紫外线对角膜内抗氧化酶mRNA表达的影响
作者：刘 莹 董东生 陆爱丽 侯纬敏
单位：刘 莹 董东生(北京同仁医院眼科,100730)；陆爱丽 侯纬敏(北京医科大学生化与分子生物学系)
关键词：角膜；紫外线；谷胱甘肽过氧化物酶；RNA；信使；聚合酶链反应；超氧化物歧化酶；过氧化氢酶
紫外线对角膜内抗氧化酶mRNA表达的影响 刘 莹 董东生 陆爱丽 摘 要 为了进一步从基因水平探讨紫外线的损伤机制，我们采用RT-PCR方法，用紫外线照射大鼠角膜，检测大鼠角膜内三种抗氧化酶：谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，铜锌-超氧化物歧化酶(Cu、Zn-SOD)，过氧化氢酶(CAT)mRNA的表达。结果显示，照射早期，三种抗氧化酶mRNA表达均升高，GSH-Px和SOD的表达高点为照射5min，CAT的表达高点为照射2min；照射晚期，照射15min，三种酶的mRNA表达明显下降(P<0.05)，照射后48h，三种抗氧化酶的表达基本恢复正常。由此可见，紫外线可影响大鼠角膜内抗氧化酶mRNA的表达，而且角膜有能力修复这种损伤。作为对照的6磷酸葡萄糖脱氢酶G6PD在照射前后没有明显的变化。
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分类号 R772
mRNA expression level of antioxidant related enzymes in rat corneas after
UV irradiation/Liu Ying...∥Ophthalmol CHN.-1999，8(1).-56～58(Department
of Ophthalmology，Tong Ren Hospital，Beijing 100730)
In order to study the mechanism of UV damage，we adopted RT-PCR method to study the mRNA expression level of antioxidant related enzymes including glutathione peroxidase(GSH-Px)，Copper，Zine-superoxide dismutase (Cu，Zn-SOD) and catalase (CAT) in rat corneas，and compared them with that of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD).G3PDH was used for internal control.We used Wistar rat corneas，ultraviolet wavelength of 260-365nm，optical density of 400μ w/cm2，radiation time with four points：2，5，10，15mins.The results showed that when rat cornea was exposed to UV irradiation，the mRNA expression level of GSH-Px，Cu，Zn-SOD and CAT increased significantly (P<0.05)within 5 mins，but after 5 mins，it began to decrease even after 15 mins as we observed.However，the mRNA expression level of G6PD keeped unchanged.After 48 hours of recovery，their mRNA expression level reached normal level.
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Subject terms Cornea；Ultraviolet rays；Glutathione peroxidase；RNA，messenger；Polymerase chain reaction；Superoxide dismutase;Catalase
随着现代工业的发展以及环保方面日益严重的问题，如臭氧层的不断减少，紫外线对人体的损害日益受到关注，首先是暴露于空气中的眼和皮肤最易遭到损伤。长期、慢性的紫外线辐射与角膜的变性疾病有关，阈上辐射量可造成电光性眼炎。文献报道，角膜的脂滴样变性是一种与紫外线辐射有关的角膜变性[1]，白内障的发生、发展以及年龄相关性黄斑变性等都与长期的紫外线辐射有关。与过氧化反应关系密切的主要有三种抗氧化酶：谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、铜锌-超氧化物歧化酶(copper，zine-superoxide dismutase，Cu、Zn-SOD)和过氧化氢酶(catalase，CAT)，国内外学者就有关方面已经作了大量的研究，他们主要是利用生化及组化的方法来测定紫外线对这三种抗氧化酶活性的影响，紫外线可致这三种抗氧化酶的活性减低，而同时过氧化物的生成量增加[2，3]。为了进一步探讨紫外线的损伤机制，我们利用RT-PCR方法研究经紫外线照射后，大鼠角膜内此三种抗氧化酶的mRNA的表达，用6磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)作为对照，用3-磷酸甘油醛脱氢酶(G3PDH)为内参，从基因表达水平探讨损伤机制，方法更为灵敏，类似的研究在国内外尚未见报道。
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1 材料和方法
1.1 实验动物 Wistar大鼠由北京医科大学实验动物部提供，体重100～150g，断脊髓处死。
1.2 紫外光源 波长范围为260～365nm，照射强度为400μ W/cm2。
1.3 分组 照射时间取四个时间点：照射2、5、10、15min，分三组：(1)照射后即刻处死，测GSH-Px、SOD、CAT、G6PD mRNA的表达。(2)照射后24h，测GSH-Px、SOD、CAT、G6PD mRNA的表达。(3)照射后48h，测GSH-Px、SOD、CAT、G6PD mRNA的表达。
1.4 实验方法
1.4.1 提取总RNA取下的两个角膜放入匀浆器内进行匀浆，用TRIZOL试剂提取总RNA，整个实验过程必须严格无菌操作，戴手套，以防RNAase污染。
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1.4.2 RNA纯度及含量的测定及完整性的鉴定其A260/A280值应在1.7～2.0范围内；RNA甲醛变性电泳有三条清晰的带：28S、18S、5S，说明RNA是完整的，满足RT-PCR的要求。
1.4.3 反转录制备cDNA 总反应体积40μl，5μgRNA，oligo(dt)16为引物，SuperScriptⅡ反转录酶。
1.4.4 PCR 以cDNA为模板，用各自酶的5′、3′端引物，每个反应管同加入G3PDH的5′、3′端引物扩增G3PDH，作为内参。PCR的反应条件是：94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min30s，25次循环后，再行72℃延伸15min。根据四种酶的cDNA序列，按引物设计原则设计四种酶的5′端和3′端引物，由中科院生物所和上海生工生物公司分别合成。
引物
, 百拇医药
扩增片
段长度
(bp)
GSH-Px primer：5′-GCGGAATTCATGTCTGCTGC
TCGGCTCTCC-3′
5′-GCGGGATCCTTAGGGGTT
GCTAGGCTGCTT-3′
606
CuZn-SOD primer：5′-GCGGAATTCATGGCGATG
AAGGCCGTGTGC-3′
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5′-GCGGGATCCTTATTGGGCA
ATCCCAATCAC-3′
465
CAT primer：5′-GCGGAATTCTTCTTCATCAG
GGATGCCATG-3′
5′-GCGGGATCCAGGATTTCTGT
TTAAGACCAG-3′
501
G6PD primer：5′-GCGGAATTCGAGAATGAACG
GTGGGATGGA-3′
, 百拇医药
5′-GCGGGATCCTCAGAGCTTGTGA
GGGTTCAC-3′
515
反应在PE480DNA扩增仪上进行。
1.4.5 PCR产物的定量 10μl PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，经EB染色，紫外灯下观察电泳条带并照相，然后对底片上的电泳条带进行辉度扫描，测其综合光密度值(IOD)，四种酶GSH-Px、SOD、CAT、G6PD的量用各自PCR的产物量分别与G3PDH的PCR产物量的比值来表示，以进一步减少误差。
2 结果
2.1 RNA的纯度及完整性的检测利用紫外分光光度仪测RNA的A260/A280值在1.59-1.83之间；其甲醛变性电泳的28S，18S，5S带清晰(图1)。
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2.2 作为内参的G3PDH无论是在对照组还是在实验组表达基本恒定。
2.3 正常大鼠角膜中GSH-Px，SOD，CAT，
表1 紫外线照射后四种酶的即刻mRNA表达水平
Antioxidant
enzymes(IOD)/
G3PDH(IOD)
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照射时间
Control
2min
5min
10min
15min
GSH-Px/G3PDH
0.23±0.05
0.32±0.08b
0.40±0.04a
0.17±0.04b
, 百拇医药
0.12±0.03b
SOD/G3PDH
0.69±0.04
0.58±0.07
1.05±0.18a
0.43±0.08a
0.21±0.02a
CAT/G3PDH
0.88±0.06
1.33±0.21a
, 百拇医药
0.91±0.18
0.55±0.11a
0.33±0.04a
G6PD/G3PDH
0.75±0.10
0.73±0.08
0.72±0.06
0.71±0.08
0.76±0.09
a：P<0.001 b：P<0.05
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统计方法：Newman-Keuls test
图4 紫外线照射后GSH-Px，SOD，CAT和
G6PD的mRNA表达情况
2.4 实验结果短时间的照射，抗氧化酶的mRNA表达水平增高，GSH-Px和SOD的最高点为照射5min
(图3a，b)、CAT照射2min表达最高(图3c)；照射10min，抗氧化酶的mRNA表达下降，照射15min，mRNA的表达下降更为明显(图3，4)，与对照组相比，有显著性差异(P<0.05，表1)。照射后24h，mRNA的表达恢复不稳定；照射后48h，抗氧化酶的mRNA表达基本恢复，与对照组相比，无显著性差异(P>0.05，图5)。G6PD在照射前后没有明显的改变。
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3 讨论
我们推测，紫外线照射角膜，早期可使与过氧化有关的酶类(GSH-Px、SOD、CAT)的mRNA表达反应性增高，是机体的一种保护性反应，可能与紫外线激活了转录因子c-Jun、c-Fos、NFkB等有关[4-6]。后期抗氧化酶的mRNA表达水平明显下降，可能为紫外线及活性氧破坏了酶的一级、二级结构[7]，直接损伤了DNA，使之成为二聚体结构，影响转录；也可能与细胞凋亡有关，从而影响了角膜抵御氧化的能力。细胞凋亡是一种基因控制的细胞程序性死亡，文献报道，人的角膜细胞系表达CD95表面分子，紫外线可以直接激活CD95途径，诱导细胞发生凋亡[8]。活性氧也可通过各种途径诱导细胞凋亡[9]，它可以直接损伤DNA，攻击蛋白质，使具有酶活性的蛋白质失活，也可以通过影响基因转录，改变细胞的表型特征，激发有关的调控基因，诱导细胞发生凋亡。照射后48小时，角膜内抗氧化酶mRNA的表达基本恢复正常，说明角膜上皮细胞有能力修复紫外线引起的损伤。G6PD是糖代谢途径的酶，不参与机体的过氧化反应，其基因属于看家基因，因此，在照射的15min内，未见G6PDmRNA表达的改变。紫外线的光化学损伤机制很复杂，还有待进一步的探讨。
, 百拇医药
4 参考文献
[1] Taylor HR，West SK，Posenthal FS，et al.Corneal changes associated with chronic
UV irradiation.Arch Ophthalmol，1989，107：1461.
[2] Cejkova J，Lojda E.The damaging effect of UV rays(with the wavelength shorter
than 320nm)on the rabbit anterior eye segment.I.Early changes and their preve
ntion by cata
, 百拇医药
lase-aprotinin application.Acta Histochem，1994，96(3)：281.
[3] 李 林，胡椿枝.电光性眼炎与脂质过氧化反应间关系的实验研究.眼外伤职业眼病杂志，1991，3：149.
[4] Hass S，Kaina B.C-fos is involved in the celluar defence against the genotoxic effect ofUV radiation.Carcinogenesis，1995，16(5)：985.
[5] Djavaheri-Mergny M，Mergny JL，Bertrand F.Ultraviolet A induces activation of Ap-1 in cultured human keratinocytes. FEBS Lett，1996，384(1)：92.
, 百拇医药
[6] Meyer M，Pahl HL，Baeuerle PA.Regulation of the transcription factors NF-KB and AP1 by redox changes.Chem Biol Interact，1994，91(2-3)：91.
[7] 李培峰， 方允中， 陈吉中， 等。 过氧化氢对铜锌超氧化物歧化酶结构损伤作用的进一步研究.生物化学杂志，1993，9(4)：417.
[8] Aragane Y，Kulms D，Metzed. Ultraviolet light induces apoptosis via direct activation of CD95(Fas/APO-1)independently of its ligand CD95L. J Cell Biol，1998，140(1)：171.
[9] 李忌，郑荣梁.活性氧诱导细胞凋亡.细胞生物学杂志，1997，19(3)：115.
(1998-09-10收稿，1998-11-02修回)
, 百拇医药
单位：刘 莹 董东生(北京同仁医院眼科,100730)；陆爱丽 侯纬敏(北京医科大学生化与分子生物学系)
关键词：角膜；紫外线；谷胱甘肽过氧化物酶；RNA；信使；聚合酶链反应；超氧化物歧化酶；过氧化氢酶
紫外线对角膜内抗氧化酶mRNA表达的影响 刘 莹 董东生 陆爱丽 摘 要 为了进一步从基因水平探讨紫外线的损伤机制，我们采用RT-PCR方法，用紫外线照射大鼠角膜，检测大鼠角膜内三种抗氧化酶：谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，铜锌-超氧化物歧化酶(Cu、Zn-SOD)，过氧化氢酶(CAT)mRNA的表达。结果显示，照射早期，三种抗氧化酶mRNA表达均升高，GSH-Px和SOD的表达高点为照射5min，CAT的表达高点为照射2min；照射晚期，照射15min，三种酶的mRNA表达明显下降(P<0.05)，照射后48h，三种抗氧化酶的表达基本恢复正常。由此可见，紫外线可影响大鼠角膜内抗氧化酶mRNA的表达，而且角膜有能力修复这种损伤。作为对照的6磷酸葡萄糖脱氢酶G6PD在照射前后没有明显的变化。
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mRNA expression level of antioxidant related enzymes in rat corneas after
UV irradiation/Liu Ying...∥Ophthalmol CHN.-1999，8(1).-56～58(Department
of Ophthalmology，Tong Ren Hospital，Beijing 100730)
In order to study the mechanism of UV damage，we adopted RT-PCR method to study the mRNA expression level of antioxidant related enzymes including glutathione peroxidase(GSH-Px)，Copper，Zine-superoxide dismutase (Cu，Zn-SOD) and catalase (CAT) in rat corneas，and compared them with that of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD).G3PDH was used for internal control.We used Wistar rat corneas，ultraviolet wavelength of 260-365nm，optical density of 400μ w/cm2，radiation time with four points：2，5，10，15mins.The results showed that when rat cornea was exposed to UV irradiation，the mRNA expression level of GSH-Px，Cu，Zn-SOD and CAT increased significantly (P<0.05)within 5 mins，but after 5 mins，it began to decrease even after 15 mins as we observed.However，the mRNA expression level of G6PD keeped unchanged.After 48 hours of recovery，their mRNA expression level reached normal level.
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Subject terms Cornea；Ultraviolet rays；Glutathione peroxidase；RNA，messenger；Polymerase chain reaction；Superoxide dismutase;Catalase
随着现代工业的发展以及环保方面日益严重的问题，如臭氧层的不断减少，紫外线对人体的损害日益受到关注，首先是暴露于空气中的眼和皮肤最易遭到损伤。长期、慢性的紫外线辐射与角膜的变性疾病有关，阈上辐射量可造成电光性眼炎。文献报道，角膜的脂滴样变性是一种与紫外线辐射有关的角膜变性[1]，白内障的发生、发展以及年龄相关性黄斑变性等都与长期的紫外线辐射有关。与过氧化反应关系密切的主要有三种抗氧化酶：谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、铜锌-超氧化物歧化酶(copper，zine-superoxide dismutase，Cu、Zn-SOD)和过氧化氢酶(catalase，CAT)，国内外学者就有关方面已经作了大量的研究，他们主要是利用生化及组化的方法来测定紫外线对这三种抗氧化酶活性的影响，紫外线可致这三种抗氧化酶的活性减低，而同时过氧化物的生成量增加[2，3]。为了进一步探讨紫外线的损伤机制，我们利用RT-PCR方法研究经紫外线照射后，大鼠角膜内此三种抗氧化酶的mRNA的表达，用6磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)作为对照，用3-磷酸甘油醛脱氢酶(G3PDH)为内参，从基因表达水平探讨损伤机制，方法更为灵敏，类似的研究在国内外尚未见报道。
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1 材料和方法
1.1 实验动物 Wistar大鼠由北京医科大学实验动物部提供，体重100～150g，断脊髓处死。
1.2 紫外光源 波长范围为260～365nm，照射强度为400μ W/cm2。
1.3 分组 照射时间取四个时间点：照射2、5、10、15min，分三组：(1)照射后即刻处死，测GSH-Px、SOD、CAT、G6PD mRNA的表达。(2)照射后24h，测GSH-Px、SOD、CAT、G6PD mRNA的表达。(3)照射后48h，测GSH-Px、SOD、CAT、G6PD mRNA的表达。
1.4 实验方法
1.4.1 提取总RNA取下的两个角膜放入匀浆器内进行匀浆，用TRIZOL试剂提取总RNA，整个实验过程必须严格无菌操作，戴手套，以防RNAase污染。
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1.4.2 RNA纯度及含量的测定及完整性的鉴定其A260/A280值应在1.7～2.0范围内；RNA甲醛变性电泳有三条清晰的带：28S、18S、5S，说明RNA是完整的，满足RT-PCR的要求。
1.4.3 反转录制备cDNA 总反应体积40μl，5μgRNA，oligo(dt)16为引物，SuperScriptⅡ反转录酶。
1.4.4 PCR 以cDNA为模板，用各自酶的5′、3′端引物，每个反应管同加入G3PDH的5′、3′端引物扩增G3PDH，作为内参。PCR的反应条件是：94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min30s，25次循环后，再行72℃延伸15min。根据四种酶的cDNA序列，按引物设计原则设计四种酶的5′端和3′端引物，由中科院生物所和上海生工生物公司分别合成。
引物
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扩增片
段长度
(bp)
GSH-Px primer：5′-GCGGAATTCATGTCTGCTGC
TCGGCTCTCC-3′
5′-GCGGGATCCTTAGGGGTT
GCTAGGCTGCTT-3′
606
CuZn-SOD primer：5′-GCGGAATTCATGGCGATG
AAGGCCGTGTGC-3′
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5′-GCGGGATCCTTATTGGGCA
ATCCCAATCAC-3′
465
CAT primer：5′-GCGGAATTCTTCTTCATCAG
GGATGCCATG-3′
5′-GCGGGATCCAGGATTTCTGT
TTAAGACCAG-3′
501
G6PD primer：5′-GCGGAATTCGAGAATGAACG
GTGGGATGGA-3′
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5′-GCGGGATCCTCAGAGCTTGTGA
GGGTTCAC-3′
515
反应在PE480DNA扩增仪上进行。
1.4.5 PCR产物的定量 10μl PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，经EB染色，紫外灯下观察电泳条带并照相，然后对底片上的电泳条带进行辉度扫描，测其综合光密度值(IOD)，四种酶GSH-Px、SOD、CAT、G6PD的量用各自PCR的产物量分别与G3PDH的PCR产物量的比值来表示，以进一步减少误差。
2 结果
2.1 RNA的纯度及完整性的检测利用紫外分光光度仪测RNA的A260/A280值在1.59-1.83之间；其甲醛变性电泳的28S，18S，5S带清晰(图1)。
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2.2 作为内参的G3PDH无论是在对照组还是在实验组表达基本恒定。
2.3 正常大鼠角膜中GSH-Px，SOD，CAT，
表1 紫外线照射后四种酶的即刻mRNA表达水平
Antioxidant
enzymes(IOD)/
G3PDH(IOD)
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照射时间
Control
2min
5min
10min
15min
GSH-Px/G3PDH
0.23±0.05
0.32±0.08b
0.40±0.04a
0.17±0.04b
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0.12±0.03b
SOD/G3PDH
0.69±0.04
0.58±0.07
1.05±0.18a
0.43±0.08a
0.21±0.02a
CAT/G3PDH
0.88±0.06
1.33±0.21a
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0.91±0.18
0.55±0.11a
0.33±0.04a
G6PD/G3PDH
0.75±0.10
0.73±0.08
0.72±0.06
0.71±0.08
0.76±0.09
a：P<0.001 b：P<0.05
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图4 紫外线照射后GSH-Px，SOD，CAT和
G6PD的mRNA表达情况
2.4 实验结果短时间的照射，抗氧化酶的mRNA表达水平增高，GSH-Px和SOD的最高点为照射5min
(图3a，b)、CAT照射2min表达最高(图3c)；照射10min，抗氧化酶的mRNA表达下降，照射15min，mRNA的表达下降更为明显(图3，4)，与对照组相比，有显著性差异(P<0.05，表1)。照射后24h，mRNA的表达恢复不稳定；照射后48h，抗氧化酶的mRNA表达基本恢复，与对照组相比，无显著性差异(P>0.05，图5)。G6PD在照射前后没有明显的改变。
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3 讨论
我们推测，紫外线照射角膜，早期可使与过氧化有关的酶类(GSH-Px、SOD、CAT)的mRNA表达反应性增高，是机体的一种保护性反应，可能与紫外线激活了转录因子c-Jun、c-Fos、NFkB等有关[4-6]。后期抗氧化酶的mRNA表达水平明显下降，可能为紫外线及活性氧破坏了酶的一级、二级结构[7]，直接损伤了DNA，使之成为二聚体结构，影响转录；也可能与细胞凋亡有关，从而影响了角膜抵御氧化的能力。细胞凋亡是一种基因控制的细胞程序性死亡，文献报道，人的角膜细胞系表达CD95表面分子，紫外线可以直接激活CD95途径，诱导细胞发生凋亡[8]。活性氧也可通过各种途径诱导细胞凋亡[9]，它可以直接损伤DNA，攻击蛋白质，使具有酶活性的蛋白质失活，也可以通过影响基因转录，改变细胞的表型特征，激发有关的调控基因，诱导细胞发生凋亡。照射后48小时，角膜内抗氧化酶mRNA的表达基本恢复正常，说明角膜上皮细胞有能力修复紫外线引起的损伤。G6PD是糖代谢途径的酶，不参与机体的过氧化反应，其基因属于看家基因，因此，在照射的15min内，未见G6PDmRNA表达的改变。紫外线的光化学损伤机制很复杂，还有待进一步的探讨。
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4 参考文献
[1] Taylor HR，West SK，Posenthal FS，et al.Corneal changes associated with chronic
UV irradiation.Arch Ophthalmol，1989，107：1461.
[2] Cejkova J，Lojda E.The damaging effect of UV rays(with the wavelength shorter
than 320nm)on the rabbit anterior eye segment.I.Early changes and their preve
ntion by cata
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lase-aprotinin application.Acta Histochem，1994，96(3)：281.
[3] 李 林，胡椿枝.电光性眼炎与脂质过氧化反应间关系的实验研究.眼外伤职业眼病杂志，1991，3：149.
[4] Hass S，Kaina B.C-fos is involved in the celluar defence against the genotoxic effect ofUV radiation.Carcinogenesis，1995，16(5)：985.
[5] Djavaheri-Mergny M，Mergny JL，Bertrand F.Ultraviolet A induces activation of Ap-1 in cultured human keratinocytes. FEBS Lett，1996，384(1)：92.
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[6] Meyer M，Pahl HL，Baeuerle PA.Regulation of the transcription factors NF-KB and AP1 by redox changes.Chem Biol Interact，1994，91(2-3)：91.
[7] 李培峰， 方允中， 陈吉中， 等。 过氧化氢对铜锌超氧化物歧化酶结构损伤作用的进一步研究.生物化学杂志，1993，9(4)：417.
[8] Aragane Y，Kulms D，Metzed. Ultraviolet light induces apoptosis via direct activation of CD95(Fas/APO-1)independently of its ligand CD95L. J Cell Biol，1998，140(1)：171.
[9] 李忌，郑荣梁.活性氧诱导细胞凋亡.细胞生物学杂志，1997，19(3)：115.
(1998-09-10收稿，1998-11-02修回)
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