content of ET-1 in oral mucosa from 30 patients with OSF, 10 normal oral mucosa. The results showed that:(1) Overexpression of ET-1 showed in mucosa from OSF, the immunostains for ET-1 were prominent within the cytoplasm and on the cell membrane of spinocells, basiocells,fibroblasts, vascular endothelial and smooth muscle cells.(2) The proportion of ET-1 positive cells and the cellular content of ET-1 in OSF was all significantly higher than that in normal control (P<0.01);(3) Difference exists between early, moderate and advanced stages OSF, while the cell contents of ET-1 in early and moderate stages were significantly higher than that in advanced stage in epithelium (P<0.05). ET-1 conld play a role in the fibrogenic process of OSF.
, http://www.100md.com
Key Words Endothelin-1 Oral submucous fibrosis Morphometry
内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)是日本学者Yanagisawa于1988年首先从猪主动脉内皮细胞培养的上清液分离纯化的血管活性多肽，是迄今所知最强的缩血管因子[1]，近年来大量资料研究表明，ET-1具有促细胞生长效应，尤其能促进与纤维化有关的细胞增殖、刺激胶原合成增加而与组织纤维化关系密切[2～8]。而有关ET-1在口腔粘膜下纤维性变(oral submucous fibrosis，OSF)的表达目前国内外尚无报道。从ET-1的多重生物效应，推测可能与OSF的纤维化的形成有关。本文采用免疫组化染色和图像分析技术检测了ET-1在OSF组织，正常口腔粘膜(normal oral mucosa,NOR)的分布和含量，从而为探讨ET-1参与OSF发病机理提供客观依据。
, http://www.100md.com
材料与方法
1. 标本收集：所有标本均来源于湖南医科大学口腔系粘膜病专科门诊。正常对照组10例取自无槟榔、烟、酒嗜好、身体健康的自愿者相应部位的颊粘膜。病变组按Pindborg病理学标准[9]及临床表现，经病理学家确诊并分期，取OSF早、中、晚期各10例。10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片，4～5μm分别作HE和免疫组化染色。
2. 免疫组化染色：采用美国PENISULALA-BORATORIES公司的兔抗人ET-1抗体和武汉博士德公司的SABC试剂盒进行。①切片脱蜡至水；②3%过氧化氢孵育5min；③PBS浸泡3×5min；④抗原微波修复，0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)95±1.0℃作用2×5min，冷却，重复③；⑤10%正常羊血清封闭37℃30min；⑥1∶500 ET-1抗体，37℃温育30min，4℃冰箱内过夜，重复③；⑦1∶100生物素标记的羊抗兔IgG,37℃温育30min，重复③；⑧1∶100SABC试剂，37℃30min，重复③；⑨新鲜配制0.04%DAB-H2O2液显色，流水冲洗；⑩苏木素复染，封片。以上步骤除注明外，均在室温下进行。每批免疫组化染色中，以正常肾上腺作为阳性对照[10]，以PBS取代ET-1抗体作为阴性对照，以正常口腔粘膜为正常对照。
, http://www.100md.com
3. 图像分析。利用MIAS-300型图像分析系统，计量分析已做过免疫组化染色的各组织标本中ET-1相对含量。将切片置于光学显微镜下成像，高分辨摄像机CCP摄像，经计算机处理后，图像分析仪显示数字图像并存储，经图像处理后测定阳性反应物的灰度值。每例随机选择测试10个高倍视野，分别记录上皮和上皮下间质细胞的平均灰度值。平均灰度值是图像分析中用来表示图像的透光率，细胞内ET-1含量高染色深，透光率低则灰度值低，反之则越大[11]。
4. 免疫组化阳性结果判断：阳性对照中，胞浆、胞膜上可见棕黄色颗粒，阴性对照中所有组织和细胞仅为淡淡的浅黄色背景染色，说明ET-1免疫组化染色具有特异性。免疫组化染色的细胞胞浆、胞膜上出现棕黄或黄色颗粒记为阳性细胞，阳性细胞数超过待标记细胞总数50%以上者，记为阳性病例。
结 果
1. ET-1在各组口腔粘膜组织的表达分布
, 百拇医药
正常口腔粘膜，1例ET-1阳性表达，仅在上皮基底层及近基层少量棘细胞胞浆中散在染色，上皮下间质基本不着色。OSF早期，7例ET-1阳性表达，棘细胞、基底细胞胞浆胞膜上均见棕黄色染色，空泡性变的棘细胞亦见棕黄染色(图1，2)，间质中成纤维细胞、血管内皮细胞胞浆胞膜亦见阳性染色，此外，血管平滑肌细胞、血管周围少量炎性细胞亦见阳性染色(图3，4)且阳性血管周围的成纤维细胞阳性反应明显。OSF中期，上皮9例ET-1阳性表达，染色范围较早期进一步扩大，棘细胞、基底细胞胞浆胞膜染色加深，间质7例阳性表达，染色强度略弱于上皮细胞。OSF晚期，上皮6例阳性表达范围及染色程度较早、中期减少，除近基层棘细胞胞膜明显深棕色外，其余细胞胞膜胞浆可见散在棕黄染色，间质细胞染色亦相应减弱。
图1 OSF早期 上皮基底细胞、棘细胞、固有层血管内皮细胞及成纤维细胞胞浆胞膜上可见ET-1棕黄染色(×400)
, http://www.100md.com
图2 OSF早期 上皮空泡性变的棘细胞ET-1染色显著增强(×400)
图3 OSF早期 粘膜下层微血管扩张、炎性细胞浸润，内皮细胞及其附近的成纤维细胞棕黄染色，少量炎性细胞亦见棕黄染色(×400)
图4 OSF早期 粘膜下层血管内皮、平滑肌细胞胞浆、胞膜上可见棕黄染色(×400)
各组口腔粘膜组织ET-1表达阳性率(表1)，OSF早、中、晚期上皮及间质细胞ET-1阳性率均显著高于正常口腔粘膜(P<0.01)，OSF组间无显著差异(P>0.05)。
表1 各组口腔粘膜组织ET-1表达水平 组织学类型
例 数
ET-1表达阳性率
, http://www.100md.com
上 皮
间 质
NOR
10
10%
0
OSF早
10
70%
70%
OSF中
10
90%
, 百拇医药 70%
OSF晚
10
60%
60%
2. ET-1在各组口腔粘膜上皮及间质细胞表达的定量分析
正常口腔粘膜平均灰度值高，ET-1相对含量则低。OSF各期与正常口腔粘膜上皮比较，平均灰度值均明显降低，即ET-1相对含量增高(P<0.01)，进一步对OSF早、中、晚期ET-1含量比较，前两者之间无显著差异(P>0.05)，OSF晚期ET-1含量显著低于早中期(P<0.01)。间质细胞(主要为成纤维细胞、内皮细胞)中，OSF组织ET-1平均灰度值明显低于正常对照，即相对含量高于正常对照(P<0.01)，组间差异不显著(P>0.05)(图5)。
, 百拇医药
图5 各组口腔粘膜上皮和间质细胞ET-1形态计量结果比较图
讨 论
OSF是一种隐匿的慢性疾病，可侵犯口腔任何部分，由于上皮下胶原纤维增多、玻璃样变以及上皮萎缩，引起粘膜硬化，形成条索，最终导致牙关紧闭，妨碍口腔各种功能的发挥。OSF病因尚不清楚，可能的影响因素有咀嚼槟榔、食辣椒、营养不良、基因易感性、自身免疫和胶原代谢紊乱等[12]。国内外学者对其病因病理等方面做了大量的研究，但尚未发现有关ET在OSF发生发展等病理过程中作用的相关研究资料，本研究首次观察研究了ET-1在OSF组织表达和分布状态，结果表明：ET-1在OSF组织表达异常增强，阳性产物主要分布于上皮棘细胞和基底细胞、间质成纤维细胞和血管内皮细胞的胞浆胞膜上，从而为人们研究OSF病变的发生发展机制提供了新的线索。
ET为21氨基酸组成的多肽，其N端氨基酸为胱氨酸，C端氨基酸为色氨酸，分子量约为2，492道尔顿，据其氨基酸顺序的差异分为ET-1、ET-2、ET-3[1]，ET-1是最早鉴定并发现，缩血管效应最高，研究最深入。大量资料显示，肺、肝、皮肤、血管等纤维化组织中ET表达高于正常水平[4～8]。体内外实验研究证实，ET可能以自分泌或旁分泌的方式作用于成纤维细胞或与TGF-β、IL-1、PDGF等[13，14]细胞因子协同作用，刺激成纤维细胞增殖，诱导胶原合成增加，降低胶原酶活性，直接或间接影响胶原合成及降解代谢，导致组织纤维化。
, 百拇医药
本研究发现，ET-1存在于成纤维细胞的胞膜胞浆内，从分子水平证实了ET-1与OSF的关系。Kawaguchi等用ELISA和RT-PCR证实，体外培养的皮肤成纤维细胞能产生ET-1蛋白[15]，其膜上亦表达ETaRmRNA[6]。由此推测，OSF中的成纤维细胞可能自身合成分泌ET-1，同时，也可能接受上皮、内皮细胞等产生的ET-1(旁分泌)，因此，ET-1可能作为一种中间介质参与OSF的纤维化过程。
Zamora用放免法及Northern杂交证实了体外培养的角朊细胞能合成、分泌ET-1[16]。本研究发现OSF口腔上皮细胞胞浆胞膜存在明显的ET-1颗粒，空泡性变棘细胞亦有明显的ET-1表达，且上皮表达强于间质，提示OSF中上皮细胞可能具有合成分泌ET的功能，胞膜上可能还存在ET-1受体。OSF中上皮细胞ET-1超量表达，是否同槟榔咀嚼物相关成分刺激有关，尚需深入研究加以证实。
, http://www.100md.com
在某些病理条件下，ET的过度合成与释放与疾病的发生发展有着密切联系，ET是某些病理过程中机体的一种内源性致病因子。Lerman等[8]免疫组化研究表明，动脉粥样硬化血管壁中，血管内皮细胞、平滑肌细胞均有ET免疫反应物，ET由损伤的血管大量释放，又反馈地损伤血管，它是血管损伤程度的一种标记物。以往研究从病理形态学证实了OSF微血管病变的存在，本研究发现，OSF中微血管内皮及平滑肌细胞ET-1表达增强，进一步从分子水平提示了OSF微血管损伤的存在。过量的ET-1与平滑肌上ET-1受体结合，使血管强烈收缩，血流供给减少而引发营养障碍，导致胶原变性、上皮萎缩；ET-1持久作用刺激平滑肌增殖，引起OSF血管的病理性狭窄、闭锁。此外，我们又发现阳性血管周围的成纤维细胞ET-1明显阳性染色。有文献显示，血管周围活性成纤维细胞表达高水平的Ⅰ、Ⅲ型胶原，血管内皮细胞可调节成纤维细胞活性[17]，因此推测，损伤的微血管内皮细胞释放的ET-1也可作用于周围的成纤维细胞。
, http://www.100md.com
本研究显示，OSF各组间也存在差别，OSF晚期上皮细胞ET-1含量显著低于早中期，可能因为纤维化早中期，细胞处于活化状态，晚期细胞活性下降，随着疾病进展，尤其到晚期，胶原等ECM成分大量堆积，血管闭锁、上皮萎缩，细胞成分明显减少，从而使ET-1结合位点随之减少[7]，也可能与晚期血管数目减少，内皮源性ET减少有关。本研究认为，ET-1与OSF组织纤维化活跃程度和发病阶段密切相关。
参 考 文 献
[1] Yanagisawa M.kurihara H, Kimuras S, et al. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells. Nature, 1988;332:411～5
[2] Guarda E, Katwa LC,Myers PR,et al.Effects of endothelins on collagen turnover in cardiac fibroblasts. Cardiovascular Res, 1993;27:2130～4
, 百拇医药
[3] Kahaleh MB. Endothelin,an endothelial-dependent vasoconstrictor in scleroderma-enhanced production and profibrotic action. Arthritis Rheum,1991;34(8):978～83
[4] Giaid A, Michel RP, Stewart DJ, et al. Expression of endothelin-1 in lungs of patients with cryptogenic fibrosing alveolitis. Lancet,1993;341:1550～4
[5] Pinzani M,Milanis, Franco RD,et al.Endothelin-1 is overexpressed in human cirrhotic liver and exerts multiple effects on activated hepatic stellate cells. Gastrogenterology,1996;110:534～48
, 百拇医药
[6] Kihuchi K,Kadono T, Sato S, et al.Impaired growth response to endothelin-1 in scleroderma fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun,1995;27(2):829～38
[7] Vancheeswaran R, Azam A, Black C, et al.Localization of endothelin-1 and its binding sites in scleroderma skin. J Rheumatol, 1994;21(7):1268～76
[8] Lerman A, Edwards BS, Hallett JW. Circulating and tissue endothelin immunoreactivity in advanced athero-sclerosis. N Engl J Med,1991;325:997～1001
, http://www.100md.com
[9] Pindborg JJ. Dral Submucous fibrosis. Oral Surg, 1966;22:764～7
[10] Li Q, Grimelius L, Zhang X, et al.Ultrastructural localization of endothelin-1 in nonneoplastic, hyperplastic,and neoplastic adoeal gland. Vitrastruet pathol,1995;19(6):489～94
[11] 杜宝东，杜波，张元德，等.增殖细胞核抗原在鼻咽癌中表达的定量研究.中华耳鼻喉科杂志，1997；32(1)：21～3
[12] Murti PR, Bhonsle RB, Gupta PC, et al.Etiology of oral submucous fibrosis with special reference to the role of area nut chewing. J Oral Pathol Med, 1995;24(4):145～52
, 百拇医药
[13] Kanse SM, Takahashi R, Lam HC,et al.Cytokine stimulated endothelin release from endothelial cells. Life Sci, 1991;48:1739～84
[14] Taffer FE, Knauss TC, Poptic E, et al.Endothelin stimulates PDGF secretion in cultured human mesangial cells. Kidney,1990;38:1193～8
[15] Kawaguchi Y, Suauki K, Hara H,et al.Increased endothelin-1 production in fibroblasts derived from patients with systemic sclerosis. Ann Rheum Dis, 1994 Aug,53(38):506～10
, 百拇医药
[16] Zomora M, Morelli JG, Norris DA, et al.Cultured human keratinocytes synthesize and secrete endothelin-1. J Invest Dermatol, 1992;98:646
[17] Scharffeter K, Buttgeret BL, Krieg T.Location ofcollagen MRNA in normal and scleroderma skin by in site hybridization. Eur J Clin Invest, 1988;18:9～17
(收稿：1998—04—04), 百拇医药
单位：许春姣 彭解英 刘蜀凡 方厂云 410078长沙，湖南医科大学附属湘雅医院
关键词：内皮素-1；口腔粘膜下纤维性变；形态计量学
临床口腔医学杂志990117 提 要 为探讨ET-1与口腔粘膜下纤维性变(OSF)的关系，应用免疫组化染色和图像分析技术，检测了OSF 30例、正常口腔粘膜(NOR)10例组织中ET-1的定位分布和含量。结果显示：①OSF组织中ET-1有异常表达，其免疫阳性物质主要分布于上皮棘细胞、基底细胞，间质成纤维细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞的胞浆胞膜上；②ET-1在OSF组织表达的阳性率及相对含量均显著高于NOR(P<0.01)；③OSF各期ET-1相对含量存在差别，其中早、中期上皮细胞ET-1相对含量显著高于晚期(P<0.05)。由此提示，ET-1可能参与了OSF的纤维化过程。
, http://www.100md.com
The Expression of Endothelin-1 (ET-1) in Oral Submucous Fibrosis Xu Chunjiao, et al. Department of Stomatology, Hunan Medical University,Changsha 410078
Abstract In order to urderstand whether ET-1 is involved in the pathology of oral submucous fibrosis (OSF),a sensitive immuno-histochemical and morphometric technique was adopted in the examination of the localization and content of ET-1 in oral mucosa from 30 patients with OSF, 10 normal oral mucosa. The results showed that:(1) Overexpression of ET-1 showed in mucosa from OSF, the immunostains for ET-1 were prominent within the cytoplasm and on the cell membrane of spinocells, basiocells,fibroblasts, vascular endothelial and smooth muscle cells.(2) The proportion of ET-1 positive cells and the cellular content of ET-1 in OSF was all significantly higher than that in normal control (P<0.01);(3) Difference exists between early, moderate and advanced stages OSF, while the cell contents of ET-1 in early and moderate stages were significantly higher than that in advanced stage in epithelium (P<0.05). ET-1 conld play a role in the fibrogenic process of OSF.
, http://www.100md.com
Key Words Endothelin-1 Oral submucous fibrosis Morphometry
内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)是日本学者Yanagisawa于1988年首先从猪主动脉内皮细胞培养的上清液分离纯化的血管活性多肽，是迄今所知最强的缩血管因子[1]，近年来大量资料研究表明，ET-1具有促细胞生长效应，尤其能促进与纤维化有关的细胞增殖、刺激胶原合成增加而与组织纤维化关系密切[2～8]。而有关ET-1在口腔粘膜下纤维性变(oral submucous fibrosis，OSF)的表达目前国内外尚无报道。从ET-1的多重生物效应，推测可能与OSF的纤维化的形成有关。本文采用免疫组化染色和图像分析技术检测了ET-1在OSF组织，正常口腔粘膜(normal oral mucosa,NOR)的分布和含量，从而为探讨ET-1参与OSF发病机理提供客观依据。
, http://www.100md.com
材料与方法
1. 标本收集：所有标本均来源于湖南医科大学口腔系粘膜病专科门诊。正常对照组10例取自无槟榔、烟、酒嗜好、身体健康的自愿者相应部位的颊粘膜。病变组按Pindborg病理学标准[9]及临床表现，经病理学家确诊并分期，取OSF早、中、晚期各10例。10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片，4～5μm分别作HE和免疫组化染色。
2. 免疫组化染色：采用美国PENISULALA-BORATORIES公司的兔抗人ET-1抗体和武汉博士德公司的SABC试剂盒进行。①切片脱蜡至水；②3%过氧化氢孵育5min；③PBS浸泡3×5min；④抗原微波修复，0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)95±1.0℃作用2×5min，冷却，重复③；⑤10%正常羊血清封闭37℃30min；⑥1∶500 ET-1抗体，37℃温育30min，4℃冰箱内过夜，重复③；⑦1∶100生物素标记的羊抗兔IgG,37℃温育30min，重复③；⑧1∶100SABC试剂，37℃30min，重复③；⑨新鲜配制0.04%DAB-H2O2液显色，流水冲洗；⑩苏木素复染，封片。以上步骤除注明外，均在室温下进行。每批免疫组化染色中，以正常肾上腺作为阳性对照[10]，以PBS取代ET-1抗体作为阴性对照，以正常口腔粘膜为正常对照。
, http://www.100md.com
3. 图像分析。利用MIAS-300型图像分析系统，计量分析已做过免疫组化染色的各组织标本中ET-1相对含量。将切片置于光学显微镜下成像，高分辨摄像机CCP摄像，经计算机处理后，图像分析仪显示数字图像并存储，经图像处理后测定阳性反应物的灰度值。每例随机选择测试10个高倍视野，分别记录上皮和上皮下间质细胞的平均灰度值。平均灰度值是图像分析中用来表示图像的透光率，细胞内ET-1含量高染色深，透光率低则灰度值低，反之则越大[11]。
4. 免疫组化阳性结果判断：阳性对照中，胞浆、胞膜上可见棕黄色颗粒，阴性对照中所有组织和细胞仅为淡淡的浅黄色背景染色，说明ET-1免疫组化染色具有特异性。免疫组化染色的细胞胞浆、胞膜上出现棕黄或黄色颗粒记为阳性细胞，阳性细胞数超过待标记细胞总数50%以上者，记为阳性病例。
结 果
1. ET-1在各组口腔粘膜组织的表达分布
, 百拇医药
正常口腔粘膜，1例ET-1阳性表达，仅在上皮基底层及近基层少量棘细胞胞浆中散在染色，上皮下间质基本不着色。OSF早期，7例ET-1阳性表达，棘细胞、基底细胞胞浆胞膜上均见棕黄色染色，空泡性变的棘细胞亦见棕黄染色(图1，2)，间质中成纤维细胞、血管内皮细胞胞浆胞膜亦见阳性染色，此外，血管平滑肌细胞、血管周围少量炎性细胞亦见阳性染色(图3，4)且阳性血管周围的成纤维细胞阳性反应明显。OSF中期，上皮9例ET-1阳性表达，染色范围较早期进一步扩大，棘细胞、基底细胞胞浆胞膜染色加深，间质7例阳性表达，染色强度略弱于上皮细胞。OSF晚期，上皮6例阳性表达范围及染色程度较早、中期减少，除近基层棘细胞胞膜明显深棕色外，其余细胞胞膜胞浆可见散在棕黄染色，间质细胞染色亦相应减弱。
图1 OSF早期 上皮基底细胞、棘细胞、固有层血管内皮细胞及成纤维细胞胞浆胞膜上可见ET-1棕黄染色(×400)
, http://www.100md.com
图2 OSF早期 上皮空泡性变的棘细胞ET-1染色显著增强(×400)
图3 OSF早期 粘膜下层微血管扩张、炎性细胞浸润，内皮细胞及其附近的成纤维细胞棕黄染色，少量炎性细胞亦见棕黄染色(×400)
图4 OSF早期 粘膜下层血管内皮、平滑肌细胞胞浆、胞膜上可见棕黄染色(×400)
各组口腔粘膜组织ET-1表达阳性率(表1)，OSF早、中、晚期上皮及间质细胞ET-1阳性率均显著高于正常口腔粘膜(P<0.01)，OSF组间无显著差异(P>0.05)。
表1 各组口腔粘膜组织ET-1表达水平 组织学类型
例 数
ET-1表达阳性率
, http://www.100md.com
上 皮
间 质
NOR
10
10%
0
OSF早
10
70%
70%
OSF中
10
90%
, 百拇医药 70%
OSF晚
10
60%
60%
2. ET-1在各组口腔粘膜上皮及间质细胞表达的定量分析
正常口腔粘膜平均灰度值高，ET-1相对含量则低。OSF各期与正常口腔粘膜上皮比较，平均灰度值均明显降低，即ET-1相对含量增高(P<0.01)，进一步对OSF早、中、晚期ET-1含量比较，前两者之间无显著差异(P>0.05)，OSF晚期ET-1含量显著低于早中期(P<0.01)。间质细胞(主要为成纤维细胞、内皮细胞)中，OSF组织ET-1平均灰度值明显低于正常对照，即相对含量高于正常对照(P<0.01)，组间差异不显著(P>0.05)(图5)。
, 百拇医药
图5 各组口腔粘膜上皮和间质细胞ET-1形态计量结果比较图
讨 论
OSF是一种隐匿的慢性疾病，可侵犯口腔任何部分，由于上皮下胶原纤维增多、玻璃样变以及上皮萎缩，引起粘膜硬化，形成条索，最终导致牙关紧闭，妨碍口腔各种功能的发挥。OSF病因尚不清楚，可能的影响因素有咀嚼槟榔、食辣椒、营养不良、基因易感性、自身免疫和胶原代谢紊乱等[12]。国内外学者对其病因病理等方面做了大量的研究，但尚未发现有关ET在OSF发生发展等病理过程中作用的相关研究资料，本研究首次观察研究了ET-1在OSF组织表达和分布状态，结果表明：ET-1在OSF组织表达异常增强，阳性产物主要分布于上皮棘细胞和基底细胞、间质成纤维细胞和血管内皮细胞的胞浆胞膜上，从而为人们研究OSF病变的发生发展机制提供了新的线索。
ET为21氨基酸组成的多肽，其N端氨基酸为胱氨酸，C端氨基酸为色氨酸，分子量约为2，492道尔顿，据其氨基酸顺序的差异分为ET-1、ET-2、ET-3[1]，ET-1是最早鉴定并发现，缩血管效应最高，研究最深入。大量资料显示，肺、肝、皮肤、血管等纤维化组织中ET表达高于正常水平[4～8]。体内外实验研究证实，ET可能以自分泌或旁分泌的方式作用于成纤维细胞或与TGF-β、IL-1、PDGF等[13，14]细胞因子协同作用，刺激成纤维细胞增殖，诱导胶原合成增加，降低胶原酶活性，直接或间接影响胶原合成及降解代谢，导致组织纤维化。
, 百拇医药
本研究发现，ET-1存在于成纤维细胞的胞膜胞浆内，从分子水平证实了ET-1与OSF的关系。Kawaguchi等用ELISA和RT-PCR证实，体外培养的皮肤成纤维细胞能产生ET-1蛋白[15]，其膜上亦表达ETaRmRNA[6]。由此推测，OSF中的成纤维细胞可能自身合成分泌ET-1，同时，也可能接受上皮、内皮细胞等产生的ET-1(旁分泌)，因此，ET-1可能作为一种中间介质参与OSF的纤维化过程。
Zamora用放免法及Northern杂交证实了体外培养的角朊细胞能合成、分泌ET-1[16]。本研究发现OSF口腔上皮细胞胞浆胞膜存在明显的ET-1颗粒，空泡性变棘细胞亦有明显的ET-1表达，且上皮表达强于间质，提示OSF中上皮细胞可能具有合成分泌ET的功能，胞膜上可能还存在ET-1受体。OSF中上皮细胞ET-1超量表达，是否同槟榔咀嚼物相关成分刺激有关，尚需深入研究加以证实。
, http://www.100md.com
在某些病理条件下，ET的过度合成与释放与疾病的发生发展有着密切联系，ET是某些病理过程中机体的一种内源性致病因子。Lerman等[8]免疫组化研究表明，动脉粥样硬化血管壁中，血管内皮细胞、平滑肌细胞均有ET免疫反应物，ET由损伤的血管大量释放，又反馈地损伤血管，它是血管损伤程度的一种标记物。以往研究从病理形态学证实了OSF微血管病变的存在，本研究发现，OSF中微血管内皮及平滑肌细胞ET-1表达增强，进一步从分子水平提示了OSF微血管损伤的存在。过量的ET-1与平滑肌上ET-1受体结合，使血管强烈收缩，血流供给减少而引发营养障碍，导致胶原变性、上皮萎缩；ET-1持久作用刺激平滑肌增殖，引起OSF血管的病理性狭窄、闭锁。此外，我们又发现阳性血管周围的成纤维细胞ET-1明显阳性染色。有文献显示，血管周围活性成纤维细胞表达高水平的Ⅰ、Ⅲ型胶原，血管内皮细胞可调节成纤维细胞活性[17]，因此推测，损伤的微血管内皮细胞释放的ET-1也可作用于周围的成纤维细胞。
, http://www.100md.com
本研究显示，OSF各组间也存在差别，OSF晚期上皮细胞ET-1含量显著低于早中期，可能因为纤维化早中期，细胞处于活化状态，晚期细胞活性下降，随着疾病进展，尤其到晚期，胶原等ECM成分大量堆积，血管闭锁、上皮萎缩，细胞成分明显减少，从而使ET-1结合位点随之减少[7]，也可能与晚期血管数目减少，内皮源性ET减少有关。本研究认为，ET-1与OSF组织纤维化活跃程度和发病阶段密切相关。
参 考 文 献
[1] Yanagisawa M.kurihara H, Kimuras S, et al. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells. Nature, 1988;332:411～5
[2] Guarda E, Katwa LC,Myers PR,et al.Effects of endothelins on collagen turnover in cardiac fibroblasts. Cardiovascular Res, 1993;27:2130～4
, 百拇医药
[3] Kahaleh MB. Endothelin,an endothelial-dependent vasoconstrictor in scleroderma-enhanced production and profibrotic action. Arthritis Rheum,1991;34(8):978～83
[4] Giaid A, Michel RP, Stewart DJ, et al. Expression of endothelin-1 in lungs of patients with cryptogenic fibrosing alveolitis. Lancet,1993;341:1550～4
[5] Pinzani M,Milanis, Franco RD,et al.Endothelin-1 is overexpressed in human cirrhotic liver and exerts multiple effects on activated hepatic stellate cells. Gastrogenterology,1996;110:534～48
, 百拇医药
[6] Kihuchi K,Kadono T, Sato S, et al.Impaired growth response to endothelin-1 in scleroderma fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun,1995;27(2):829～38
[7] Vancheeswaran R, Azam A, Black C, et al.Localization of endothelin-1 and its binding sites in scleroderma skin. J Rheumatol, 1994;21(7):1268～76
[8] Lerman A, Edwards BS, Hallett JW. Circulating and tissue endothelin immunoreactivity in advanced athero-sclerosis. N Engl J Med,1991;325:997～1001
, http://www.100md.com
[9] Pindborg JJ. Dral Submucous fibrosis. Oral Surg, 1966;22:764～7
[10] Li Q, Grimelius L, Zhang X, et al.Ultrastructural localization of endothelin-1 in nonneoplastic, hyperplastic,and neoplastic adoeal gland. Vitrastruet pathol,1995;19(6):489～94
[11] 杜宝东，杜波，张元德，等.增殖细胞核抗原在鼻咽癌中表达的定量研究.中华耳鼻喉科杂志，1997；32(1)：21～3
[12] Murti PR, Bhonsle RB, Gupta PC, et al.Etiology of oral submucous fibrosis with special reference to the role of area nut chewing. J Oral Pathol Med, 1995;24(4):145～52
, 百拇医药
[13] Kanse SM, Takahashi R, Lam HC,et al.Cytokine stimulated endothelin release from endothelial cells. Life Sci, 1991;48:1739～84
[14] Taffer FE, Knauss TC, Poptic E, et al.Endothelin stimulates PDGF secretion in cultured human mesangial cells. Kidney,1990;38:1193～8
[15] Kawaguchi Y, Suauki K, Hara H,et al.Increased endothelin-1 production in fibroblasts derived from patients with systemic sclerosis. Ann Rheum Dis, 1994 Aug,53(38):506～10
, 百拇医药
[16] Zomora M, Morelli JG, Norris DA, et al.Cultured human keratinocytes synthesize and secrete endothelin-1. J Invest Dermatol, 1992;98:646
[17] Scharffeter K, Buttgeret BL, Krieg T.Location ofcollagen MRNA in normal and scleroderma skin by in site hybridization. Eur J Clin Invest, 1988;18:9～17
(收稿：1998—04—04), 百拇医药