食管癌组织中HPV16、18E6蛋白和P21、P53癌基因产物的免疫组化研究
作者：任占平 石 陈蔚麟 唐德艳
单位：柳州市人民医院病理科
关键词：食管；鳞状细胞癌；人乳头瘤病毒；癌基因蛋白质类；免疫组化
广西医学990211 摘要 采用SP免疫组化法对柳州地区45例食管鳞状细胞癌和25例食管粘膜慢性炎对照组材料进行HPV16，18E6蛋白和P21ras、P53癌基因蛋白产物的检测。结果显示：癌组中E6、P21ras和P53的阳性率分别为66.44%，88.89%和62.22%，与对照组相比差异十分显著(P<0.01)。癌组中E6、P53呈双阳性者为51.11%(23/45)，且86.95%(20/23)二者阳性着色表达在相同区域同一癌细胞核内，似表明HPV16，18E6可与P53结合从而导致野生型P53的突变或降解。P21ras与P53，P53与E6的阳性表达均具显著相关性(P<0.05)。提示：HPV16，18感染与活化的癌基因协同，在本地区食管癌发生机制中起着重要的作用。
, 百拇医药
一些研究已证实人乳头瘤病毒(HPV)16，18型感染与食管鳞状细胞癌病因学密切相关(1)，我们采用免疫组化技术，对本地区人口食管癌组织进行HPV16，18E6、P21ras和P53癌基因产物的检测，以探讨高危HPV16，18感染、癌基因激活在本地区食管癌发生机制中的作用。
1 材料和方法
1.1 研究对象：取我科1991年至1993年柳州地区人口食管鳞状细胞癌标本共45例，其中男性35例，女性10例，年龄34～78岁。标本经10%福尔马林固定，常规石蜡切片，HE染色，病理诊断参照孙绍谦等(2)提出的食管鳞状细胞癌三级分类法，诊为Ⅰ级4例，Ⅱ级29例，Ⅲ级12例。随机取同期诊为食管粘膜慢性炎25例为对照组。
1.2 试剂：SPkit和P21ras、P53单抗均为美国Zymed公司产品，购自福州迈新生物公司。HPV16，18型早期蛋白E6单抗为美国Santa Cruz公司产品(HPV-C1P5)，购自北京中山生物公司。
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1.3 操作步骤：免疫组化染色采用链霉菌素生物素蛋白-过氧化酶(SP)法，其中P53组织切片经抗原微波恢复处理，染色步骤按文献进行(3，4)。结果判断：P21ras以胞浆及胞浆内侧，P53和E6则以胞核内出现棕黄色颗粒为阳性标记，按着色强度分为三级：淡棕黄色，疏稀，颗粒细为(+)；棕褐色，密集，颗粒粗为(+++)；介于二者之间为(++)。无着色反应为阴性(-)。E6用已知宫颈癌，P53、P21ras用已知大肠癌阳性切片作阳性对照；以PBS液取代第一抗体作阴性对照。
1.4 统计学方法：统计学处理采用χ2检验。
2 结果
2.1 食管鳞癌与对照组HPV16，18E6、P21ras、P53免疫组化检测的结果见表1。经统计学处理，癌组中HPV16，18E6、P21ras、P53的阳性率与对照组差异均十分显著(P<0.01)。此外，癌组中E6、P21ras及P53的阳性表达与癌组织分化程度无关。
, 百拇医药
表1食管鳞状细胞癌，食管粘膜慢性炎免疫组化检测结果
HPV16，18E6
阳性率
(%)
P21ras
阳性率
(%)
P53
阳性率
(%)
(-)
(+)～(+++)
, 百拇医药
(-)
(+)～(+++)
(-)
(+)～(+++)
食管鳞状细胞癌
45
16
29
64.44
5
40
88.89
17
, 百拇医药
28
62.22
食管粘膜慢性炎
25
25
0
0
24
1
4.16
23
2
8.69
, 百拇医药 2.2 癌组中，44.44%(20/45)同时表达HPV16，18E6、P21ras、P53阳性。在40例P21ras阳性中27例也同时表达P53阳性。29例E6阳性中有23例亦同时表达P53阳性。经统计学处理，P21ras与P53、P53与E6的阳性表达均具显著相关性(P<0.05)。
2.3 HPV16，18E6阳性见于各层癌细胞核内，但以基底层及上层为多，20例组织学上见到有HPV感染特征如挖空细胞样癌细胞，其中17例显示E6阳性。值得注意的是，在23例E6、P53双阳性者中，86.95%(20/23)显示二者阳性着色表达在相同区域同一癌细胞核内，似表明HPV16，18的E6蛋白可与细胞内野生型P53结合从而导致P53的突变或降解。
, 百拇医药
3 讨论
高危HPV16，18型感染与人类一些恶性肿瘤的病因学密切相关，分子生物学和免疫组织学技术已证实在宫颈癌、肺癌、食管癌、大肠癌等肿瘤组织中有HPV16，18的存在(5)。高危组HPV16，18为DNA肿瘤病毒，其基因组分为早期(E)和晚期(L)两个功能组，E基因组中E6、E7基因主要涉及细胞的转化，当HPV16，18感染宿主细胞后，其DNA常整合在宿主细胞核的染色体中，从而激活了调节病毒生长的E6、E7基因片断，HPV16，18E6的致癌机理在于E6蛋白通过与细胞内E6-AP(associated protein)形成复合物，特异性地与野生型P53结合，导致抑癌基因P53在酶的作用下快速降解、灭活(6)。此外，HPV感染后可经插入人染色体组的某一位点致P53突变(7)。因而，HPV16，18感染所致P53的灭活或突变，均可导致P53对细胞周期相关因子的调节作用丧失，细胞周期调控异常，从而导致肿瘤的发生，现已认为HPV16，18的E6、E7是致癌的关键。
, 百拇医药
目前国内对HPV16，18感染的检测手段主要采用PCR和原位杂交法。前者不能很好地与组织形态学结合，后者则操作复杂不利于基层医院推广应用。HPV16，18E6单抗可用于福尔马林固定、石蜡包埋切片组织中，具有操作简便，敏感性、特异性强的优点。本组癌组中E6的阳性率达64.44%，表明其可有效地应用于高危HPV16，18型感染与肿瘤病因学关系的研究中。此外，我们从组织上证实HPV16，18E6与P53在同一癌细胞核内显示阳性表达，提示E6、P53的结合可致P53的降解或突变并可从蛋白水平上表达出来，这将有助于对HPV感染与肿瘤发生机制的研究提供新的思路。
HPV16，18感染后恶变细胞的转化形成过程中需要在活化的ras、c-myc等癌基因的协同参与下进行，而ras基因的点突变可发生在食管癌的起始阶段。研究证实，活化的ras基因与HPV16，18的E6、E7协同能永生化小鼠的原始肾细胞(6，8)。本组中P21ras的阳性率达88.89%，且P21ras与P53、P53与E6的阳性表达均有显著相关性。本研究结果表明：高危HPV16，18感染并在突变的P53、ras癌基因协同下，在本地区食管癌的发生机制中起着十分重要的作用。
, 百拇医药
参考文献
[1]Ono H,Takahashi A,Ogosih S,et al.Relationship between H-ras P21 product and P53 protein or high-risk human papillomaviruses in esophageal cancer from Kochi Japan.Am J Gastroenterol 1994；89(4)：646
[2]杜白廉.食管癌.第1版.北京：中国科学技术出版社，1994：198
[3]施作榕.链霉菌亲生物素蛋白-生物素酶标免疫组化染色法的初步研究.中华免疫学杂志 1986；2(3)：169
[4]任占平，石
，陈蔚麟，等.宫颈癌组织中HPV16，18E6蛋白表达的观察.中华病理学杂志 1997；26(3)：161
, http://www.100md.com
[5]Kulski JK,Demeter T,Matav dizic S,et al.Survey of histogic specimens of human cancer for human papillomavirus tyep 6/11/16/18 by filter in situ hybridization.Am J Clin Pathol 1990；94(5)：566
[6]Herrington CS.Human papillomaviruses and cervical neoplasia .Ⅱ. Interaction of HPV with other factors.J Clin Pathol 1995；48(1)：1
[7]笪冀平，胡益云，陈乐真，等.肺癌人乳头瘤病毒感染与P53基因突变的研究.中华肿瘤杂志 1996；18(1)：27
[8]吴
，肖枫，王秀琴.人食管癌的细胞和分子遗传学研究.中华肿瘤杂志 1996；18(1)：73, 百拇医药
单位：柳州市人民医院病理科
关键词：食管；鳞状细胞癌；人乳头瘤病毒；癌基因蛋白质类；免疫组化
广西医学990211 摘要 采用SP免疫组化法对柳州地区45例食管鳞状细胞癌和25例食管粘膜慢性炎对照组材料进行HPV16，18E6蛋白和P21ras、P53癌基因蛋白产物的检测。结果显示：癌组中E6、P21ras和P53的阳性率分别为66.44%，88.89%和62.22%，与对照组相比差异十分显著(P<0.01)。癌组中E6、P53呈双阳性者为51.11%(23/45)，且86.95%(20/23)二者阳性着色表达在相同区域同一癌细胞核内，似表明HPV16，18E6可与P53结合从而导致野生型P53的突变或降解。P21ras与P53，P53与E6的阳性表达均具显著相关性(P<0.05)。提示：HPV16，18感染与活化的癌基因协同，在本地区食管癌发生机制中起着重要的作用。
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一些研究已证实人乳头瘤病毒(HPV)16，18型感染与食管鳞状细胞癌病因学密切相关(1)，我们采用免疫组化技术，对本地区人口食管癌组织进行HPV16，18E6、P21ras和P53癌基因产物的检测，以探讨高危HPV16，18感染、癌基因激活在本地区食管癌发生机制中的作用。
1 材料和方法
1.1 研究对象：取我科1991年至1993年柳州地区人口食管鳞状细胞癌标本共45例，其中男性35例，女性10例，年龄34～78岁。标本经10%福尔马林固定，常规石蜡切片，HE染色，病理诊断参照孙绍谦等(2)提出的食管鳞状细胞癌三级分类法，诊为Ⅰ级4例，Ⅱ级29例，Ⅲ级12例。随机取同期诊为食管粘膜慢性炎25例为对照组。
1.2 试剂：SPkit和P21ras、P53单抗均为美国Zymed公司产品，购自福州迈新生物公司。HPV16，18型早期蛋白E6单抗为美国Santa Cruz公司产品(HPV-C1P5)，购自北京中山生物公司。
, 百拇医药
1.3 操作步骤：免疫组化染色采用链霉菌素生物素蛋白-过氧化酶(SP)法，其中P53组织切片经抗原微波恢复处理，染色步骤按文献进行(3，4)。结果判断：P21ras以胞浆及胞浆内侧，P53和E6则以胞核内出现棕黄色颗粒为阳性标记，按着色强度分为三级：淡棕黄色，疏稀，颗粒细为(+)；棕褐色，密集，颗粒粗为(+++)；介于二者之间为(++)。无着色反应为阴性(-)。E6用已知宫颈癌，P53、P21ras用已知大肠癌阳性切片作阳性对照；以PBS液取代第一抗体作阴性对照。
1.4 统计学方法：统计学处理采用χ2检验。
2 结果
2.1 食管鳞癌与对照组HPV16，18E6、P21ras、P53免疫组化检测的结果见表1。经统计学处理，癌组中HPV16，18E6、P21ras、P53的阳性率与对照组差异均十分显著(P<0.01)。此外，癌组中E6、P21ras及P53的阳性表达与癌组织分化程度无关。
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表1食管鳞状细胞癌，食管粘膜慢性炎免疫组化检测结果
HPV16，18E6
阳性率
(%)
P21ras
阳性率
(%)
P53
阳性率
(%)
(-)
(+)～(+++)
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(+)～(+++)
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食管鳞状细胞癌
45
16
29
64.44
5
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88.89
17
, 百拇医药
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62.22
食管粘膜慢性炎
25
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4.16
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, 百拇医药 2.2 癌组中，44.44%(20/45)同时表达HPV16，18E6、P21ras、P53阳性。在40例P21ras阳性中27例也同时表达P53阳性。29例E6阳性中有23例亦同时表达P53阳性。经统计学处理，P21ras与P53、P53与E6的阳性表达均具显著相关性(P<0.05)。
2.3 HPV16，18E6阳性见于各层癌细胞核内，但以基底层及上层为多，20例组织学上见到有HPV感染特征如挖空细胞样癌细胞，其中17例显示E6阳性。值得注意的是，在23例E6、P53双阳性者中，86.95%(20/23)显示二者阳性着色表达在相同区域同一癌细胞核内，似表明HPV16，18的E6蛋白可与细胞内野生型P53结合从而导致P53的突变或降解。
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3 讨论
高危HPV16，18型感染与人类一些恶性肿瘤的病因学密切相关，分子生物学和免疫组织学技术已证实在宫颈癌、肺癌、食管癌、大肠癌等肿瘤组织中有HPV16，18的存在(5)。高危组HPV16，18为DNA肿瘤病毒，其基因组分为早期(E)和晚期(L)两个功能组，E基因组中E6、E7基因主要涉及细胞的转化，当HPV16，18感染宿主细胞后，其DNA常整合在宿主细胞核的染色体中，从而激活了调节病毒生长的E6、E7基因片断，HPV16，18E6的致癌机理在于E6蛋白通过与细胞内E6-AP(associated protein)形成复合物，特异性地与野生型P53结合，导致抑癌基因P53在酶的作用下快速降解、灭活(6)。此外，HPV感染后可经插入人染色体组的某一位点致P53突变(7)。因而，HPV16，18感染所致P53的灭活或突变，均可导致P53对细胞周期相关因子的调节作用丧失，细胞周期调控异常，从而导致肿瘤的发生，现已认为HPV16，18的E6、E7是致癌的关键。
, 百拇医药
目前国内对HPV16，18感染的检测手段主要采用PCR和原位杂交法。前者不能很好地与组织形态学结合，后者则操作复杂不利于基层医院推广应用。HPV16，18E6单抗可用于福尔马林固定、石蜡包埋切片组织中，具有操作简便，敏感性、特异性强的优点。本组癌组中E6的阳性率达64.44%，表明其可有效地应用于高危HPV16，18型感染与肿瘤病因学关系的研究中。此外，我们从组织上证实HPV16，18E6与P53在同一癌细胞核内显示阳性表达，提示E6、P53的结合可致P53的降解或突变并可从蛋白水平上表达出来，这将有助于对HPV感染与肿瘤发生机制的研究提供新的思路。
HPV16，18感染后恶变细胞的转化形成过程中需要在活化的ras、c-myc等癌基因的协同参与下进行，而ras基因的点突变可发生在食管癌的起始阶段。研究证实，活化的ras基因与HPV16，18的E6、E7协同能永生化小鼠的原始肾细胞(6，8)。本组中P21ras的阳性率达88.89%，且P21ras与P53、P53与E6的阳性表达均有显著相关性。本研究结果表明：高危HPV16，18感染并在突变的P53、ras癌基因协同下，在本地区食管癌的发生机制中起着十分重要的作用。
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参考文献
[1]Ono H,Takahashi A,Ogosih S,et al.Relationship between H-ras P21 product and P53 protein or high-risk human papillomaviruses in esophageal cancer from Kochi Japan.Am J Gastroenterol 1994；89(4)：646
[2]杜白廉.食管癌.第1版.北京：中国科学技术出版社，1994：198
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，陈蔚麟，等.宫颈癌组织中HPV16，18E6蛋白表达的观察.中华病理学杂志 1997；26(3)：161, http://www.100md.com
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[6]Herrington CS.Human papillomaviruses and cervical neoplasia .Ⅱ. Interaction of HPV with other factors.J Clin Pathol 1995；48(1)：1
[7]笪冀平，胡益云，陈乐真，等.肺癌人乳头瘤病毒感染与P53基因突变的研究.中华肿瘤杂志 1996；18(1)：27
[8]吴
，肖枫，王秀琴.人食管癌的细胞和分子遗传学研究.中华肿瘤杂志 1996；18(1)：73, 百拇医药