脑缺血生长相关蛋白表达与神经可塑性的研究
作者：廖维靖 杨万同
单位：430071 武汉市，湖北医科大学附属第二医院康复医学科
关键词：脑缺血；生长物质；神经再生；神经生物学
New Page 2 【中图号】 R364.12;R743.5
脑缺血损伤后的神经可塑性(neural plasticity)是基础神经科学和康复医学研究的重要课题，国内外均投入大量的经费、人力和物力进行研究。生长相关蛋白(growth-associated protein,GAP-43)是神经元发育和可塑性(neuronal development and plasticity)的分子标志物，在引导轴突生长和调节轴突形成新的联系上起关键作用。GAP-43因与神经再塑直接相关而倍受关注，脑缺血后GAP-43蛋白和mRNA表达与神经再塑正成为近年研究的新热点。现将这一领域的进展、存在的问题及展望综述如下。
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1 GAP-43的功能、脑内分布
GAP-43是神经元特异性磷蛋白，其DNA序列相当清楚，目前已知其功能是决定神经元发育和再塑的内在因素(intrinsic determinant)[1]。GAP-43存在于轴突生长锥，因其在神经损伤情况下表达显著增加，常被作为研究神经再生/再塑的分子标志物(molecular marker)。GAP-43 mRNA的水平可能由转录和转录后机制的协同作用所决定。
Yao等[2]采用原位杂交组织化学(in situ hybridization histochemistry,ISHH)的方法系统研究了GAP-43在脑内的分布，观察到前脑GAP-43 mRNA比低位脑干丰富，嗅球僧帽细胞、皮质、海马CA3区、斜角带、黑质、中缝核、蓝斑、迷走神经背侧运动核出现强烈杂交信号。丘脑、下丘脑和中脑出现中等强烈杂交信号，大多数非肾上腺素能、肾上腺素能、5-羟色胺能、组织胺能和多巴胺能细胞尾部显示强烈的GAP-43 mRNA信号。
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2 脑缺血后GAP-43的时空表达
正常情况下GAP-43呈低水平表达状态，损伤等应激情况下出现大量表达。脑缺血能否诱导GAP-43的表达过去所知甚少，近年采用大鼠和沙土鼠制作局部和全脑缺血模型，观察到GAP-43呈选择性表达增强。Tagaya等[3]对全脑缺血5 min的沙土鼠进行GAP-43 mRNA原位杂交实验，对照组海马神经元未见杂交信号，缺血组再灌注3 h检测到强烈的GAP-43信号，持续7、14 d消失。作者认为缺血诱导GAP-43基因表达，提示GAP-43涉及缺血的反应事件，包括纤维发芽和突触重建(synaptic reorganization)。
Schmidt-Kastner等[4]对大鼠采用20 min 4血管阻断的全脑缺血实验，作者采用ISHH方法观察缺血后1、3、6、12 h和1、3、7 d海马GAP-43 mRNA的表达，采用免疫组化方法观察1、2、4 d和7(或8) d GAP-43的表达。在对照组海马，GAP-43 mRNA局部定位在CA1-CA3区和门区。缺血后的早期门区细胞和粒细胞的信号中等增强，在晚期阶段CA3区信号发生某些变化。CA1区细胞因死亡无杂交信号。用免疫组化方法未检测到神经元胞浆出现GAP-43，然而在轴突和树突层的一个分化类型出现致密标记。缺血后1 d，齿状回门区、锥体层和CA3透明层神经元显示强烈的GAP-43胞浆标记。在2 d这些部位有少数细胞标记，在延迟阶段无标记。CA1和CA3的锥体细胞和粒细胞无标记。研究提示短暂脑缺血后易损神经元(vulnerable neurons)短暂表达GAP-43 mRNA和蛋白。门区神经元内的胞浆定位可能是GAP-43合成增加或胞浆转运的变化。缺血后数天CA3神经元的变化可能是因CA1神经元死亡而出现再塑反应(plastic response)。
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3 影响GAP-43表达的因素
研究影响GAP-43表达的因素可为研究神经再塑提供依据。1995年Yao和Kiyama[5]进行的地塞米松促进舌下神经再投射(re-projection)的实验是这一方向较早的工作。作者切断舌下神经轴突，将释放地塞米松的粒丸埋置在切断的神经旁(1.5 mg，释放3周)，用ISHH方法检测舌下神经核GAP-43 mRNA。在神经切断2周后实验组出现GAP-43 mRNA显著增加，迷走神经背侧运动核未观察到诱导。虽然地塞米松不改变神经损伤后舌下神经核GAP-43 mRNA的最高水平，但延长mRNA保持高表达的时间，这可能是糖皮质激素的转录后效应。结果提示地塞米松治疗在某种程度上促进再投射和易化，可能与糖皮质激素促进GAP-43 mRNA水平的提高有关。
因激素的副作用限制了其在临床常规使用，研究人员转向探索其他途径。Patel和Mcnamara[6]研究几种神经营养因子促齿状回神经元轴突发芽的作用效率，其作用从大至小依次为碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-4(NT-4)和神经营养素-3(NT-3)。神经生长因子(NGF)无作用。各因子间无协同作用。在Patel和Mcnamara研究的基础上，新近Kawamata等[7]进行的bFGF实验距临床更进了一步。作者对局部脑缺血的大鼠施行鞘内注射bFGF 0.5 μg，第一次注射是在梗塞后24 h，其后每周注射2次，共4周。结果显示对侧肢体感觉运动功能恢复，无明显副作用。免疫组化检测显示健侧感觉运动皮质(sensorimotor cortex) GAP-43免疫反应选择性增强。Kawamata的实验为研究有效且无副作用的脑保护剂提供了新的思路，启发研究人员另辟新径。祖国医学的活血化瘀药治疗脑缺血疾病取得较好效果，如果根据中西医理论筛选有效中药，这将是一个极具广阔前景的方向。
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4 神经再塑与偏瘫康复
GAP-43作为分子标志物是研究神经再塑的一项观察指标。基础课题研究的意义之一是为临床研究提供依据，指导临床治疗。1995年Stroemer等[8]报道大鼠脑梗塞后新皮质神经发芽、突触形成和行为恢复(behavioral recovery)。作者采用行为评定(behavioral assessment)的方法观察动物前肢恢复。恢复时间设定为术后3、7、14、30、60 d。实验组在3、7、14 d梗塞区内外侧的前肢、后肢和顶叶新皮质区GAP-43显著增加，在3或7 d上述部位无突触体素(synaptophysin)显著增加，但在14、30、60 d以及对侧顶叶皮质出现突触体素显著增加。结果支持在动物行为恢复的时空模型，缺血同侧和对侧新皮质在突触形成(synaptogenesis)后神经生长。因此，神经解剖结构再形成(remodeling)为功能恢复提供了基础。经典康复理论认为偏瘫患者的功能恢复依赖中枢神经的功能重组(functional reorganization)，然而康复领域迄今未在分子水平找到功能重组的证据，中枢神经系统可塑性的理论常受到质疑。康复研究人员利用GAP-43这一分子标志物，选择合适的康复治疗手段，阐明中枢神经再塑的机理，将为本学科理论的确立奠定坚实的基础。
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5 展望
神经再塑是极具应用前景的研究领域。在研究新的脑保护剂时，如循中医理论来筛选可作脑保护剂的中药，这一思路或许会有重大发现。康复治疗研究应选择分子标志物GAP-43作观察指标，以阐明现有治疗对中枢神经再塑的确切机制。
参考文献
1 Benowitz LI,Routtenberg A.GAP-43:an intrinsic determinant of neuronal development and plasticity.Trends Neurosci,1997,20:84-91.
2 Yao GL,Kiyama H,Tohyama M.Distribution of GAP-43 (B50/F1) mRNA in the adult rat brain by in situ hybridization using an alkaline phosphatase labeled probe.Mol Brain Res,1993,18:1-16.
, http://www.100md.com
3 Tagaya M,Matsuyama T,Nakamura H,et al.Increased F1/GAP-43 mRNA accumulation in gerbil hippocampus after brain ischemia.J Cereb Blood Flow Metab,1995,15:1132-1136.
4 Schmidt-Kastner R,Bedard A,Hakim A.Transient expression of GAP-43 within the hippocampus after global brain ischemia in rat.Cell Tissue Res,1997,288:225-238.
5 Yao GL,Kiyama H.Dexamethasone enhances level of GAP-43 mRNA after nerve injury and facilitates re-projection of the hypoglossal nerve.Mol Brain Res,1995,32:308-312.
, http://www.100md.com
6 Patel MN,Mcnamara JO.Selective enhancement of axonal branching of cultured dentate gyrus neurons by neurotrophic factors.Neuroscience,1995,69:763-770.
7 Kawamata T,Dietrich WD,Schallert T,et al.Intracisternal basic fibroblast growth factor enhances functional recovery and up-regulates the expression of a molecular marker of neuronal sprouting following focal cerebral infarction.Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:8179-8184.
8 Stroemer RP,Kent TA,Hulsebosch CE.Neocortical neural sprouting,synaptogenesis,and behavioral recovery after neocortical infarction in rats.Stroke,1995,26:2135-2144.
收稿 1998-06-09
修回 1998-11-30, http://www.100md.com
单位：430071 武汉市，湖北医科大学附属第二医院康复医学科
关键词：脑缺血；生长物质；神经再生；神经生物学
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脑缺血损伤后的神经可塑性(neural plasticity)是基础神经科学和康复医学研究的重要课题，国内外均投入大量的经费、人力和物力进行研究。生长相关蛋白(growth-associated protein,GAP-43)是神经元发育和可塑性(neuronal development and plasticity)的分子标志物，在引导轴突生长和调节轴突形成新的联系上起关键作用。GAP-43因与神经再塑直接相关而倍受关注，脑缺血后GAP-43蛋白和mRNA表达与神经再塑正成为近年研究的新热点。现将这一领域的进展、存在的问题及展望综述如下。
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1 GAP-43的功能、脑内分布
GAP-43是神经元特异性磷蛋白，其DNA序列相当清楚，目前已知其功能是决定神经元发育和再塑的内在因素(intrinsic determinant)[1]。GAP-43存在于轴突生长锥，因其在神经损伤情况下表达显著增加，常被作为研究神经再生/再塑的分子标志物(molecular marker)。GAP-43 mRNA的水平可能由转录和转录后机制的协同作用所决定。
Yao等[2]采用原位杂交组织化学(in situ hybridization histochemistry,ISHH)的方法系统研究了GAP-43在脑内的分布，观察到前脑GAP-43 mRNA比低位脑干丰富，嗅球僧帽细胞、皮质、海马CA3区、斜角带、黑质、中缝核、蓝斑、迷走神经背侧运动核出现强烈杂交信号。丘脑、下丘脑和中脑出现中等强烈杂交信号，大多数非肾上腺素能、肾上腺素能、5-羟色胺能、组织胺能和多巴胺能细胞尾部显示强烈的GAP-43 mRNA信号。
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2 脑缺血后GAP-43的时空表达
正常情况下GAP-43呈低水平表达状态，损伤等应激情况下出现大量表达。脑缺血能否诱导GAP-43的表达过去所知甚少，近年采用大鼠和沙土鼠制作局部和全脑缺血模型，观察到GAP-43呈选择性表达增强。Tagaya等[3]对全脑缺血5 min的沙土鼠进行GAP-43 mRNA原位杂交实验，对照组海马神经元未见杂交信号，缺血组再灌注3 h检测到强烈的GAP-43信号，持续7、14 d消失。作者认为缺血诱导GAP-43基因表达，提示GAP-43涉及缺血的反应事件，包括纤维发芽和突触重建(synaptic reorganization)。
Schmidt-Kastner等[4]对大鼠采用20 min 4血管阻断的全脑缺血实验，作者采用ISHH方法观察缺血后1、3、6、12 h和1、3、7 d海马GAP-43 mRNA的表达，采用免疫组化方法观察1、2、4 d和7(或8) d GAP-43的表达。在对照组海马，GAP-43 mRNA局部定位在CA1-CA3区和门区。缺血后的早期门区细胞和粒细胞的信号中等增强，在晚期阶段CA3区信号发生某些变化。CA1区细胞因死亡无杂交信号。用免疫组化方法未检测到神经元胞浆出现GAP-43，然而在轴突和树突层的一个分化类型出现致密标记。缺血后1 d，齿状回门区、锥体层和CA3透明层神经元显示强烈的GAP-43胞浆标记。在2 d这些部位有少数细胞标记，在延迟阶段无标记。CA1和CA3的锥体细胞和粒细胞无标记。研究提示短暂脑缺血后易损神经元(vulnerable neurons)短暂表达GAP-43 mRNA和蛋白。门区神经元内的胞浆定位可能是GAP-43合成增加或胞浆转运的变化。缺血后数天CA3神经元的变化可能是因CA1神经元死亡而出现再塑反应(plastic response)。
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3 影响GAP-43表达的因素
研究影响GAP-43表达的因素可为研究神经再塑提供依据。1995年Yao和Kiyama[5]进行的地塞米松促进舌下神经再投射(re-projection)的实验是这一方向较早的工作。作者切断舌下神经轴突，将释放地塞米松的粒丸埋置在切断的神经旁(1.5 mg，释放3周)，用ISHH方法检测舌下神经核GAP-43 mRNA。在神经切断2周后实验组出现GAP-43 mRNA显著增加，迷走神经背侧运动核未观察到诱导。虽然地塞米松不改变神经损伤后舌下神经核GAP-43 mRNA的最高水平，但延长mRNA保持高表达的时间，这可能是糖皮质激素的转录后效应。结果提示地塞米松治疗在某种程度上促进再投射和易化，可能与糖皮质激素促进GAP-43 mRNA水平的提高有关。
因激素的副作用限制了其在临床常规使用，研究人员转向探索其他途径。Patel和Mcnamara[6]研究几种神经营养因子促齿状回神经元轴突发芽的作用效率，其作用从大至小依次为碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-4(NT-4)和神经营养素-3(NT-3)。神经生长因子(NGF)无作用。各因子间无协同作用。在Patel和Mcnamara研究的基础上，新近Kawamata等[7]进行的bFGF实验距临床更进了一步。作者对局部脑缺血的大鼠施行鞘内注射bFGF 0.5 μg，第一次注射是在梗塞后24 h，其后每周注射2次，共4周。结果显示对侧肢体感觉运动功能恢复，无明显副作用。免疫组化检测显示健侧感觉运动皮质(sensorimotor cortex) GAP-43免疫反应选择性增强。Kawamata的实验为研究有效且无副作用的脑保护剂提供了新的思路，启发研究人员另辟新径。祖国医学的活血化瘀药治疗脑缺血疾病取得较好效果，如果根据中西医理论筛选有效中药，这将是一个极具广阔前景的方向。
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4 神经再塑与偏瘫康复
GAP-43作为分子标志物是研究神经再塑的一项观察指标。基础课题研究的意义之一是为临床研究提供依据，指导临床治疗。1995年Stroemer等[8]报道大鼠脑梗塞后新皮质神经发芽、突触形成和行为恢复(behavioral recovery)。作者采用行为评定(behavioral assessment)的方法观察动物前肢恢复。恢复时间设定为术后3、7、14、30、60 d。实验组在3、7、14 d梗塞区内外侧的前肢、后肢和顶叶新皮质区GAP-43显著增加，在3或7 d上述部位无突触体素(synaptophysin)显著增加，但在14、30、60 d以及对侧顶叶皮质出现突触体素显著增加。结果支持在动物行为恢复的时空模型，缺血同侧和对侧新皮质在突触形成(synaptogenesis)后神经生长。因此，神经解剖结构再形成(remodeling)为功能恢复提供了基础。经典康复理论认为偏瘫患者的功能恢复依赖中枢神经的功能重组(functional reorganization)，然而康复领域迄今未在分子水平找到功能重组的证据，中枢神经系统可塑性的理论常受到质疑。康复研究人员利用GAP-43这一分子标志物，选择合适的康复治疗手段，阐明中枢神经再塑的机理，将为本学科理论的确立奠定坚实的基础。
, 百拇医药
5 展望
神经再塑是极具应用前景的研究领域。在研究新的脑保护剂时，如循中医理论来筛选可作脑保护剂的中药，这一思路或许会有重大发现。康复治疗研究应选择分子标志物GAP-43作观察指标，以阐明现有治疗对中枢神经再塑的确切机制。
参考文献
1 Benowitz LI,Routtenberg A.GAP-43:an intrinsic determinant of neuronal development and plasticity.Trends Neurosci,1997,20:84-91.
2 Yao GL,Kiyama H,Tohyama M.Distribution of GAP-43 (B50/F1) mRNA in the adult rat brain by in situ hybridization using an alkaline phosphatase labeled probe.Mol Brain Res,1993,18:1-16.
, http://www.100md.com
3 Tagaya M,Matsuyama T,Nakamura H,et al.Increased F1/GAP-43 mRNA accumulation in gerbil hippocampus after brain ischemia.J Cereb Blood Flow Metab,1995,15:1132-1136.
4 Schmidt-Kastner R,Bedard A,Hakim A.Transient expression of GAP-43 within the hippocampus after global brain ischemia in rat.Cell Tissue Res,1997,288:225-238.
5 Yao GL,Kiyama H.Dexamethasone enhances level of GAP-43 mRNA after nerve injury and facilitates re-projection of the hypoglossal nerve.Mol Brain Res,1995,32:308-312.
, http://www.100md.com
6 Patel MN,Mcnamara JO.Selective enhancement of axonal branching of cultured dentate gyrus neurons by neurotrophic factors.Neuroscience,1995,69:763-770.
7 Kawamata T,Dietrich WD,Schallert T,et al.Intracisternal basic fibroblast growth factor enhances functional recovery and up-regulates the expression of a molecular marker of neuronal sprouting following focal cerebral infarction.Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:8179-8184.
8 Stroemer RP,Kent TA,Hulsebosch CE.Neocortical neural sprouting,synaptogenesis,and behavioral recovery after neocortical infarction in rats.Stroke,1995,26:2135-2144.
收稿 1998-06-09
修回 1998-11-30, http://www.100md.com