应用转基因小鼠模型研究细小病毒非结构基因抗肿瘤作用*
作者：杨有文 丛笑倩 萧树东
单位：杨有文△ 萧树东(上海第二医科大学仁济医院，上海市消化疾病研究所(上海 200001)；丛笑倩(中国科学院上海细胞生物学研究所)△现在北京首都医科大学北京神经科学研究所工作(北京 100054)
关键词：转基因小鼠；小鼠细小病毒科；化学致癌剂；抗肿瘤形成
肿瘤990104 目的 探讨小鼠细小病毒非结构基因转基因小鼠抗肿瘤的作用。 方法 给予肺组织表达非结构(NS)基因的首建者转基因小鼠A6子代雄性鼠腹腔注射氨基甲酸乙酯水溶液，以诱发肺瘤结节。给予肩胛皮下不表达NS基因的A6子代雌性鼠局部注射致癌剂3-甲基胆蒽苯溶液，以诱发肩胛皮下肿瘤，另一部分子代雌性鼠腹腔接种S180肉瘤细胞2×106个/只，使之荷瘤。 结果 诱发携带NS基因组小鼠肺瘤结节平均数显著少于未携带NS基因组(P<0.01)。携带与未携带NS基因小鼠组的肩胛皮下肿瘤形成率、平均瘤重无显著差异(P>0.05)。腹腔接种S180肉瘤细胞小鼠，携带与未携带NS基因组的生命延长率无显著差异(P>0.05)。 结论 表达NS基因的组织具有抑制化学致癌剂致瘤形成的作用，而不表达NS基因的组织则无此作用，转基因小鼠对外源性肿瘤细胞的生长无抑制作用。NS基因可能主要在表达的细胞内发挥作用，抑制细胞的恶性转化。
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A STUDY ON THE ANTITUMORIGENESIS OF
MVMNS GENE IN TRANSGENIC MICE
Yang Youwen1，Chong Xiaoqian2,Xiao Shudong.1Shanghai Institute of Intestinal Disease,Renji Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200001.2Shanghai Institute of Cell Biology,Chinese Academy of Science,Shanghai 200032
Objective：To study the antitumorigenesis of MVMNS transgenic mice.Methods：Urethan water solution was administered by intraperitoneal injection to induce lung tumor nodes in the male offspring of A6 transgenic mouse, in which the NS gene is expressed in the lung.3-methylcholanthrene benzol solution was administered by subcutaneous injection at left scapular region to induce tumor in the female offspring of A6，in which scapular NS gene was not expressed. S180 tumor cells were administered 2×106/mouse by intraperitoneal injection in other female offspring to load tumor cells.Results：In the group with intraperitoneal injection,the average lung tumor nodes in the group carrying NS gene were significantly lower than those of NS gene free mice(P<0.01).In the group with subcutaneous injection,the rate of tumor formation,the average tumor weight showed no difference between NS positive and negative mice.In the group with intraperitoneal injection of S180 tumor cells,the difference of prolongation of life between NS positive and negative mice were not significant(P>0.05).Conclusion：The tissues expressing NS gene were able to inhibit tumorigenesis induced by chemical carcinogens.However,the tissues not expressing NS gene were not able to inhibit tumorigenesis.Transgenic mice had no prohibition against the growth of exogenous tumor cells.NS gene plays a direct role in the antitumorigenesis and may be mainly selectively prohibit the malignant change of cells in which it expresses.
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Key words Transgenic mice Parvoviridae Chemical carcinogen Antitumorigenesis
转基因动物是指基因组中整合有外源基因的一类动物。人们可以通过分析转基因和动物表型的关系揭示外源基因的功能，为肿瘤的防治研究提供动物模型。细小病毒是一类具有相似理化性质和生物学活性特征的单链线状DNA病毒群，其基因组结构也非常相似。大量证据表明，小鼠细小病毒(parvovirus minute virus of mice,MVM)不仅对在体内或离体培养的肿瘤细胞及转化细胞有选择性杀伤作用，而且对减少肿瘤发生、抑制致癌因子对细胞的恶性转化亦有明显的作用[1，2]。MVM的抗肿瘤机制仍不清楚，有人认为调节MVM DNA复制和转录的非结构(non-structure,NS)基因，除对病毒自身启动子起调节作用，尚可抑制异源性启动子，对肿瘤细胞具有细胞毒作用[3]。为深入研究MVMNS基因抗肿瘤作用，作者用显微注射法制备了转MVMNS基因的转基因小鼠模型[4]，并检测到NS基因在MVMNS转基因小鼠肺组织表达，在肩胛皮下组织不表达，NS基因表达对正常组织细胞未发现有害影响(见另文)。本文探讨在针对转基因小鼠表达或不表达NS基因的组织，分别给予转基因小鼠化学致癌剂和接种外源性瘤细胞之后，其抑制肿瘤形成的作用。
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材料与方法
1.实验材料 首建者A6(雄性)转基因小鼠，由本所与中国科学院上海细胞生物学研究所建立。C57BL/6J小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供，用之与A6回交产生子代小鼠。3-甲基胆蒽购自L.Light & Clonbrook,England。氨基甲酸乙酯购自上海曹杨第二中学化工厂。S180瘤株由中国科学院上海实验动物中心陈国强主任惠赠。RNA反转录试剂盒和PCR试剂盒购自Promega公司。异硫氰胍购自Sigma公司。
2.转基因鼠的检测 当仔鼠长至4周左右，剪取长约0.5 cm的鼠尾，剪碎，蛋白酶/酚/氯仿常规抽提纯化鼠基因组DNA，溶于50 μl水中，取2 μl作PCR DNA模板。引物序列为P3：3′ TGATGGCTCAACCAGGTGGA，P4：5′ TGGTGTGCTCCAAGGCTCTA，该序列位于MVMNS基因外显子区。PCR反应条件为：将PCR反应各液体混和后，95℃变性5分钟，然后按95℃ 45秒，56℃ 45秒，72℃ 90秒，进行35个热循环，最后72℃延伸10分钟，反应产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳鉴定，根据电泳结果分为携带和不携带NS基因(NS+和NS-)小鼠。以异硫氰酸胍一步法提取NS+鼠的肩胛间皮下组织、肺脏等组织总RNA，按反转录试剂盒说明合成cDNA，然后进行PCR，PCR方法条件同上。
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3.氨基甲酸乙酯诱发小鼠肺瘤结节[5] 取4～6周龄A6子代健康雄性鼠41只，其中19只携带NS基因。按20 g体重腹腔注射10%氨基甲酸乙酯水溶液0.2 ml，每周1次，共10次。停止用药至20周，脱臼处死小鼠，取肺脏，解剖镜下计肺瘤结节数。
4.3-甲基胆蒽诱发小鼠胛间皮下肿瘤[6] 取4～6周龄A6子代雌性小鼠27只，其中携带NS基因者14只。剪去左肩背部毛，以碘酒、酒精消毒局部皮肤。取0.5%的3-甲基胆蒽苯溶液0.2 ml，注射于背部左肩胛间皮下，2周后，再向同一部位重复注射一次。
5.瘤株的接种[7] 取荷腹水S180瘤细胞的昆明系小鼠，选用瘤细胞生长良好的腹水，计细胞数，以生理盐水稀释细胞浓度为107个/ml，按0.2 ml/只腹腔接种于14只6～8周龄A6子代雌鼠，其中7只携带NS基因。然后观察并计其生存期。
, 百拇医药
6.抗肿瘤作用的评价方法[7] 抑瘤生成率(%)=(1-NS+组平均生瘤数/NS-组平均生瘤数)×100%；瘤重抑制率(%)=(1-NS+组平均瘤重/NS-组平均瘤重)×100%；生命延长率(%)=(NS+组平均生存期/NS-组平均生存期-1)×100%。
结 果
1.转基因鼠的检测
对98只A6仔鼠的基因组DNA进行PCR扩增，约一半出现特异性的扩增带。对携带NS基因的鼠分别取肩胛间皮下组织、肺脏等组织，在mRNA水平上检测外源基因是否转录。提取RNA后进行RT-PCR，肺组织检测到NS基因的mRNA，肩胛间皮下则未检测到。
2.NS基因对氨基甲酸乙酯致肺瘤结节形成的影响
, 百拇医药
停止注射氨基甲酸乙酯后20周，存活小鼠共36只。其肺瘤结节诱发率、抑制率见表1。
表1 氨基甲酸乙酯诱发NS+和NS-小鼠肺瘤结节比较 组别
例数
诱发率
(%)
平均荷瘤数
抑瘤生成率
(%)
t检验
NS-
19
, 百拇医药
100
13.74
NS+
17
100
9.96
27.51
P<0.01
3.3-甲基胆蒽诱发NS+和NS-小鼠肩胛间皮下肿瘤潜伏期、生成及平均瘤重的比较
实验至28天1只NS+小鼠死亡，39和41天各有1只NS-小鼠死亡，3只小鼠均未发生肿瘤。至78～102天，各组的存活小鼠均发生肿瘤。在小鼠濒临死亡状态时处死，取瘤称重。其肿瘤生成率、平均潜伏期、平均瘤重及瘤重抑制率见表2。
, 百拇医药
4.荷S180腹水瘤的NS+和NS-小鼠生存期比较
腹腔接种S180瘤细胞后8～11天，小鼠全部死亡。从接种S180瘤细胞开始计算其生存期和生命延长率。结果见表3。表2 3-甲基胆蒽诱发NS+和NS-小鼠肩胛间皮下肿瘤发生率、平均潜伏期及平均瘤重比较 组别
例数
诱发率(%)
平均潜伏期(天)
t检验
平均瘤重(g)
瘤重抑制率(%)
t检验
, 百拇医药
NS-
11
100
86.9
5.42
NS+
13
100
84.3
P>0.05
5.35
1.29
P>0.05
, 百拇医药
表3 荷S180腹水瘤的NS+与NS-小鼠生存期和生命延长率的比较 组别
鼠数
平均生存期
(天)
生命延长率
(%)
t检验
NS-
7
9.2
NS+
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7
9.0
-2.17
P<0.05
讨 论
转基因动物是把基因的表达载体直接注射入受精卵或胚胎细胞，然后植入假孕的母体动物，使其发育成胚胎并正常分娩，产生带有该基因的动物。其特点是分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达，为人类在基因水平预防和治疗疾病开创了新的途径。目前，利用转基因动物技术从事的疾病防治研究，主要集中于肿瘤和遗传病两方面，一种抑癌基因的失活往往见于多种肿瘤组织，通过引入一种抑癌基因可能抑制多种肿瘤的发生。
MVM对多种转化细胞和肿瘤细胞具有肯定的抑制或裂解作用，而对正常细胞或组织未发现有任何毒害作用，一般认为NS在转化细胞或肿瘤细胞中高水平的表达是MVM抗肿瘤的关键[1]。Gaiver-Fauguet等[3]发现突变的NB-E细胞(胎儿肾转化细胞)能耐受NS蛋白，而且这些细胞对感染MVM也不敏感，故认为MVM对细胞的杀伤能力不仅取决于NS的表达水平，同时还依赖于细胞对NS蛋白的固有反应。
, 百拇医药
实验结果表明，NS基因的表达对转基因小鼠的正常组织细胞无毒害影响(待发表)。腹腔注射氨基甲酸乙酯诱导肺瘤结节，肺组织表达NS基因的转基因小鼠被诱导的肺瘤结节平均数比非转基因鼠明显减少，差异极显著(P<0.01)。肩胛间皮下组织注射3-甲基胆蒽苯溶液诱导局部肿瘤，在该组织不表达NS基因的转基因小鼠的肿瘤生成率及平均瘤重与非转基因组相比均无显著差异(P>0.05)。另外，在携带和未携带NS基因组小鼠腹腔接种S180瘤细胞，其生命延长期无显著差异(P>0.05)。NS转基因小鼠表达NS基因的组织可拮抗致癌剂的致瘤作用，而不表达NS基因的组织不能抑制致癌剂的致瘤性，NS基因对接种的外源性瘤细胞也无抑制作用，提示NS基因主要是通过直接的选择性细胞内毒害作用抑制细胞的恶变。这为日后应用MVMNS基因作为目的基因，进行肿瘤的基因治疗提供实验理论依据。
本课题受国家自然科学基金资助
第一作者简介 杨有文，男，医学博士，讲师。
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1 Rommelaere J,Cornelis JJ.Antineoplastic activity of parvoviruses.J Virol Methods,1991,33:233
2 Shaughnessy E.Parvoviral vectors for gene therapy of cancer.Semin Oncol,1996,23:59
3 Caillet -Fauquet P,Perros M,Rommelaere J, et al.Program killing of human cell by means of an inducible clone of parvoviral gene encoding non-structural proteins.Virol,1990,9:2989
, http://www.100md.com
4 Shen XZ,Tsung HC,Yang YW, et al. A preliminary analysis of antineoplastic activity of parvovirus MVMp NS-1 protein.Cell Res,1997,7:217
5 Abujiang P,Masahiko N,Toshiyuki K, et al. Genetic resistance to urethan-induced pulmonary adenomas in SMXA recombinant inbred mouse strains.Cancer Res,1997,57:2904
6 Dudley DD,Sundberg DJ,Roopenian DC.Motif-primed polymerase chain reaction-based alleiotype of sarcomas induced by 3-methylcholanthrene in interspecific hybrid mice.Oncogene,1995,11:517
, 百拇医药
7 李德华.抗肿瘤药物实验法.见：徐淑云主编.药理实验方法学.第二版.北京：人民卫生出版社，1991：1423
(收稿：1997-12-31 修回：1998-05-04)应。
实验结果表明，NS基因的表达对转基因小鼠的正常组织细胞无毒害影响(待发表)。腹腔注射氨基甲酸乙酯诱导肺瘤结节，肺组织表达NS基因的转基因小鼠被诱导的肺瘤结节平均数比非转基因鼠明显减少，差异极显著(P<0.01)。肩胛间皮下组织注射3-甲基胆蒽苯溶液诱导局部肿瘤，在该组织不表达NS基因的转基因小鼠的肿瘤生成率及平均瘤重与非转基因组相比均无显著差异(P>0.05)。另外，在携带和未携带NS基因组小鼠腹腔接种S180瘤细胞，其生命延长期无显著差异(P>0.05)。NS转基因小鼠表达NS基因的组织可拮抗致癌剂的致瘤作用，而不表达NS基因的组织不能抑制致癌剂的致瘤性，NS基因对接种的外源性瘤细胞也无抑制作用，提示NS基因主要是通过直接的选择性细胞内毒害作用抑制细胞的恶变。这为日后应用MVMNS基因作为目的基因，进行肿瘤的基因治疗提供实验理论依据。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学基金资助
第一作者简介 杨有文，男，医学博士，讲师。
作者单位：杨有文△ 萧树东(上海第二医科大学仁济医院，上海市消化疾病研究所(上海 200001)
丛笑倩(中国科学院上海细胞生物学研究所)
△现在北京首都医科大学北京神经科学研究所工作(北京 100054)
参 考 文 献
1 Rommelaere J,Cornelis JJ.Antineoplastic activity of parvoviruses.J Virol Methods,1991,33:233
, http://www.100md.com 2 Shaughnessy E.Parvoviral vectors for gene therapy of cancer.Semin Oncol,1996,23:59
3 Caillet -Fauquet P,Perros M,Rommelaere J, et al.Program killing of human cell by means of an inducible clone of parvoviral gene encoding non-structural proteins.Virol,1990,9:2989
4 Shen XZ,Tsung HC,Yang YW, et al. A preliminary analysis of antineoplastic activity of parvovirus MVMp NS-1 protein.Cell Res,1997,7:217
, 百拇医药 5 Abujiang P,Masahiko N,Toshiyuki K, et al. Genetic resistance to urethan-induced pulmonary adenomas in SMXA recombinant inbred mouse strains.Cancer Res,1997,57:2904
6 Dudley DD,Sundberg DJ,Roopenian DC.Motif-primed polymerase chain reaction-based alleiotype of sarcomas induced by 3-methylcholanthrene in interspecific hybrid mice.Oncogene,1995,11:517
7 李德华.抗肿瘤药物实验法.见：徐淑云主编.药理实验方法学.第二版.北京：人民卫生出版社，1991：1423
(收稿：1997-12-31 修回：1998-05-04), 百拇医药
单位：杨有文△ 萧树东(上海第二医科大学仁济医院，上海市消化疾病研究所(上海 200001)；丛笑倩(中国科学院上海细胞生物学研究所)△现在北京首都医科大学北京神经科学研究所工作(北京 100054)
关键词：转基因小鼠；小鼠细小病毒科；化学致癌剂；抗肿瘤形成
肿瘤990104 目的 探讨小鼠细小病毒非结构基因转基因小鼠抗肿瘤的作用。 方法 给予肺组织表达非结构(NS)基因的首建者转基因小鼠A6子代雄性鼠腹腔注射氨基甲酸乙酯水溶液，以诱发肺瘤结节。给予肩胛皮下不表达NS基因的A6子代雌性鼠局部注射致癌剂3-甲基胆蒽苯溶液，以诱发肩胛皮下肿瘤，另一部分子代雌性鼠腹腔接种S180肉瘤细胞2×106个/只，使之荷瘤。 结果 诱发携带NS基因组小鼠肺瘤结节平均数显著少于未携带NS基因组(P<0.01)。携带与未携带NS基因小鼠组的肩胛皮下肿瘤形成率、平均瘤重无显著差异(P>0.05)。腹腔接种S180肉瘤细胞小鼠，携带与未携带NS基因组的生命延长率无显著差异(P>0.05)。 结论 表达NS基因的组织具有抑制化学致癌剂致瘤形成的作用，而不表达NS基因的组织则无此作用，转基因小鼠对外源性肿瘤细胞的生长无抑制作用。NS基因可能主要在表达的细胞内发挥作用，抑制细胞的恶性转化。
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A STUDY ON THE ANTITUMORIGENESIS OF
MVMNS GENE IN TRANSGENIC MICE
Yang Youwen1，Chong Xiaoqian2,Xiao Shudong.1Shanghai Institute of Intestinal Disease,Renji Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200001.2Shanghai Institute of Cell Biology,Chinese Academy of Science,Shanghai 200032
Objective：To study the antitumorigenesis of MVMNS transgenic mice.Methods：Urethan water solution was administered by intraperitoneal injection to induce lung tumor nodes in the male offspring of A6 transgenic mouse, in which the NS gene is expressed in the lung.3-methylcholanthrene benzol solution was administered by subcutaneous injection at left scapular region to induce tumor in the female offspring of A6，in which scapular NS gene was not expressed. S180 tumor cells were administered 2×106/mouse by intraperitoneal injection in other female offspring to load tumor cells.Results：In the group with intraperitoneal injection,the average lung tumor nodes in the group carrying NS gene were significantly lower than those of NS gene free mice(P<0.01).In the group with subcutaneous injection,the rate of tumor formation,the average tumor weight showed no difference between NS positive and negative mice.In the group with intraperitoneal injection of S180 tumor cells,the difference of prolongation of life between NS positive and negative mice were not significant(P>0.05).Conclusion：The tissues expressing NS gene were able to inhibit tumorigenesis induced by chemical carcinogens.However,the tissues not expressing NS gene were not able to inhibit tumorigenesis.Transgenic mice had no prohibition against the growth of exogenous tumor cells.NS gene plays a direct role in the antitumorigenesis and may be mainly selectively prohibit the malignant change of cells in which it expresses.
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Key words Transgenic mice Parvoviridae Chemical carcinogen Antitumorigenesis
转基因动物是指基因组中整合有外源基因的一类动物。人们可以通过分析转基因和动物表型的关系揭示外源基因的功能，为肿瘤的防治研究提供动物模型。细小病毒是一类具有相似理化性质和生物学活性特征的单链线状DNA病毒群，其基因组结构也非常相似。大量证据表明，小鼠细小病毒(parvovirus minute virus of mice,MVM)不仅对在体内或离体培养的肿瘤细胞及转化细胞有选择性杀伤作用，而且对减少肿瘤发生、抑制致癌因子对细胞的恶性转化亦有明显的作用[1，2]。MVM的抗肿瘤机制仍不清楚，有人认为调节MVM DNA复制和转录的非结构(non-structure,NS)基因，除对病毒自身启动子起调节作用，尚可抑制异源性启动子，对肿瘤细胞具有细胞毒作用[3]。为深入研究MVMNS基因抗肿瘤作用，作者用显微注射法制备了转MVMNS基因的转基因小鼠模型[4]，并检测到NS基因在MVMNS转基因小鼠肺组织表达，在肩胛皮下组织不表达，NS基因表达对正常组织细胞未发现有害影响(见另文)。本文探讨在针对转基因小鼠表达或不表达NS基因的组织，分别给予转基因小鼠化学致癌剂和接种外源性瘤细胞之后，其抑制肿瘤形成的作用。
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材料与方法
1.实验材料 首建者A6(雄性)转基因小鼠，由本所与中国科学院上海细胞生物学研究所建立。C57BL/6J小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供，用之与A6回交产生子代小鼠。3-甲基胆蒽购自L.Light & Clonbrook,England。氨基甲酸乙酯购自上海曹杨第二中学化工厂。S180瘤株由中国科学院上海实验动物中心陈国强主任惠赠。RNA反转录试剂盒和PCR试剂盒购自Promega公司。异硫氰胍购自Sigma公司。
2.转基因鼠的检测 当仔鼠长至4周左右，剪取长约0.5 cm的鼠尾，剪碎，蛋白酶/酚/氯仿常规抽提纯化鼠基因组DNA，溶于50 μl水中，取2 μl作PCR DNA模板。引物序列为P3：3′ TGATGGCTCAACCAGGTGGA，P4：5′ TGGTGTGCTCCAAGGCTCTA，该序列位于MVMNS基因外显子区。PCR反应条件为：将PCR反应各液体混和后，95℃变性5分钟，然后按95℃ 45秒，56℃ 45秒，72℃ 90秒，进行35个热循环，最后72℃延伸10分钟，反应产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳鉴定，根据电泳结果分为携带和不携带NS基因(NS+和NS-)小鼠。以异硫氰酸胍一步法提取NS+鼠的肩胛间皮下组织、肺脏等组织总RNA，按反转录试剂盒说明合成cDNA，然后进行PCR，PCR方法条件同上。
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3.氨基甲酸乙酯诱发小鼠肺瘤结节[5] 取4～6周龄A6子代健康雄性鼠41只，其中19只携带NS基因。按20 g体重腹腔注射10%氨基甲酸乙酯水溶液0.2 ml，每周1次，共10次。停止用药至20周，脱臼处死小鼠，取肺脏，解剖镜下计肺瘤结节数。
4.3-甲基胆蒽诱发小鼠胛间皮下肿瘤[6] 取4～6周龄A6子代雌性小鼠27只，其中携带NS基因者14只。剪去左肩背部毛，以碘酒、酒精消毒局部皮肤。取0.5%的3-甲基胆蒽苯溶液0.2 ml，注射于背部左肩胛间皮下，2周后，再向同一部位重复注射一次。
5.瘤株的接种[7] 取荷腹水S180瘤细胞的昆明系小鼠，选用瘤细胞生长良好的腹水，计细胞数，以生理盐水稀释细胞浓度为107个/ml，按0.2 ml/只腹腔接种于14只6～8周龄A6子代雌鼠，其中7只携带NS基因。然后观察并计其生存期。
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6.抗肿瘤作用的评价方法[7] 抑瘤生成率(%)=(1-NS+组平均生瘤数/NS-组平均生瘤数)×100%；瘤重抑制率(%)=(1-NS+组平均瘤重/NS-组平均瘤重)×100%；生命延长率(%)=(NS+组平均生存期/NS-组平均生存期-1)×100%。
结 果
1.转基因鼠的检测
对98只A6仔鼠的基因组DNA进行PCR扩增，约一半出现特异性的扩增带。对携带NS基因的鼠分别取肩胛间皮下组织、肺脏等组织，在mRNA水平上检测外源基因是否转录。提取RNA后进行RT-PCR，肺组织检测到NS基因的mRNA，肩胛间皮下则未检测到。
2.NS基因对氨基甲酸乙酯致肺瘤结节形成的影响
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停止注射氨基甲酸乙酯后20周，存活小鼠共36只。其肺瘤结节诱发率、抑制率见表1。
表1 氨基甲酸乙酯诱发NS+和NS-小鼠肺瘤结节比较 组别
例数
诱发率
(%)
平均荷瘤数
抑瘤生成率
(%)
t检验
NS-
19
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100
13.74
NS+
17
100
9.96
27.51
P<0.01
3.3-甲基胆蒽诱发NS+和NS-小鼠肩胛间皮下肿瘤潜伏期、生成及平均瘤重的比较
实验至28天1只NS+小鼠死亡，39和41天各有1只NS-小鼠死亡，3只小鼠均未发生肿瘤。至78～102天，各组的存活小鼠均发生肿瘤。在小鼠濒临死亡状态时处死，取瘤称重。其肿瘤生成率、平均潜伏期、平均瘤重及瘤重抑制率见表2。
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4.荷S180腹水瘤的NS+和NS-小鼠生存期比较
腹腔接种S180瘤细胞后8～11天，小鼠全部死亡。从接种S180瘤细胞开始计算其生存期和生命延长率。结果见表3。表2 3-甲基胆蒽诱发NS+和NS-小鼠肩胛间皮下肿瘤发生率、平均潜伏期及平均瘤重比较 组别
例数
诱发率(%)
平均潜伏期(天)
t检验
平均瘤重(g)
瘤重抑制率(%)
t检验
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NS-
11
100
86.9
5.42
NS+
13
100
84.3
P>0.05
5.35
1.29
P>0.05
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表3 荷S180腹水瘤的NS+与NS-小鼠生存期和生命延长率的比较 组别
鼠数
平均生存期
(天)
生命延长率
(%)
t检验
NS-
7
9.2
NS+
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7
9.0
-2.17
P<0.05
讨 论
转基因动物是把基因的表达载体直接注射入受精卵或胚胎细胞，然后植入假孕的母体动物，使其发育成胚胎并正常分娩，产生带有该基因的动物。其特点是分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达，为人类在基因水平预防和治疗疾病开创了新的途径。目前，利用转基因动物技术从事的疾病防治研究，主要集中于肿瘤和遗传病两方面，一种抑癌基因的失活往往见于多种肿瘤组织，通过引入一种抑癌基因可能抑制多种肿瘤的发生。
MVM对多种转化细胞和肿瘤细胞具有肯定的抑制或裂解作用，而对正常细胞或组织未发现有任何毒害作用，一般认为NS在转化细胞或肿瘤细胞中高水平的表达是MVM抗肿瘤的关键[1]。Gaiver-Fauguet等[3]发现突变的NB-E细胞(胎儿肾转化细胞)能耐受NS蛋白，而且这些细胞对感染MVM也不敏感，故认为MVM对细胞的杀伤能力不仅取决于NS的表达水平，同时还依赖于细胞对NS蛋白的固有反应。
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实验结果表明，NS基因的表达对转基因小鼠的正常组织细胞无毒害影响(待发表)。腹腔注射氨基甲酸乙酯诱导肺瘤结节，肺组织表达NS基因的转基因小鼠被诱导的肺瘤结节平均数比非转基因鼠明显减少，差异极显著(P<0.01)。肩胛间皮下组织注射3-甲基胆蒽苯溶液诱导局部肿瘤，在该组织不表达NS基因的转基因小鼠的肿瘤生成率及平均瘤重与非转基因组相比均无显著差异(P>0.05)。另外，在携带和未携带NS基因组小鼠腹腔接种S180瘤细胞，其生命延长期无显著差异(P>0.05)。NS转基因小鼠表达NS基因的组织可拮抗致癌剂的致瘤作用，而不表达NS基因的组织不能抑制致癌剂的致瘤性，NS基因对接种的外源性瘤细胞也无抑制作用，提示NS基因主要是通过直接的选择性细胞内毒害作用抑制细胞的恶变。这为日后应用MVMNS基因作为目的基因，进行肿瘤的基因治疗提供实验理论依据。
本课题受国家自然科学基金资助
第一作者简介 杨有文，男，医学博士，讲师。
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参 考 文 献
1 Rommelaere J,Cornelis JJ.Antineoplastic activity of parvoviruses.J Virol Methods,1991,33:233
2 Shaughnessy E.Parvoviral vectors for gene therapy of cancer.Semin Oncol,1996,23:59
3 Caillet -Fauquet P,Perros M,Rommelaere J, et al.Program killing of human cell by means of an inducible clone of parvoviral gene encoding non-structural proteins.Virol,1990,9:2989
, http://www.100md.com
4 Shen XZ,Tsung HC,Yang YW, et al. A preliminary analysis of antineoplastic activity of parvovirus MVMp NS-1 protein.Cell Res,1997,7:217
5 Abujiang P,Masahiko N,Toshiyuki K, et al. Genetic resistance to urethan-induced pulmonary adenomas in SMXA recombinant inbred mouse strains.Cancer Res,1997,57:2904
6 Dudley DD,Sundberg DJ,Roopenian DC.Motif-primed polymerase chain reaction-based alleiotype of sarcomas induced by 3-methylcholanthrene in interspecific hybrid mice.Oncogene,1995,11:517
, 百拇医药
7 李德华.抗肿瘤药物实验法.见：徐淑云主编.药理实验方法学.第二版.北京：人民卫生出版社，1991：1423
(收稿：1997-12-31 修回：1998-05-04)应。
实验结果表明，NS基因的表达对转基因小鼠的正常组织细胞无毒害影响(待发表)。腹腔注射氨基甲酸乙酯诱导肺瘤结节，肺组织表达NS基因的转基因小鼠被诱导的肺瘤结节平均数比非转基因鼠明显减少，差异极显著(P<0.01)。肩胛间皮下组织注射3-甲基胆蒽苯溶液诱导局部肿瘤，在该组织不表达NS基因的转基因小鼠的肿瘤生成率及平均瘤重与非转基因组相比均无显著差异(P>0.05)。另外，在携带和未携带NS基因组小鼠腹腔接种S180瘤细胞，其生命延长期无显著差异(P>0.05)。NS转基因小鼠表达NS基因的组织可拮抗致癌剂的致瘤作用，而不表达NS基因的组织不能抑制致癌剂的致瘤性，NS基因对接种的外源性瘤细胞也无抑制作用，提示NS基因主要是通过直接的选择性细胞内毒害作用抑制细胞的恶变。这为日后应用MVMNS基因作为目的基因，进行肿瘤的基因治疗提供实验理论依据。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学基金资助
第一作者简介 杨有文，男，医学博士，讲师。
作者单位：杨有文△ 萧树东(上海第二医科大学仁济医院，上海市消化疾病研究所(上海 200001)
丛笑倩(中国科学院上海细胞生物学研究所)
△现在北京首都医科大学北京神经科学研究所工作(北京 100054)
参 考 文 献
1 Rommelaere J,Cornelis JJ.Antineoplastic activity of parvoviruses.J Virol Methods,1991,33:233
, http://www.100md.com 2 Shaughnessy E.Parvoviral vectors for gene therapy of cancer.Semin Oncol,1996,23:59
3 Caillet -Fauquet P,Perros M,Rommelaere J, et al.Program killing of human cell by means of an inducible clone of parvoviral gene encoding non-structural proteins.Virol,1990,9:2989
4 Shen XZ,Tsung HC,Yang YW, et al. A preliminary analysis of antineoplastic activity of parvovirus MVMp NS-1 protein.Cell Res,1997,7:217
, 百拇医药 5 Abujiang P,Masahiko N,Toshiyuki K, et al. Genetic resistance to urethan-induced pulmonary adenomas in SMXA recombinant inbred mouse strains.Cancer Res,1997,57:2904
6 Dudley DD,Sundberg DJ,Roopenian DC.Motif-primed polymerase chain reaction-based alleiotype of sarcomas induced by 3-methylcholanthrene in interspecific hybrid mice.Oncogene,1995,11:517
7 李德华.抗肿瘤药物实验法.见：徐淑云主编.药理实验方法学.第二版.北京：人民卫生出版社，1991：1423
(收稿：1997-12-31 修回：1998-05-04), 百拇医药