维甲酸对人胃癌细胞p53基因表达的影响
作者：房静远 萧树东 童菊芳
单位：上海第二医科大学附属仁济医院 上海市消化疾病研究所(上海200001)
关键词：胃癌细胞系；全反式维甲酸；p53基因表达；细胞凋亡
肿瘤990111 p53基因与胃癌的关系早已引起人们的关注[1]，人胃癌发生中有野生型p53基因的缺失或突变，该基因可启动细胞凋亡(apoptosis)[2，3]。全反式维甲酸(all trans-retinoic acid, ATRA，ATRA，以下简称RA)可诱导胃癌细胞分化[4]。作者曾发现RA和叶酸(folic acid, FA)能部分诱导人胃癌细胞凋亡[5]，但其机理尚未明了。本研究的目的即探讨两者影响凋亡的机制和途径。
材料与方法
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1.实验材料 MKN-45低分化人胃癌细胞株系上海瑞金医院馈赠，RPMI-1640、10%的胎牛血清、L-谷氨酰胺和RNA抽提试剂盒均购自Gibco公司。N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙碘酸(HEPES)、RA和FA及DNA酶Ⅰ产于Sigma公司。α-32P dCTP随机引物试剂盒为Pharmacia公司产品，野生型p53 cDNA探针(1.8 kb)和原位DNA断段切口标记(TUNEL)试剂盒购自华美公司。
2.方法 细胞培养与干预：细胞在含有5% CO2、95%空气中，37℃的潮湿70 cm2的玻瓶中培养(培养液15 ml)。RA的工作浓度10-6(低浓度RA组，LR)和10-5 mol/L(高浓度RA组，HR)。FA贮存液浓度为0.4 g/L，工作时以培养液稀释为2×10-33 g/L(低浓度FA，LF)和10-2 g/L(高浓度FA，HF)，对照组未经任何处理。培养72 h后收集瓶中细胞。用于TUNEL者培养在含有玻片的48 cm2平皿中(培养液10 ml)；RNA抽提和Northern blot：RNA抽提试剂盒(Trizol)，按1 ml/10 cm2培养细胞比例溶解贴壁之细胞；以移液管吹打后将溶解产物移至1.5 ml之微量离心管中，15℃～30℃温育5 min，按0.2 ml/ml Trizol比例加氯仿，匀之及同样温育2 min，低温离心15 min、12000g；吸取水相，加异丙醇及再离心析出RNA，在含有1 μg/ml的溴乙啶的1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，虹吸转膜；随机引物法标记探针，预杂交和杂交，洗膜；-70℃放射自显影4天，读片分析。
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3.TUNEL 应用RA干预完成后，取粘满细胞的玻片，空气中干燥，并先后浸泡在12%的中性甲醛和75%乙醇溶液中固定；按试剂盒说明并稍加改良操作；先后以dUTP、TdT37℃温育2 h，PBS冲洗后以封闭液和亲和素-辣根过氧化酶处理，并再次37℃温育1 h；DAB染色及苏木素复染和脱水、透明与封片；300～600倍光镜下检测。在玻片上任选5～10个视野，计数被DAB染成棕黄色的细胞数，以百分数表示之。阳性对照系在以下TdT处理前先经1.0 μg/50 μl的DNA酶Ⅰ温育20 min；阴性对照者不经TdT处理。
结 果
1.人胃癌细胞系MKN-45有野生型p53基因mRNA的表达(如图1)。
2.FA对p53基因的表达无大的影响。
3.高浓度的RA可提高p53基因mRNA的表达水平(如图1)。
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图1 MKN-45细胞野生型p53基因mRNA的Northern blot. Lane 1,2,3,4,5分别为对照组、LF组、HF组、LR组和HR组；HR处理者mRNA表达明显高于其他组。
4.TUNEL方法的结果：在以LR或HR处理的MKN-45细胞系中，凋亡小体数目明显增多，而低浓度者尤甚(见插页2图1)；其胞浆内空泡样变并出现嗜碱性的凋亡小体。凋亡指数(%)对照组3.87±2.59，HR组6.99±1.63，LR组为10.70±5.97最高，对照组与LR，HR之比较P<0.05具有统计学显著意义。
图1 MKN-45细胞系被LR(A)，HR(B)干预后的凋亡情况，(C)为对照组，箭头示凋亡 细胞
讨 论
野生型p53基因作为一抑癌基因广泛存在于正常组织细胞中[6]，在胃癌等恶性肿瘤中常发生突变。同时也是细胞凋亡的诱导基因[2，3]。有关野生型p53基因的mRNA表达研究和p53在各种肿瘤细胞凋亡中作用已有多篇报道。Gotlieb氏发现[7]，TNFα诱导卵巢癌凋亡的同时野生型p53基因表达增强，认为前者正是通过后者而发挥作用的。在人卵巢细胞系3AO和AO中，孕酮可诱发细胞凋亡和野生型p53基因表达，且该凋亡的发生与p53基因表达的增加有关[8]。
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RA是一组天然存在的与维生素A分子结构相似的物质，可同时诱导HL-60细胞[9]和肝癌细胞的分化和凋亡[10]。FA是一种水溶性维生素，可抑制结肠粘膜上皮细胞的增生而抗结肠癌[11]。两者与癌基因或抑癌基因表达的关系的研究尚不多见。
有人曾对人结肠癌细胞的凋亡和p53基因表达进行研究[12]，发现以137Cs-γ射线照射后，原有野生型p53基因表达的V411细胞系，p53基因的mRNA表达增强伴有细胞凋亡的增加；而原无野生型p53基因的表达的SW480细胞系，不出现p53基因的mRNA表达和细胞凋亡的变化。因此，本研究显示RA可提高MKN-45细胞系的p53基因mRNA表达水平，尚需进行深入研究。
细胞凋亡的发生不仅仅归因于野生型p53基因的表达，往往需要活化的fas基因[13]。本实验中不同浓度RA对凋亡的影响与p53基因表达的影响不一致，也说明要完全弄清RA等影响细胞凋亡和抗癌的机理，应观察多种基因的变化。
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本课题承蒙卫生部科学基金资助(批准号：96-1-329)
第一作者简介 房静远，男，医学博士，副教授。
参 考 文 献
1 房静远，江绍基. p53基因与胃癌. 国外医学消化系疾病分册, 1994, 14:204
2 Anita JM, Christopher SP, Christopher JK, et al. The role of p53 in spontaneous and radiation-induced apoptosis in the gastrointestinal tract of normal and p53-deficient mice. Cancer Res, 1994, 54:614
3 Disa-Eiper C, Subramanian T and Chnnadurai G. bfl-1, a bcl-2 homologue, suppresses p53 induced apoptosis and exhibits potent cooperative transforming activity. Cancer Res, 1996, 56:3879
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4 Kobayashi T, Dohgome M, Kawakubo T. Increase in carcinoembryonic antigen release from cancer cells by combined treatment with retinoic acid and low-temperature hyperthermia. Int J Hyperthermia, 1990, 6:785
5 Fang JY and Xiao SD. Effect of trans-retinoic acid and folic acid for apoptosis in human gastric cancer cell lines MKN-45 and MKN-28. J Gastroenterol, 1998, 6:785
6 Imatani A, Sasano H, Yabuki N, Kato K, Ohara S, Asaki S, et al. In situ analysis of tissue dynamics and p53 expression in human gastric mucosa. J Pathol, 1996, 179:39
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7 Gotlieb WH, Watson JM, Rezai A, et al. Cytokine-induced modulation of tumor suppressor gene expression in ovarian cancer cells: Up-regulation of p53 gene expression and induction of apoptosis by tumor necrosis factor-α. Am J Obstet Gynecol, 1994, 170: 1121
8 Bu SZ, Yin DL, Ren XH, et al. Progesterone induces apoptosis and up-regulation of p53 expression in human ovarian carcinoma cell lines. Cancer, 1997, 79:1944
9 Nakamura N, Shidoji Y, Moriwaki H and Muto Y. Apoptosis in human hepatoma cell line induced by 4,5-didehydro-geranylgeranoic acid (acyclic retinoid) via down-regulation of transforming growth factor-α. Biochem Biophys Res Comm 1996, 219:100
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10 Nensey YM, Arlow FL and Majumdar APN. Aging increased responsiveness of colorectal mucosa to carcinogen stimulation and protective role of folic acid. Dig Dis Sci. 1995, 40:396
11 James SJ, Basnakian AG and Miller BJ. In vitro folate dificiency induces deoxynucleotide pool imbalance, apoptosis, and mutagenesis in Chinese hamster ovary cells. Cancer Res, 1994, 54:5075
12 Wang CY, Eshleman J, Lutterbaugh J, et al. Spontaneous apoptosis in human colon tumor cell lines and the relation of wt p53 to apoptosis. Chin Med J, 1996, 109:537
13 Fuchs EJ, Mckenna KA and Bedi A. p53-dependent DNA damage-induced apoptosis requires fas/APO-1-independent activation of CPP32β. Cancer Res, 1997, 57:2550
(收稿：1998-03-02 修回：1998-06-26), http://www.100md.com
单位：上海第二医科大学附属仁济医院 上海市消化疾病研究所(上海200001)
关键词：胃癌细胞系；全反式维甲酸；p53基因表达；细胞凋亡
肿瘤990111 p53基因与胃癌的关系早已引起人们的关注[1]，人胃癌发生中有野生型p53基因的缺失或突变，该基因可启动细胞凋亡(apoptosis)[2，3]。全反式维甲酸(all trans-retinoic acid, ATRA，ATRA，以下简称RA)可诱导胃癌细胞分化[4]。作者曾发现RA和叶酸(folic acid, FA)能部分诱导人胃癌细胞凋亡[5]，但其机理尚未明了。本研究的目的即探讨两者影响凋亡的机制和途径。
材料与方法
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1.实验材料 MKN-45低分化人胃癌细胞株系上海瑞金医院馈赠，RPMI-1640、10%的胎牛血清、L-谷氨酰胺和RNA抽提试剂盒均购自Gibco公司。N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙碘酸(HEPES)、RA和FA及DNA酶Ⅰ产于Sigma公司。α-32P dCTP随机引物试剂盒为Pharmacia公司产品，野生型p53 cDNA探针(1.8 kb)和原位DNA断段切口标记(TUNEL)试剂盒购自华美公司。
2.方法 细胞培养与干预：细胞在含有5% CO2、95%空气中，37℃的潮湿70 cm2的玻瓶中培养(培养液15 ml)。RA的工作浓度10-6(低浓度RA组，LR)和10-5 mol/L(高浓度RA组，HR)。FA贮存液浓度为0.4 g/L，工作时以培养液稀释为2×10-33 g/L(低浓度FA，LF)和10-2 g/L(高浓度FA，HF)，对照组未经任何处理。培养72 h后收集瓶中细胞。用于TUNEL者培养在含有玻片的48 cm2平皿中(培养液10 ml)；RNA抽提和Northern blot：RNA抽提试剂盒(Trizol)，按1 ml/10 cm2培养细胞比例溶解贴壁之细胞；以移液管吹打后将溶解产物移至1.5 ml之微量离心管中，15℃～30℃温育5 min，按0.2 ml/ml Trizol比例加氯仿，匀之及同样温育2 min，低温离心15 min、12000g；吸取水相，加异丙醇及再离心析出RNA，在含有1 μg/ml的溴乙啶的1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，虹吸转膜；随机引物法标记探针，预杂交和杂交，洗膜；-70℃放射自显影4天，读片分析。
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3.TUNEL 应用RA干预完成后，取粘满细胞的玻片，空气中干燥，并先后浸泡在12%的中性甲醛和75%乙醇溶液中固定；按试剂盒说明并稍加改良操作；先后以dUTP、TdT37℃温育2 h，PBS冲洗后以封闭液和亲和素-辣根过氧化酶处理，并再次37℃温育1 h；DAB染色及苏木素复染和脱水、透明与封片；300～600倍光镜下检测。在玻片上任选5～10个视野，计数被DAB染成棕黄色的细胞数，以百分数表示之。阳性对照系在以下TdT处理前先经1.0 μg/50 μl的DNA酶Ⅰ温育20 min；阴性对照者不经TdT处理。
结 果
1.人胃癌细胞系MKN-45有野生型p53基因mRNA的表达(如图1)。
2.FA对p53基因的表达无大的影响。
3.高浓度的RA可提高p53基因mRNA的表达水平(如图1)。
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图1 MKN-45细胞野生型p53基因mRNA的Northern blot. Lane 1,2,3,4,5分别为对照组、LF组、HF组、LR组和HR组；HR处理者mRNA表达明显高于其他组。
4.TUNEL方法的结果：在以LR或HR处理的MKN-45细胞系中，凋亡小体数目明显增多，而低浓度者尤甚(见插页2图1)；其胞浆内空泡样变并出现嗜碱性的凋亡小体。凋亡指数(%)对照组3.87±2.59，HR组6.99±1.63，LR组为10.70±5.97最高，对照组与LR，HR之比较P<0.05具有统计学显著意义。
图1 MKN-45细胞系被LR(A)，HR(B)干预后的凋亡情况，(C)为对照组，箭头示凋亡 细胞
讨 论
野生型p53基因作为一抑癌基因广泛存在于正常组织细胞中[6]，在胃癌等恶性肿瘤中常发生突变。同时也是细胞凋亡的诱导基因[2，3]。有关野生型p53基因的mRNA表达研究和p53在各种肿瘤细胞凋亡中作用已有多篇报道。Gotlieb氏发现[7]，TNFα诱导卵巢癌凋亡的同时野生型p53基因表达增强，认为前者正是通过后者而发挥作用的。在人卵巢细胞系3AO和AO中，孕酮可诱发细胞凋亡和野生型p53基因表达，且该凋亡的发生与p53基因表达的增加有关[8]。
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RA是一组天然存在的与维生素A分子结构相似的物质，可同时诱导HL-60细胞[9]和肝癌细胞的分化和凋亡[10]。FA是一种水溶性维生素，可抑制结肠粘膜上皮细胞的增生而抗结肠癌[11]。两者与癌基因或抑癌基因表达的关系的研究尚不多见。
有人曾对人结肠癌细胞的凋亡和p53基因表达进行研究[12]，发现以137Cs-γ射线照射后，原有野生型p53基因表达的V411细胞系，p53基因的mRNA表达增强伴有细胞凋亡的增加；而原无野生型p53基因的表达的SW480细胞系，不出现p53基因的mRNA表达和细胞凋亡的变化。因此，本研究显示RA可提高MKN-45细胞系的p53基因mRNA表达水平，尚需进行深入研究。
细胞凋亡的发生不仅仅归因于野生型p53基因的表达，往往需要活化的fas基因[13]。本实验中不同浓度RA对凋亡的影响与p53基因表达的影响不一致，也说明要完全弄清RA等影响细胞凋亡和抗癌的机理，应观察多种基因的变化。
, 百拇医药
本课题承蒙卫生部科学基金资助(批准号：96-1-329)
第一作者简介 房静远，男，医学博士，副教授。
参 考 文 献
1 房静远，江绍基. p53基因与胃癌. 国外医学消化系疾病分册, 1994, 14:204
2 Anita JM, Christopher SP, Christopher JK, et al. The role of p53 in spontaneous and radiation-induced apoptosis in the gastrointestinal tract of normal and p53-deficient mice. Cancer Res, 1994, 54:614
3 Disa-Eiper C, Subramanian T and Chnnadurai G. bfl-1, a bcl-2 homologue, suppresses p53 induced apoptosis and exhibits potent cooperative transforming activity. Cancer Res, 1996, 56:3879
, http://www.100md.com
4 Kobayashi T, Dohgome M, Kawakubo T. Increase in carcinoembryonic antigen release from cancer cells by combined treatment with retinoic acid and low-temperature hyperthermia. Int J Hyperthermia, 1990, 6:785
5 Fang JY and Xiao SD. Effect of trans-retinoic acid and folic acid for apoptosis in human gastric cancer cell lines MKN-45 and MKN-28. J Gastroenterol, 1998, 6:785
6 Imatani A, Sasano H, Yabuki N, Kato K, Ohara S, Asaki S, et al. In situ analysis of tissue dynamics and p53 expression in human gastric mucosa. J Pathol, 1996, 179:39
, http://www.100md.com
7 Gotlieb WH, Watson JM, Rezai A, et al. Cytokine-induced modulation of tumor suppressor gene expression in ovarian cancer cells: Up-regulation of p53 gene expression and induction of apoptosis by tumor necrosis factor-α. Am J Obstet Gynecol, 1994, 170: 1121
8 Bu SZ, Yin DL, Ren XH, et al. Progesterone induces apoptosis and up-regulation of p53 expression in human ovarian carcinoma cell lines. Cancer, 1997, 79:1944
9 Nakamura N, Shidoji Y, Moriwaki H and Muto Y. Apoptosis in human hepatoma cell line induced by 4,5-didehydro-geranylgeranoic acid (acyclic retinoid) via down-regulation of transforming growth factor-α. Biochem Biophys Res Comm 1996, 219:100
, http://www.100md.com
10 Nensey YM, Arlow FL and Majumdar APN. Aging increased responsiveness of colorectal mucosa to carcinogen stimulation and protective role of folic acid. Dig Dis Sci. 1995, 40:396
11 James SJ, Basnakian AG and Miller BJ. In vitro folate dificiency induces deoxynucleotide pool imbalance, apoptosis, and mutagenesis in Chinese hamster ovary cells. Cancer Res, 1994, 54:5075
12 Wang CY, Eshleman J, Lutterbaugh J, et al. Spontaneous apoptosis in human colon tumor cell lines and the relation of wt p53 to apoptosis. Chin Med J, 1996, 109:537
13 Fuchs EJ, Mckenna KA and Bedi A. p53-dependent DNA damage-induced apoptosis requires fas/APO-1-independent activation of CPP32β. Cancer Res, 1997, 57:2550
(收稿：1998-03-02 修回：1998-06-26), http://www.100md.com