肿瘤浸润淋巴细胞与IL-2联合诱导Lewis肺癌凋亡的研究
作者：唐华 陈德基 刘铭球 刘晓翌 徐惠琴 张华亭 周洁
单位：唐华(河南省人民医院病理科，郑州 450003)；陈德基 刘铭球 刘晓翌 徐惠琴 张华亭(湖北医科大学病理教研室，武汉 430071)；周洁(解放军广州医学高等专科学校，广州 510000)
关键词：凋亡；肿瘤浸润；淋巴细胞；白细胞介素2；肺肿瘤
临床与实验病理学杂志990218摘要 目的：研究肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)与IL-2联合体内诱导凋亡产生抗瘤作用机理，为应用TIL治疗肺癌提供依据。方法：从Lewis肺癌(LLC)瘤体中分离提取TIL，在含1000 U/ml IL-2的完全培养基中培养后，与LLC细胞以10∶1接种于C57BL/6小鼠腋下，每日1000 U/ml IL-2瘤内注射，并测量肿瘤体积，于接种后第18天处死小鼠。结果：发现TIL加IL-2有明显地抑制LLC生长的作用(P<0.001)，HE染色、TUNEL和电镜均证实TIL加IL-2可明显诱导Lewis肺癌细胞凋亡。结论：诱导凋亡产生可能是TIL与IL-2联合抗瘤的机制之一。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R734.2； R329.25 文献标识码 A 文章编号 1001-7399(1999)02-0143-03
Study on anti-tumor effect of tumor-infiltrating lymphocytes from lung cancer combining with IL-2: induce apoptosis in vivo
Tang Hua
(Dept of Pathol, People＇s Hospital of Henan Province, Zhengzhou 450003)
Chen Deji Liu Mingqiu et al
(Dept of Pathol, Hubei Medical University, Wuhan 430071)
, 百拇医药
ABSTRACT Purpose To study the mechanism of anti-tumor in vivo of tumor-infiltrating lymphocytes(TILs). Methods TILs isolated from Lewis lung cancer (LLC) implanted in C57BL/6 mice, which were cultured with IL-2, were implanted into C57BL/6 mice together with LLC cells, which the ratio of TIL: LLC cells was 10∶1. These mice were injected 1000 U IL-2 and the tumor size were measured. On the eighteenth day after the cells having been implanted, the mice were killed. Results The data suggested that TILs plus IL-2 can significantly suppress tumor growth (P<0.01). Histologically, TUNEL and ultrastructure confirmed that TILs combining with IL-2 had the effect of inducing the presence of LLC apoptosis. Conclusion The results indicate that inducing apoptosis in vivo may be one of the mechanism of the anti-tumor effect of TILs combining with IL-2.
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KEY WORDS apoptosis; lymphocytes tumor-infiltrating; interleukin-2; lung neoplasms
1 材料和方法
1.1 材料 实验小鼠为C57BL/6 8～12周龄，雌雄兼备，购自北京医科大学实验动物部。LLC瘤株为Lewis肺癌可移植性瘤株，购自中国医学科学院药物研究所药理二室。白细胞介素2(IL-2)购自北京军事医学科学院邦定生物医学公司。TUNEL凋亡检测试剂盒购自华美公司。
1.2 方法
1.2.1 TIL的制备培养 参照Ohta〔3〕方法，稍加修改。从荷Lewis肺癌的C57BL/6小鼠体内无菌取瘤，去除出血坏死及脂肪组织，剪切成糊状(1 mm3大小)，于混合酶(含0.1%胶原酶Ⅰ，0.01%透明质酸酶和0.004% DNase)中，37℃消化1～2 h，过尼龙网后的单细胞悬液铺于下层比重1.088、上层比重1.075的等体积双层分离液上，1 500 r.min-1离心20 min。吸两分层液间细胞(TIL)，PBS洗2次，用含1 000 U/ml IL-2的完全培养基重悬，并铺于24孔培养板上，每孔1 ml，37℃，5%CO2培养，隔2天半量换液。
, 百拇医药
1.2.2 实验分组 实验分为4组，每组10只，每组小鼠皆于左侧腋窝皮下接种相同量的LLC细胞，同时，实验组Ⅰ和实验组Ⅱ小鼠在接种肿瘤的同时还接种10倍于LLC细胞的TIL。
1.2.3 实验处理 自接种之日起，作以下处理：实验组Ⅰ于接种部位皮下(肿瘤长出后为瘤内)每日注射2 000 U/ml的IL-2 0.5 ml；实验组Ⅱ每日皮下注射生理盐水0.5 ml；实验组Ⅲ每日注射2 000 U/ml的IL-2 0.5 ml；对照组每日注射生理盐水0.5 ml。
1.2.4 肿瘤大小的观察 在作上述处理的同时，每日观察肿瘤的生长情况，以直径大于2 mm为发瘤的标志，用游标卡尺测量每一肿瘤的最大直径(a)和最小横径(b)，按公式V=πa×b2/6计算肿瘤的体积。
1.2.5 组织学及电镜观察 (A)HE染色：于接种后第18天引颈处死小鼠，完整剥离肿瘤，常规石蜡切片，HE染色；(B)TUNEL标记：方法参照试剂盒说明书进行；(C)电镜：取新鲜的癌组织，常规固定，浸透包埋，超薄切片，染色，H-600透射电镜观察。
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1.2.6 统计学处理 全部数据用t检验处理。
2 结果
2.1 肿瘤生长速度和体积 对照组和实验组Ⅱ、Ⅲ的生长速度明显高于实验组Ⅰ；第18天处死小鼠时，实验组Ⅰ肿瘤体积与其它各组比较，差异有高度显著性(P<0.001)，见表1。
表1 TIL加IL-2在小鼠体内对LLC瘤体体积的影响(
) 组别
n
肿瘤体积
t值
实验组Ⅰ
10
, http://www.100md.com
2.59±1.49
00
对照组
10
6.37±1.43
5.79*
00
实验组Ⅱ
10
6.41±1.45
5.80*
0.059
, http://www.100md.com
00
实验组Ⅲ
10
6.08±1.77
4.76*
0.41
0.46
00示对比组，*P<0.001
2.2 组织学变化及超微结构改变 实验组Ⅰ与其他各组相比组织学上最显著的变化特征为：在实验组Ⅰ存活的瘤组织内出现广泛分布的凋亡瘤细胞，这些细胞一般单个散在或灶性分布于存活的瘤细胞之间，细胞胞体收缩变圆变小，胞膜完整，与邻接细胞脱离，成一圈空晕，形似陷窝。在HE染色片上凋亡细胞胞浆嗜伊红染。核高度浓染，形态上，或收缩成圆形，或由于染色质边集而成环形、新月形，或裂解成不规则的碎片散落于红染的胞浆内。凋亡细胞周围不见炎性反应。此外实验组Ⅰ的瘤组织周边有大量的淋巴细胞浸润。
, 百拇医药
电镜下观察进一步证实了光镜的观察结果。电镜下早期的凋亡瘤细胞胞体收缩变圆变小，微绒毛消失，胞膜平滑，胞浆浓缩，密度升高，其内可见内质网肿胀形成的空泡。核染色质浓缩向核膜凝集，成新月形，核仁消失，并可见核周隙增宽的现象。中期的凋亡细胞，与周围细胞脱离，细胞表面突出许多泡状凸起(发泡，budding)，胞浆进一步浓聚，密度增高，内质网扩张成泡状，核高度凝集扭曲成致密的团块，并可见裂解的核碎片。还可见凋亡小体被周围的瘤细胞吞噬、消化的现象。
3 讨论
1986年Rosenberg〔1〕报道TIL比LAK细胞活性高100倍以来，TIL在肿瘤的过继免疫治疗中的作用备受人们的关注。此后许多作者报道了各种关于TIL基础的以及临床的研究工作。本实验以及我们以前的报道中，曾指出TIL与IL-2联合应用有明显的抗瘤作用，并且本实验还发现无论在光镜还是在电镜下都观察到实验组Ⅰ瘤组织内出现的瘤细胞凋亡，而其他各组没有见到类似现象〔2〕。这对于认识TIL联合IL-2产生抗瘤作用的机制有重要意义。
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凋亡是生命活动的正常组成部分，和坏死一样是细胞死亡的方式之一，但在形态学、发生频率和继发改变上与坏死相比，具有明显的特征。这种死亡过程不象坏死那样发生细胞内含物外泄，故不引起炎症反应。也不象坏死那样成片发生，一般呈单个和小灶性散在分布〔4，5〕。
凋亡过程的紊乱将导致发育异常和加快肿瘤的发生〔6〕，许多证据表明肿瘤的发生与凋亡紊乱有着密切关系，而近年的研究表明，很多抗癌药是通过诱发肿瘤细胞凋亡来发挥作用的。诱发肿瘤细胞凋亡是进行肿瘤治疗的新思路，因为人们已经认识到，很多肿瘤的发生不仅由于细胞增殖速率很高，而且与细胞死亡速率下降有关。孙志贤等〔7〕指出，抗瘤治疗的效果是同癌细胞生成反应的内在能力(intrinsic ability)密切相关的；而恶性变是肿瘤细胞丧失自发凋亡反应能力的最终结果。鉴于此，我们在实验中观察到细胞凋亡是有积极意义的，这可能与我们应用TIL加IL-2瘤体内注射有关。在体外的研究中，人们已经发现T细胞、K细胞经过凋亡途径诱导靶细胞死亡〔5〕，而且由T细胞介导的凋亡可以不因bcl-2基因的表达而受抑制，后者因能抑制各种因素引起的凋亡，保护正常细胞和癌细胞免于各种诱导剂诱发的凋亡而被认为是能够特异抑制凋亡的所谓存活基因(survival gene)，在凋亡调控中最具重要意义〔8〕。因此在各种诱导肿瘤细胞凋亡的战略中，T细胞介导的凋亡具有突出的地位。对于本实验出现的凋亡，我们认为可能与TIL的直接作用有关外，还与IL-2的瘤内注射进一步激活TIL，并使其分泌TNF有关。目前认为TIL介导凋亡的机制可能是①通过穿孔素介导的胞吐颗粒酶激活细胞DNase而引起凋亡；②通过TIL膜上的Fas L与表达于瘤细胞上Fas结合启动凋亡；③通过TIL分泌的TNF或淋巴毒素诱导凋亡〔9〕。
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不管通过何种机制，作者认为TIL和IL-2联合应用很重要，因为组织学和电镜观察发现只有实验组Ⅰ的肿瘤组织内出现广泛的细胞凋亡现象，而其它各组没有类似的表现。同时此现象也提示，诱导Lewis肺癌凋亡可能是TIL联合IL-2产生明显抑瘤作用的可能机制之一。
基金项目：湖北省教委重点科研基金资助项目
作者简介：唐华，男，30岁，硕士，主治医师
陈德基，男，61岁，教授，硕士生导师。研究方向：肿瘤病理
参考文献
1 Rosenberg SA, Spiess P, Lafrenier R. A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes. Science, 1986;233:1318
, 百拇医药
2 唐 华，陈德基，周 洁等.肿瘤浸润淋巴细胞与白细胞介素2联用抑制Lewis肺癌生长和转移的研究.中华实验外科杂志，1998；15：156
3 Ohta T, Kikuchi H, Ogata H et al. Effect of anti-CD3 antibody on the generation of interleukin-2-actived lymphocytes from tissues of gastrointestinal cancer. Cancer, 1992;70:741
4 Kerr JFR, Wyllie AHM, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wild-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972;26:239
, 百拇医药
5 Kerr JFR, Winter-Ford CM, Harmon BV. Apoptosis: its significance in cancer and cancer therapy. Cancer, 1994;73:2013
6 Sachs L, Lotem J. Control of programmed cell death in normal and leukomic cells: new implications for therapy. Blood, 1993;82:15
7 孙志贤，罗 瑛.细胞生长因子对程序性细胞死亡的调控.国外医学肿瘤学分册，1994；21：257
8 Hockenbery D, Nunez G, Milliman C et al. Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death. Nature, 1990;348:334
9 孙 玮，周光炎.肿瘤浸润淋巴细胞的杀伤机理及其抗原受体谱的偏移.国外医学免疫学分册，1996；5：231
收稿日期：1998-09-04
修回日期：1998-11-11, 百拇医药
单位：唐华(河南省人民医院病理科，郑州 450003)；陈德基 刘铭球 刘晓翌 徐惠琴 张华亭(湖北医科大学病理教研室，武汉 430071)；周洁(解放军广州医学高等专科学校，广州 510000)
关键词：凋亡；肿瘤浸润；淋巴细胞；白细胞介素2；肺肿瘤
临床与实验病理学杂志990218摘要 目的：研究肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)与IL-2联合体内诱导凋亡产生抗瘤作用机理，为应用TIL治疗肺癌提供依据。方法：从Lewis肺癌(LLC)瘤体中分离提取TIL，在含1000 U/ml IL-2的完全培养基中培养后，与LLC细胞以10∶1接种于C57BL/6小鼠腋下，每日1000 U/ml IL-2瘤内注射，并测量肿瘤体积，于接种后第18天处死小鼠。结果：发现TIL加IL-2有明显地抑制LLC生长的作用(P<0.001)，HE染色、TUNEL和电镜均证实TIL加IL-2可明显诱导Lewis肺癌细胞凋亡。结论：诱导凋亡产生可能是TIL与IL-2联合抗瘤的机制之一。
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中国图书分类号 R734.2； R329.25 文献标识码 A 文章编号 1001-7399(1999)02-0143-03
Study on anti-tumor effect of tumor-infiltrating lymphocytes from lung cancer combining with IL-2: induce apoptosis in vivo
Tang Hua
(Dept of Pathol, People＇s Hospital of Henan Province, Zhengzhou 450003)
Chen Deji Liu Mingqiu et al
(Dept of Pathol, Hubei Medical University, Wuhan 430071)
, 百拇医药
ABSTRACT Purpose To study the mechanism of anti-tumor in vivo of tumor-infiltrating lymphocytes(TILs). Methods TILs isolated from Lewis lung cancer (LLC) implanted in C57BL/6 mice, which were cultured with IL-2, were implanted into C57BL/6 mice together with LLC cells, which the ratio of TIL: LLC cells was 10∶1. These mice were injected 1000 U IL-2 and the tumor size were measured. On the eighteenth day after the cells having been implanted, the mice were killed. Results The data suggested that TILs plus IL-2 can significantly suppress tumor growth (P<0.01). Histologically, TUNEL and ultrastructure confirmed that TILs combining with IL-2 had the effect of inducing the presence of LLC apoptosis. Conclusion The results indicate that inducing apoptosis in vivo may be one of the mechanism of the anti-tumor effect of TILs combining with IL-2.
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KEY WORDS apoptosis; lymphocytes tumor-infiltrating; interleukin-2; lung neoplasms
1 材料和方法
1.1 材料 实验小鼠为C57BL/6 8～12周龄，雌雄兼备，购自北京医科大学实验动物部。LLC瘤株为Lewis肺癌可移植性瘤株，购自中国医学科学院药物研究所药理二室。白细胞介素2(IL-2)购自北京军事医学科学院邦定生物医学公司。TUNEL凋亡检测试剂盒购自华美公司。
1.2 方法
1.2.1 TIL的制备培养 参照Ohta〔3〕方法，稍加修改。从荷Lewis肺癌的C57BL/6小鼠体内无菌取瘤，去除出血坏死及脂肪组织，剪切成糊状(1 mm3大小)，于混合酶(含0.1%胶原酶Ⅰ，0.01%透明质酸酶和0.004% DNase)中，37℃消化1～2 h，过尼龙网后的单细胞悬液铺于下层比重1.088、上层比重1.075的等体积双层分离液上，1 500 r.min-1离心20 min。吸两分层液间细胞(TIL)，PBS洗2次，用含1 000 U/ml IL-2的完全培养基重悬，并铺于24孔培养板上，每孔1 ml，37℃，5%CO2培养，隔2天半量换液。
, 百拇医药
1.2.2 实验分组 实验分为4组，每组10只，每组小鼠皆于左侧腋窝皮下接种相同量的LLC细胞，同时，实验组Ⅰ和实验组Ⅱ小鼠在接种肿瘤的同时还接种10倍于LLC细胞的TIL。
1.2.3 实验处理 自接种之日起，作以下处理：实验组Ⅰ于接种部位皮下(肿瘤长出后为瘤内)每日注射2 000 U/ml的IL-2 0.5 ml；实验组Ⅱ每日皮下注射生理盐水0.5 ml；实验组Ⅲ每日注射2 000 U/ml的IL-2 0.5 ml；对照组每日注射生理盐水0.5 ml。
1.2.4 肿瘤大小的观察 在作上述处理的同时，每日观察肿瘤的生长情况，以直径大于2 mm为发瘤的标志，用游标卡尺测量每一肿瘤的最大直径(a)和最小横径(b)，按公式V=πa×b2/6计算肿瘤的体积。
1.2.5 组织学及电镜观察 (A)HE染色：于接种后第18天引颈处死小鼠，完整剥离肿瘤，常规石蜡切片，HE染色；(B)TUNEL标记：方法参照试剂盒说明书进行；(C)电镜：取新鲜的癌组织，常规固定，浸透包埋，超薄切片，染色，H-600透射电镜观察。
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1.2.6 统计学处理 全部数据用t检验处理。
2 结果
2.1 肿瘤生长速度和体积 对照组和实验组Ⅱ、Ⅲ的生长速度明显高于实验组Ⅰ；第18天处死小鼠时，实验组Ⅰ肿瘤体积与其它各组比较，差异有高度显著性(P<0.001)，见表1。
表1 TIL加IL-2在小鼠体内对LLC瘤体体积的影响(
) 组别n
肿瘤体积
t值
实验组Ⅰ
10
, http://www.100md.com
2.59±1.49
00
对照组
10
6.37±1.43
5.79*
00
实验组Ⅱ
10
6.41±1.45
5.80*
0.059
, http://www.100md.com
00
实验组Ⅲ
10
6.08±1.77
4.76*
0.41
0.46
00示对比组，*P<0.001
2.2 组织学变化及超微结构改变 实验组Ⅰ与其他各组相比组织学上最显著的变化特征为：在实验组Ⅰ存活的瘤组织内出现广泛分布的凋亡瘤细胞，这些细胞一般单个散在或灶性分布于存活的瘤细胞之间，细胞胞体收缩变圆变小，胞膜完整，与邻接细胞脱离，成一圈空晕，形似陷窝。在HE染色片上凋亡细胞胞浆嗜伊红染。核高度浓染，形态上，或收缩成圆形，或由于染色质边集而成环形、新月形，或裂解成不规则的碎片散落于红染的胞浆内。凋亡细胞周围不见炎性反应。此外实验组Ⅰ的瘤组织周边有大量的淋巴细胞浸润。
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电镜下观察进一步证实了光镜的观察结果。电镜下早期的凋亡瘤细胞胞体收缩变圆变小，微绒毛消失，胞膜平滑，胞浆浓缩，密度升高，其内可见内质网肿胀形成的空泡。核染色质浓缩向核膜凝集，成新月形，核仁消失，并可见核周隙增宽的现象。中期的凋亡细胞，与周围细胞脱离，细胞表面突出许多泡状凸起(发泡，budding)，胞浆进一步浓聚，密度增高，内质网扩张成泡状，核高度凝集扭曲成致密的团块，并可见裂解的核碎片。还可见凋亡小体被周围的瘤细胞吞噬、消化的现象。
3 讨论
1986年Rosenberg〔1〕报道TIL比LAK细胞活性高100倍以来，TIL在肿瘤的过继免疫治疗中的作用备受人们的关注。此后许多作者报道了各种关于TIL基础的以及临床的研究工作。本实验以及我们以前的报道中，曾指出TIL与IL-2联合应用有明显的抗瘤作用，并且本实验还发现无论在光镜还是在电镜下都观察到实验组Ⅰ瘤组织内出现的瘤细胞凋亡，而其他各组没有见到类似现象〔2〕。这对于认识TIL联合IL-2产生抗瘤作用的机制有重要意义。
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凋亡是生命活动的正常组成部分，和坏死一样是细胞死亡的方式之一，但在形态学、发生频率和继发改变上与坏死相比，具有明显的特征。这种死亡过程不象坏死那样发生细胞内含物外泄，故不引起炎症反应。也不象坏死那样成片发生，一般呈单个和小灶性散在分布〔4，5〕。
凋亡过程的紊乱将导致发育异常和加快肿瘤的发生〔6〕，许多证据表明肿瘤的发生与凋亡紊乱有着密切关系，而近年的研究表明，很多抗癌药是通过诱发肿瘤细胞凋亡来发挥作用的。诱发肿瘤细胞凋亡是进行肿瘤治疗的新思路，因为人们已经认识到，很多肿瘤的发生不仅由于细胞增殖速率很高，而且与细胞死亡速率下降有关。孙志贤等〔7〕指出，抗瘤治疗的效果是同癌细胞生成反应的内在能力(intrinsic ability)密切相关的；而恶性变是肿瘤细胞丧失自发凋亡反应能力的最终结果。鉴于此，我们在实验中观察到细胞凋亡是有积极意义的，这可能与我们应用TIL加IL-2瘤体内注射有关。在体外的研究中，人们已经发现T细胞、K细胞经过凋亡途径诱导靶细胞死亡〔5〕，而且由T细胞介导的凋亡可以不因bcl-2基因的表达而受抑制，后者因能抑制各种因素引起的凋亡，保护正常细胞和癌细胞免于各种诱导剂诱发的凋亡而被认为是能够特异抑制凋亡的所谓存活基因(survival gene)，在凋亡调控中最具重要意义〔8〕。因此在各种诱导肿瘤细胞凋亡的战略中，T细胞介导的凋亡具有突出的地位。对于本实验出现的凋亡，我们认为可能与TIL的直接作用有关外，还与IL-2的瘤内注射进一步激活TIL，并使其分泌TNF有关。目前认为TIL介导凋亡的机制可能是①通过穿孔素介导的胞吐颗粒酶激活细胞DNase而引起凋亡；②通过TIL膜上的Fas L与表达于瘤细胞上Fas结合启动凋亡；③通过TIL分泌的TNF或淋巴毒素诱导凋亡〔9〕。
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不管通过何种机制，作者认为TIL和IL-2联合应用很重要，因为组织学和电镜观察发现只有实验组Ⅰ的肿瘤组织内出现广泛的细胞凋亡现象，而其它各组没有类似的表现。同时此现象也提示，诱导Lewis肺癌凋亡可能是TIL联合IL-2产生明显抑瘤作用的可能机制之一。
基金项目：湖北省教委重点科研基金资助项目
作者简介：唐华，男，30岁，硕士，主治医师
陈德基，男，61岁，教授，硕士生导师。研究方向：肿瘤病理
参考文献
1 Rosenberg SA, Spiess P, Lafrenier R. A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes. Science, 1986;233:1318
, 百拇医药
2 唐 华，陈德基，周 洁等.肿瘤浸润淋巴细胞与白细胞介素2联用抑制Lewis肺癌生长和转移的研究.中华实验外科杂志，1998；15：156
3 Ohta T, Kikuchi H, Ogata H et al. Effect of anti-CD3 antibody on the generation of interleukin-2-actived lymphocytes from tissues of gastrointestinal cancer. Cancer, 1992;70:741
4 Kerr JFR, Wyllie AHM, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wild-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972;26:239
, 百拇医药
5 Kerr JFR, Winter-Ford CM, Harmon BV. Apoptosis: its significance in cancer and cancer therapy. Cancer, 1994;73:2013
6 Sachs L, Lotem J. Control of programmed cell death in normal and leukomic cells: new implications for therapy. Blood, 1993;82:15
7 孙志贤，罗 瑛.细胞生长因子对程序性细胞死亡的调控.国外医学肿瘤学分册，1994；21：257
8 Hockenbery D, Nunez G, Milliman C et al. Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death. Nature, 1990;348:334
9 孙 玮，周光炎.肿瘤浸润淋巴细胞的杀伤机理及其抗原受体谱的偏移.国外医学免疫学分册，1996；5：231
收稿日期：1998-09-04
修回日期：1998-11-11, 百拇医药