异种表面角膜镜片术后外周血T细胞亚群和NK细胞活性的流式细胞仪分析
作者：姚晓明 徐锦堂 李 辰 孙秉基 贺
单位：姚晓明(深圳市人民医院眼科，518020)；徐锦堂 李 辰(暨南大学医学院眼科)；孙秉基 贺(河南省眼科研究所)
关键词：表面角膜镜片术；移植；异种；T淋巴细胞；杀伤细胞；天然；免疫耐受；流式细胞术
异种表面角膜镜片术后外周血T细胞亚群 和NK细胞活性的流式细胞仪分析 摘 要 目的：研究异种表面角膜镜片术后机体对异种角膜的免疫反应，阐明人体对异种角膜的免疫耐受机制。方法：应用流式细胞仪对9例(9只眼)接受异种表面角膜镜片术患者术后外周血T细胞的分布和自然杀伤细胞的活性进行了分析。结果：术后2个月，T细胞未被激活，NK活化程度显著提高(P<0.01)，但未激发排斥反应。结论：猴角膜镜片虽可诱发轻微的免疫应答，但未达到增强抗原诱发的T细胞增殖应答的程度。可能与猴和人的种属相近，角膜镜片的抗原性低，抗原不易或缓慢被吞噬细胞摄取而成为致耐原，进而诱导免疫耐受有关。术后局部应用免疫抑制剂可防止移植排斥反应的发生。
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分类号 R779.65
Analysis of the peripheral T lymphocyte subsets and natural killer cell activity after xenogenic epikeratophakia with flow cytometry/YaoXiaoming…∥Ophthalmol CHN.-1998，8(4).-48～51(Department of Ophthalmology，Shenzhen Peoples Hospital，Shenzhen 518020)
To study the mechanism of the immune tolerance of the xenogenic epikeratophakia，4 patients with keratoconus and 5 patients with aphakia were treated by epikeratophakia monkey lenticules.The peripheral lymphocyte subsets andthe natural killer cell activity were analysed with flow cytometry before
, 百拇医药
and 1 month，2 months after surgery respectively.T cell was not activatedand the rejection was not set off though the activation of NK was significant 2 months postoperatively.The immune response activated by monkey lenticules wasslight and not enough to promote the proliferation of the lenticule-inducedT cell.It was possible that the low antigenicity of monkey lenticules couldprogressively cause the immune tolerance，and topical steroid may be helpful to inhibit the xenogenic rejection.
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Subject terms Epikeratophakia；Transplantation，heterologous；T-Lymphocytes；Killer cells，natural；Immune tolerance；Flow cytometry
同种表面角膜镜片术已被证明是一种安全、可靠、排斥率低的屈光手术。但异种表面角膜镜片术(xenogenic epikeratophakia，XE)的临床应用尚无报道。作者对4例圆锥角膜和5例无晶体眼患者施行了猴→人XE术，并对术后外周血T淋巴细胞的分布和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)的活性进行了检测。
1 材料和方法
1.1 检测对象 已施行XE的患者9例。其中，男性5例，女性4例，平均年龄25.07岁。手术前后均未全身应用影响免疫功能的药物。
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1.2 制剂与仪器 抗体均为异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)和藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的单克隆抗体(购自美国Becton Dickinson Immunocytometry Systems，SanJose)。包括：羊抗鼠IgG*PE，IgG*FITC，鼠抗人HLA-DR、CD69+、CD71+、CD25+，鼠抗人CD3*FITC、CD8*FITC，鼠抗人CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD54。流式细胞仪(FACStarplus)为美国B.D.公司产。
1.3 实验方法 术前、术后1、2个月分别采取
静脉血，加肝素抗凝。采取双色直接免疫荧光标记法。取肝素抗凝静脉血50μl抗体混合，室温孵育30min，然后用红细胞裂解溶液(0.155 M NH4CL，0.01M KHCO3，0.1mM EDTA，pH7.4)裂解红细胞，离心获取有核细胞，用PBS洗一次。用1%多聚甲醛：PBS固定10min后用流式细胞仪和软件LYSYSⅡ进行双色荧光参数获取及统计学分析。
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2 结果
2.1 术后T细胞亚群分析
术后，除CD16显著增加外，CD3、CD4、CD8和CD19均无明显变化(P>0.01)，见表1，图1。
2.2 手术前后T细胞活化相关抗原表达
同时表达CD69+CD3+、HLA-DR+CD3+、CD71+CD3+和CD25+CD3+的细胞分别为CD3+阳性细胞的4.25±3.1%、40.28±8.44%、3.66±2.19%和13.41±5.96%，术后分别为1.73±1.3%、55.21±12.13%、15.19±10.14%和8.82±5.45%，统计学上无显著性差异(P>0.01)，见表2。
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2.3 手术前后Tc活化相关抗原表达
术前，同时表达CD69+CD8+和CD25+CD8+的细胞分别为CD8+阳性细胞的6.13±4.73%、10.0±4.02%、和9.44±6.18%，术后分别为2.33±1.46%、13.04±5.57%和4.21±2.09%。统计学上无显著性差异(P>0.01)，见表3。
术后T细胞和Tc活化相关抗原表达的直方图见图2。
表1 XE术前、后淋巴细胞亚群分析(n＝9)
CD3
CD4
CD8
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CD19
CD16
术前
70.8±
14.3
34.6±
3.2
23.9±
7.7
7.9±
4.5
9.4±
1.3
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术后
66.9±
10.8
39.5±
6.1
30.75±
5.1
6.5±
2.9
13.25±
3.4
P<0.01
表2 XE术后T细胞活化相关抗原的表达(n＝9)
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术 前
术 后
CD69+CD3+/CD3+
4.25±3.1
1.73±1.3
DR+CD3+/CD3+
40.28±8.44
55.21±12.13
CD71+CD3+/CD3+
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3.66±2.19
15.19±10.14
CD25+CD3+/CD3+
13.41±5.96
8.82±5.45
表3 XE术后细胞毒T细胞活化
相关抗原的表达(n＝9)
术 前
术 后
CD69+CD8+/CD8+
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6.13±4.73
2.33±1.46
CD71+CD8+/CD8+
10.0±4.02
13.04±5.57
CD25+CD8+/CD8+
9.44±6.18
4.21±2.09
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图1 EKP术后淋巴细胞亚群分布的FCM分析
图2 异种EKP术后外周血淋巴
细胞亚群FCM分析直方图
3 讨论
一般认为，移植排斥反应是细胞介导的免疫反应[1]。早在本世纪初就有人提出排斥是淋巴样细胞介导的反应。50年代证实了参与排斥的细胞主要为T细胞，并发现细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T cell，Tc)在排斥反应中的重要意义[2]。已知T细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)等均参与了排斥反应，但尚未见异种表面角膜镜片术对外周血免疫细胞影响的报告。
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CD19是B细胞分化抗原CD25即白细胞介素2受体(interleukin-2receptor，IL-2R)；CD69又名激活诱导分子(activation inducer molecule，AIM)，参与淋巴细胞的早期激活，CD71又名转铁蛋白受体(transferrin receptor，TfR)，在增殖细胞过程中起重要作用。因此，CD25、CD69和CD71的表达，均是T细胞活化的标志。IL-2是一种由T细胞分泌的在机体免疫应答中起关键作用的细胞因子，能促进T淋巴增殖。T细胞通过其表面的抗原受体复合物CD3/Ti与抗原/MHC复合物作用后被激活，分泌IL-2并表达IL-2R，IL-2又作用于IL-2R，使抗原特异性T细胞克隆增殖，最终完成细胞免疫应答[3]。CD69可表达于早期激活淋巴细胞免疫、胸腺细胞和血小板细胞表面[4]。CD71作为转铁蛋白受体，参与了细胞增殖必需元素铁的代谢。已证实，在淋巴细胞受刺激后20～24小时，便可观察到TfR的表达。HLA-DR也是活化淋巴细胞表达的分子。由于静止的T淋巴细胞不表达HLA-DR，所以，其表达常被作为T细胞活化的标志。结果表明，XE术后2个月T淋巴细胞B细胞均未被激活，也未发生免疫排斥反应，这与临床观察结果相一致。
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在移植排斥反应中，最终导致移植破坏的原因是体内产生了Tc细胞和具有细胞毒作用的抗体。一般认为Tc细胞是参与移植物排斥反应的主要效应细胞。但参与移植排斥整个效应过程的细胞不可由某一类细胞单独完成，NK、巨嗜细胞等均对排斥反应起到某种调节作用。NK通过表面的某种蛋白激酶C和蛋白酪氨酸激酶的作用，破坏靶细胞。本研究结果显示，XE术后自然杀伤细胞(natural killers，NK)活化程度显著提高(P<0.01)。人NK表面标志有HNK-1，CD16(Leu-11)和NKH-1(Leu-19)等三种。根据其在细胞上的表达情况可将NK分为三组，其中，以CD3 CD16+Leu9+占多数，并表现最强的NK活性。因此，CD16+抗原的表达被认为是NK活化的标志。本研究结果发现NK虽显著活化，但并未激发排斥反应，其机制不明。推测这种活化尚未达到足以分泌IL-2来增强抗原诱发的T细胞增殖应答的程度。
移植物中含有受者体内所缺如的移植抗原是导致移植免疫排斥反应的根本原因。异种组织中含有的这种移植抗原显然要比同种组织中所含的多，抗原性也强得多。因此，如何降低异种组织的抗原性是提高异种移植成功率的重要因素之一。不少作者认为，冷冻后的角膜由于去除了角膜上皮，抗原性降低[5]，但有的作者认为冷冻处理后并不能降低角膜的抗原性。Bourne[6]分别用新鲜、冷冻保存和浸于冷冻保存液中的角膜为兔施行了板层角膜移植。术后所有植片至少维持透明12天，但新鲜植片、冷冻保存植片和冷冻液保存植片发生混浊的时间分别为术后27、24和25天，三组的混浊植片数、体征和混浊时间均无显著差异，认为，冷冻并不能降低异种角膜的抗原性。本文显示猴表面角膜镜片植入人类角膜后并未激发免疫排斥反应，这可能与猴角膜镜片的抗原性极低，或异种镜片抗原不易或缓慢被吞噬细胞摄取因而成为致耐原，诱导出免疫耐受有关。
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4 参考文献
[1] Hall BM.Cells mediating allograft rejection.Transplantation，1991，51：1141.
[2] Nabholz M，Maconald HR.Cytolytic T lymphocytes.Am Immunol，1983，273.
[3] Shaw J.Mechanisms regulating the level of IL-2 mRNA in T lymphocytes.J Immunol，1988，140：2243.
[4] Borrego F，Pena J，Solan R.Regulation of expression on human natural killer cells：differential CD69 involvement of protein kinase C and protein tyrosine kinases.Eur J Immunol，1993，23：1039.
, 百拇医药
[5] Schultz RO，Gallun AB.The effects of cryopreservation on the corneal heterograft reaction.In：Capella JA，Edelhauser EF，van Horn DL(eds).Corneal Preservation.Springfield，Ⅲ，Charles C Thomas，1973：300，[6] Bourne WM.Antigenicity of cryopreserved corneas.Arch Ophthalmol，1975，93：215.
(1998-05-11收稿)
, 百拇医药
单位：姚晓明(深圳市人民医院眼科，518020)；徐锦堂 李 辰(暨南大学医学院眼科)；孙秉基 贺(河南省眼科研究所)
关键词：表面角膜镜片术；移植；异种；T淋巴细胞；杀伤细胞；天然；免疫耐受；流式细胞术
异种表面角膜镜片术后外周血T细胞亚群 和NK细胞活性的流式细胞仪分析 摘 要 目的：研究异种表面角膜镜片术后机体对异种角膜的免疫反应，阐明人体对异种角膜的免疫耐受机制。方法：应用流式细胞仪对9例(9只眼)接受异种表面角膜镜片术患者术后外周血T细胞的分布和自然杀伤细胞的活性进行了分析。结果：术后2个月，T细胞未被激活，NK活化程度显著提高(P<0.01)，但未激发排斥反应。结论：猴角膜镜片虽可诱发轻微的免疫应答，但未达到增强抗原诱发的T细胞增殖应答的程度。可能与猴和人的种属相近，角膜镜片的抗原性低，抗原不易或缓慢被吞噬细胞摄取而成为致耐原，进而诱导免疫耐受有关。术后局部应用免疫抑制剂可防止移植排斥反应的发生。
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分类号 R779.65
Analysis of the peripheral T lymphocyte subsets and natural killer cell activity after xenogenic epikeratophakia with flow cytometry/YaoXiaoming…∥Ophthalmol CHN.-1998，8(4).-48～51(Department of Ophthalmology，Shenzhen Peoples Hospital，Shenzhen 518020)
To study the mechanism of the immune tolerance of the xenogenic epikeratophakia，4 patients with keratoconus and 5 patients with aphakia were treated by epikeratophakia monkey lenticules.The peripheral lymphocyte subsets andthe natural killer cell activity were analysed with flow cytometry before
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and 1 month，2 months after surgery respectively.T cell was not activatedand the rejection was not set off though the activation of NK was significant 2 months postoperatively.The immune response activated by monkey lenticules wasslight and not enough to promote the proliferation of the lenticule-inducedT cell.It was possible that the low antigenicity of monkey lenticules couldprogressively cause the immune tolerance，and topical steroid may be helpful to inhibit the xenogenic rejection.
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Subject terms Epikeratophakia；Transplantation，heterologous；T-Lymphocytes；Killer cells，natural；Immune tolerance；Flow cytometry
同种表面角膜镜片术已被证明是一种安全、可靠、排斥率低的屈光手术。但异种表面角膜镜片术(xenogenic epikeratophakia，XE)的临床应用尚无报道。作者对4例圆锥角膜和5例无晶体眼患者施行了猴→人XE术，并对术后外周血T淋巴细胞的分布和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)的活性进行了检测。
1 材料和方法
1.1 检测对象 已施行XE的患者9例。其中，男性5例，女性4例，平均年龄25.07岁。手术前后均未全身应用影响免疫功能的药物。
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1.2 制剂与仪器 抗体均为异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)和藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的单克隆抗体(购自美国Becton Dickinson Immunocytometry Systems，SanJose)。包括：羊抗鼠IgG*PE，IgG*FITC，鼠抗人HLA-DR、CD69+、CD71+、CD25+，鼠抗人CD3*FITC、CD8*FITC，鼠抗人CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD54。流式细胞仪(FACStarplus)为美国B.D.公司产。
1.3 实验方法 术前、术后1、2个月分别采取
静脉血，加肝素抗凝。采取双色直接免疫荧光标记法。取肝素抗凝静脉血50μl抗体混合，室温孵育30min，然后用红细胞裂解溶液(0.155 M NH4CL，0.01M KHCO3，0.1mM EDTA，pH7.4)裂解红细胞，离心获取有核细胞，用PBS洗一次。用1%多聚甲醛：PBS固定10min后用流式细胞仪和软件LYSYSⅡ进行双色荧光参数获取及统计学分析。
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2 结果
2.1 术后T细胞亚群分析
术后，除CD16显著增加外，CD3、CD4、CD8和CD19均无明显变化(P>0.01)，见表1，图1。
2.2 手术前后T细胞活化相关抗原表达
同时表达CD69+CD3+、HLA-DR+CD3+、CD71+CD3+和CD25+CD3+的细胞分别为CD3+阳性细胞的4.25±3.1%、40.28±8.44%、3.66±2.19%和13.41±5.96%，术后分别为1.73±1.3%、55.21±12.13%、15.19±10.14%和8.82±5.45%，统计学上无显著性差异(P>0.01)，见表2。
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2.3 手术前后Tc活化相关抗原表达
术前，同时表达CD69+CD8+和CD25+CD8+的细胞分别为CD8+阳性细胞的6.13±4.73%、10.0±4.02%、和9.44±6.18%，术后分别为2.33±1.46%、13.04±5.57%和4.21±2.09%。统计学上无显著性差异(P>0.01)，见表3。
术后T细胞和Tc活化相关抗原表达的直方图见图2。
表1 XE术前、后淋巴细胞亚群分析(n＝9)
CD3
CD4
CD8
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CD19
CD16
术前
70.8±
14.3
34.6±
3.2
23.9±
7.7
7.9±
4.5
9.4±
1.3
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术后
66.9±
10.8
39.5±
6.1
30.75±
5.1
6.5±
2.9
13.25±
3.4
P<0.01
表2 XE术后T细胞活化相关抗原的表达(n＝9)
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术 前
术 后
CD69+CD3+/CD3+
4.25±3.1
1.73±1.3
DR+CD3+/CD3+
40.28±8.44
55.21±12.13
CD71+CD3+/CD3+
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15.19±10.14
CD25+CD3+/CD3+
13.41±5.96
8.82±5.45
表3 XE术后细胞毒T细胞活化
相关抗原的表达(n＝9)
术 前
术 后
CD69+CD8+/CD8+
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6.13±4.73
2.33±1.46
CD71+CD8+/CD8+
10.0±4.02
13.04±5.57
CD25+CD8+/CD8+
9.44±6.18
4.21±2.09
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图1 EKP术后淋巴细胞亚群分布的FCM分析
图2 异种EKP术后外周血淋巴
细胞亚群FCM分析直方图
3 讨论
一般认为，移植排斥反应是细胞介导的免疫反应[1]。早在本世纪初就有人提出排斥是淋巴样细胞介导的反应。50年代证实了参与排斥的细胞主要为T细胞，并发现细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T cell，Tc)在排斥反应中的重要意义[2]。已知T细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)等均参与了排斥反应，但尚未见异种表面角膜镜片术对外周血免疫细胞影响的报告。
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CD19是B细胞分化抗原CD25即白细胞介素2受体(interleukin-2receptor，IL-2R)；CD69又名激活诱导分子(activation inducer molecule，AIM)，参与淋巴细胞的早期激活，CD71又名转铁蛋白受体(transferrin receptor，TfR)，在增殖细胞过程中起重要作用。因此，CD25、CD69和CD71的表达，均是T细胞活化的标志。IL-2是一种由T细胞分泌的在机体免疫应答中起关键作用的细胞因子，能促进T淋巴增殖。T细胞通过其表面的抗原受体复合物CD3/Ti与抗原/MHC复合物作用后被激活，分泌IL-2并表达IL-2R，IL-2又作用于IL-2R，使抗原特异性T细胞克隆增殖，最终完成细胞免疫应答[3]。CD69可表达于早期激活淋巴细胞免疫、胸腺细胞和血小板细胞表面[4]。CD71作为转铁蛋白受体，参与了细胞增殖必需元素铁的代谢。已证实，在淋巴细胞受刺激后20～24小时，便可观察到TfR的表达。HLA-DR也是活化淋巴细胞表达的分子。由于静止的T淋巴细胞不表达HLA-DR，所以，其表达常被作为T细胞活化的标志。结果表明，XE术后2个月T淋巴细胞B细胞均未被激活，也未发生免疫排斥反应，这与临床观察结果相一致。
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在移植排斥反应中，最终导致移植破坏的原因是体内产生了Tc细胞和具有细胞毒作用的抗体。一般认为Tc细胞是参与移植物排斥反应的主要效应细胞。但参与移植排斥整个效应过程的细胞不可由某一类细胞单独完成，NK、巨嗜细胞等均对排斥反应起到某种调节作用。NK通过表面的某种蛋白激酶C和蛋白酪氨酸激酶的作用，破坏靶细胞。本研究结果显示，XE术后自然杀伤细胞(natural killers，NK)活化程度显著提高(P<0.01)。人NK表面标志有HNK-1，CD16(Leu-11)和NKH-1(Leu-19)等三种。根据其在细胞上的表达情况可将NK分为三组，其中，以CD3 CD16+Leu9+占多数，并表现最强的NK活性。因此，CD16+抗原的表达被认为是NK活化的标志。本研究结果发现NK虽显著活化，但并未激发排斥反应，其机制不明。推测这种活化尚未达到足以分泌IL-2来增强抗原诱发的T细胞增殖应答的程度。
移植物中含有受者体内所缺如的移植抗原是导致移植免疫排斥反应的根本原因。异种组织中含有的这种移植抗原显然要比同种组织中所含的多，抗原性也强得多。因此，如何降低异种组织的抗原性是提高异种移植成功率的重要因素之一。不少作者认为，冷冻后的角膜由于去除了角膜上皮，抗原性降低[5]，但有的作者认为冷冻处理后并不能降低角膜的抗原性。Bourne[6]分别用新鲜、冷冻保存和浸于冷冻保存液中的角膜为兔施行了板层角膜移植。术后所有植片至少维持透明12天，但新鲜植片、冷冻保存植片和冷冻液保存植片发生混浊的时间分别为术后27、24和25天，三组的混浊植片数、体征和混浊时间均无显著差异，认为，冷冻并不能降低异种角膜的抗原性。本文显示猴表面角膜镜片植入人类角膜后并未激发免疫排斥反应，这可能与猴角膜镜片的抗原性极低，或异种镜片抗原不易或缓慢被吞噬细胞摄取因而成为致耐原，诱导出免疫耐受有关。
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4 参考文献
[1] Hall BM.Cells mediating allograft rejection.Transplantation，1991，51：1141.
[2] Nabholz M，Maconald HR.Cytolytic T lymphocytes.Am Immunol，1983，273.
[3] Shaw J.Mechanisms regulating the level of IL-2 mRNA in T lymphocytes.J Immunol，1988，140：2243.
[4] Borrego F，Pena J，Solan R.Regulation of expression on human natural killer cells：differential CD69 involvement of protein kinase C and protein tyrosine kinases.Eur J Immunol，1993，23：1039.
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[5] Schultz RO，Gallun AB.The effects of cryopreservation on the corneal heterograft reaction.In：Capella JA，Edelhauser EF，van Horn DL(eds).Corneal Preservation.Springfield，Ⅲ，Charles C Thomas，1973：300，[6] Bourne WM.Antigenicity of cryopreserved corneas.Arch Ophthalmol，1975，93：215.
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