抗AFP抗体双标记法及其产物特性测定
作者：周德南 甘友全 李志革 吴英德 黄秉琰
单位：广西肿瘤防治研究所
关键词：抗甲胎蛋白抗体；单克隆抗体；131I；丝裂霉素C；放射免疫显像
广西医学990201 摘要 采用氯胺丁改良法和过碘酸钠氧化法，进行抗AFP多抗或单抗直接双标记131和MMC，过Sephadex-G50柱并以r计数仪与紫外分光光度仪同步监测分离、收集标记物。经测定多抗和单抗双标记物，标记比分别为70.3MBq∶mg∶2.2μg和59.2MBq∶mg∶1.8μg；放化纯度98%和97%；131利用率83%和88%；抗体回收率62%和74%；标记后与标记前相比抗体活性均无明显降低。置4℃5d和10d时，抗体活性不受影响；放化纯度分别降为95%和92%、91%和88%。经裸鼠人肝癌模型放免显像，72h即见肿瘤区有放射性浓集，至120h肿瘤显像最清晰。结果表明，多抗和单抗的双标记物的生物、理化性质稳定。为免疫导向治疗肝癌提供了一种新型的“双弹头”导向药物。
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Double Lable Method of Anti-AFP Antibody and Determination of its Production Character.
Zhou Denan,Gan Youquan,Li Zhige,et al.Guangxi Cancer Institute(Nanning 530027).
Abstract Anti-AFP polyclonal antibody(PcAb) or monoclonal antibody(McAb) was labeled directly with 131Ⅰ and Mitomycine C(MMC) by modified Chloramin-T method and sodium periodate oxidation method respectively.The double labels were gained when the mixture passed through Sephadex G-50 column,which were monitored,separated synchronously with Gamma counter and ultraviolet spectrophotrometry.The label ratioes of the labeled PcAb and McAb were(131Ⅰ∶anti-AFP PcAb or McAb∶MMC)70.3MBq∶mg∶2.2μg and 59.2MBq∶mg∶1.8μg respectively.The radiochemical purity,the rates of 131Ⅰ utilization and antibody recovery were 98%,83%,62% and 97%,88%,74%respectively.There was no loss of immunoreactivity before and after label.In vitro,the immunoreactivity was not affected when the label antibody was stored at4℃ on day 5 and day 10.The radioimmunoimage in nude mice bearing liver cancer model showed that radioactive accumulation was seen in the tumor area on the day 3,and the tumor image was most distinct on day 5.These results indicate that the biological and physicochemical properties of the labeled antibody is stable.It has provided a new type“dual warhead”targetting drug for RIT in the treatment of patients with PLC.
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Key wods Anti-α-fetoprotein antibldy;Monoclonal antibldy;131Ⅰ;Mitomycine C;Radioimmunoimage
目前，肝癌免疫导向治疗在肝癌的综合治疗中发挥了重要作用(1)。但近10多年来的研究资料显示，其临床应用效果尚不令人满意。究其原因，影响因素甚多。其中弹头单一，杀伤力有限是较重要因素之一。鉴于此，我们进行了用131和丝裂霉素C(MMC)双标记抗AFP多克隆抗体(多抗)或抗AFP单克隆抗体(单抗)的制备研究。并测定了其生物和理化特性。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 抗体的纯化：多抗为马抗人AFP血清(由本所制备)(2)，先用盐析法粗提IgG，再经亲和层析法纯化抗AFP，蛋白量为17mg/ml，双扩散效价为1∶120以上。单抗为大鼠抗人AFP杂交瘤细胞株(HRA964和HRA978)分泌的腹水(由本所制备)(3)，分属IgG1和IgG2a，其亲和力强，能识别不同表位。腹水按1∶1混合后用辛酸法及盐析法纯化IgG。蛋白量为18mg/ml，用ELISA测定滴度为1×10-6。经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，抗体纯度均达电泳纯。并经除菌后分装贮存于-30℃备用。
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1.2 抗AFP抗体的双标记法：多抗或单抗先以氯胺T改良法标记131，再与经过碘酸钠氧化的MMC偶联，直接进行双标记后即过Sephadex-G50柱，并以γ计数仪与紫外分光光度计同步监测分离、收集双标记物。经除菌后分装并贮存于4℃备用。
1.3 双标记物特性的测定：双标记物中的多抗或单抗及MMC的含量均用紫外分光光度计测定；131含量用同位素活度计测定。再按以下各式计算。标记比=131ⅠMBq∶抗体mg∶MMCμg；抗体回收率=标记物蛋白量÷抗入总蛋白量×100%；131Ⅰ利用率=标记物131Ⅰ含量MBq÷投入131Ⅰ总量MBq×100%。放化纯度用三氯醋酸沉淀法分离结合物131Ⅰ和游离131Ⅰ，再分别测定其131Ⅰ含量，按下式计算：放化纯度=沉淀物131Ⅰ含量MBq÷(沉淀物131Ⅰ含量MBq+上清液131Ⅰ含量MBq)×100%。多抗双标记物的抗体活性用双扩散法测定效价，单抗双标记物的抗体活性用ELISA测定滴度。在4℃保存5d和10d时分别测定抗体活性及放化纯度。以观察双标记物的稳定性。
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1.4 双标记物的导向定位作用：裸鼠人肝癌模型由上海医科大学肝癌研究所提供并协助完成放射免疫显像。裸鼠在给药前3天在饮水中加入1%碘化钾，以封闭甲状腺。将裸鼠随机分为多抗双标记物、单抗双标记物及131Ⅰ+多抗、131Ⅰ+单抗等共4组，每组5只。采用单次同131Ⅰ剂量(9.25MBq/只)腹腔内注射给药。于24h、48h、72h、120h和144h进行静态显像观察。
2 结果
2.1 多抗和单抗的双标记物：标记比分别为：131Ⅰ70.3MBq∶多抗mg∶MMC2.2μg和131Ⅰ59.2MBq∶单抗mg∶MMC1.8μg；放化纯度分别为98%和97%；131Ⅰ利用率分别为83%和88%；抗体回收率分别为62%和74%；抗体活性标记后与标记前相比，均无明显降低。
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2.2 双标记物的稳定性：多抗双标记物和单抗双标记物置4℃保存5d和10d时，抗体活性均不受影响。放化纯度，多抗双标记物分别降为95%和91%；单抗双标记物分别降为92%和88%。
2.3 在裸鼠人肝癌模型放射免疫显像结果：给药后72h时即见肿瘤区有放射性浓集，至120h时显像最清晰。两组动物显像大致相同。多抗或单抗与131Ⅰ混合组均无放射性浓集、显像。
3 讨论
近20年来，应用于免疫导向治疗肝癌实验与临床研究的药物“生物导弹”较多(4)。但多为单一核素或单一化疗药的单弹头导向药物。因弹头单一，其杀伤力有限，从而影响了免疫导向治疗的效果。故此，研制更具杀伤力的双弹头或多弹头的新型免疫导向治疗药物，已成为肝癌导向治疗研究的新热点之一。现已有：陈晓星等(5)，制备了结合131Ⅰ和MMC的明胶微球和随延仿等(6)，采用氯胺T和间接交联法制备131Ⅰ及阿霉素肝癌“双弹头”组合单抗导向药物。并已应用于实验研究，均获得了较好疗效。我们采用氯胺T改良法和过碘酸钠氧化法，直接将131Ⅰ和MMC双标记抗AFP多抗和单抗。使这一双标记物既保持了抗AFP抗体的导向定位性能，又集放射性核素与抗癌药物于一体，使其具备了放射性直接杀伤和抗癌药物直接抑制癌细胞的双重疗效，更具杀伤力。而且无中间载体，使其分子量不至于过大，更易进入靶细胞内。自1992年至今，我们已成功地制备了多抗双标记物和单抗双标记物，并已应用131Ⅰ-抗AFP Ab-MMC和131Ⅰ-抗AFP McAb MMC分别进行了实验与临床研究，均取得了较好的效果(7，8)。初步显示了这一制剂-抗AFP多抗双标物和单抗双标记物的应用前景。
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据上述结果表明：抗AFP多抗或单抗的双标记物，其抗体活性良好、能导向定位于裸鼠人肝癌模型的靶细胞上。经置4℃保存5d和10d观察测定，其生物及理化性质较稳定。是一种集内放疗和化疗于一体的新型免疫导向治疗肝癌药物。本制备方法简便、快速，能直接进行双标记131Ⅰ放射性核素和MMC，使双标记物的分子量不至过大而更易导向定位于靶细胞上。用γ计数仪与紫外分光光度计同步监测过Sephadex-G50柱分离、收集双标记物，使这一过程更直观化，收集双标记物更准确。更有利于辐射有效防护及大剂量的制备。
参考文献
[1]刘康达，汤钊猷，陆继珍，等.肝癌导向治疗疗效评估.中华肿瘤杂志 1992；14(6)：430
[2]周德南，甘友全，班克臣，等.用广西矮马制备马抗人AFP血清.广西医学院学报 1992；9(3)：49
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[3]贺海平，田春林，周德南，等.大鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体的制备和鉴定.单克隆抗体通讯 1993；9：54
[4]汤钊猷，刘康达，陆继珍，等.肝癌导向治疗研究12年(1983～1995)总结.上海医科大学学报 1995；22(增刊)：1
[5]陈晓星，钟大昌，李 林，等.结合131Ⅰ和丝裂霉素C的明胶微球瘤内注射小鼠实验性肝癌的治疗效果.癌症 1992；11(5)：338
[6]隋延仿，刘 利，王文亮，等.肝癌“双弹头”组合单抗导向治疗的实验研究.肿瘤 1995；15(3)：258
[7]李志革，吴英德，周德南，等.131Ⅰ-抗AFP McAb-MMC“双弹头”免疫导向治疗原发性肝癌的临床观察.中华肿瘤杂志 1996；18(5)：368
[8]吴英德，周德南，甘友全，等.肝癌131Ⅰ-抗AFP抗体-MMC“双弹头”免疫导向治疗的研究.中国癌症杂志 1997，7(3)：184, http://www.100md.com
单位：广西肿瘤防治研究所
关键词：抗甲胎蛋白抗体；单克隆抗体；131I；丝裂霉素C；放射免疫显像
广西医学990201 摘要 采用氯胺丁改良法和过碘酸钠氧化法，进行抗AFP多抗或单抗直接双标记131和MMC，过Sephadex-G50柱并以r计数仪与紫外分光光度仪同步监测分离、收集标记物。经测定多抗和单抗双标记物，标记比分别为70.3MBq∶mg∶2.2μg和59.2MBq∶mg∶1.8μg；放化纯度98%和97%；131利用率83%和88%；抗体回收率62%和74%；标记后与标记前相比抗体活性均无明显降低。置4℃5d和10d时，抗体活性不受影响；放化纯度分别降为95%和92%、91%和88%。经裸鼠人肝癌模型放免显像，72h即见肿瘤区有放射性浓集，至120h肿瘤显像最清晰。结果表明，多抗和单抗的双标记物的生物、理化性质稳定。为免疫导向治疗肝癌提供了一种新型的“双弹头”导向药物。
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Double Lable Method of Anti-AFP Antibody and Determination of its Production Character.
Zhou Denan,Gan Youquan,Li Zhige,et al.Guangxi Cancer Institute(Nanning 530027).
Abstract Anti-AFP polyclonal antibody(PcAb) or monoclonal antibody(McAb) was labeled directly with 131Ⅰ and Mitomycine C(MMC) by modified Chloramin-T method and sodium periodate oxidation method respectively.The double labels were gained when the mixture passed through Sephadex G-50 column,which were monitored,separated synchronously with Gamma counter and ultraviolet spectrophotrometry.The label ratioes of the labeled PcAb and McAb were(131Ⅰ∶anti-AFP PcAb or McAb∶MMC)70.3MBq∶mg∶2.2μg and 59.2MBq∶mg∶1.8μg respectively.The radiochemical purity,the rates of 131Ⅰ utilization and antibody recovery were 98%,83%,62% and 97%,88%,74%respectively.There was no loss of immunoreactivity before and after label.In vitro,the immunoreactivity was not affected when the label antibody was stored at4℃ on day 5 and day 10.The radioimmunoimage in nude mice bearing liver cancer model showed that radioactive accumulation was seen in the tumor area on the day 3,and the tumor image was most distinct on day 5.These results indicate that the biological and physicochemical properties of the labeled antibody is stable.It has provided a new type“dual warhead”targetting drug for RIT in the treatment of patients with PLC.
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Key wods Anti-α-fetoprotein antibldy;Monoclonal antibldy;131Ⅰ;Mitomycine C;Radioimmunoimage
目前，肝癌免疫导向治疗在肝癌的综合治疗中发挥了重要作用(1)。但近10多年来的研究资料显示，其临床应用效果尚不令人满意。究其原因，影响因素甚多。其中弹头单一，杀伤力有限是较重要因素之一。鉴于此，我们进行了用131和丝裂霉素C(MMC)双标记抗AFP多克隆抗体(多抗)或抗AFP单克隆抗体(单抗)的制备研究。并测定了其生物和理化特性。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 抗体的纯化：多抗为马抗人AFP血清(由本所制备)(2)，先用盐析法粗提IgG，再经亲和层析法纯化抗AFP，蛋白量为17mg/ml，双扩散效价为1∶120以上。单抗为大鼠抗人AFP杂交瘤细胞株(HRA964和HRA978)分泌的腹水(由本所制备)(3)，分属IgG1和IgG2a，其亲和力强，能识别不同表位。腹水按1∶1混合后用辛酸法及盐析法纯化IgG。蛋白量为18mg/ml，用ELISA测定滴度为1×10-6。经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，抗体纯度均达电泳纯。并经除菌后分装贮存于-30℃备用。
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1.2 抗AFP抗体的双标记法：多抗或单抗先以氯胺T改良法标记131，再与经过碘酸钠氧化的MMC偶联，直接进行双标记后即过Sephadex-G50柱，并以γ计数仪与紫外分光光度计同步监测分离、收集双标记物。经除菌后分装并贮存于4℃备用。
1.3 双标记物特性的测定：双标记物中的多抗或单抗及MMC的含量均用紫外分光光度计测定；131含量用同位素活度计测定。再按以下各式计算。标记比=131ⅠMBq∶抗体mg∶MMCμg；抗体回收率=标记物蛋白量÷抗入总蛋白量×100%；131Ⅰ利用率=标记物131Ⅰ含量MBq÷投入131Ⅰ总量MBq×100%。放化纯度用三氯醋酸沉淀法分离结合物131Ⅰ和游离131Ⅰ，再分别测定其131Ⅰ含量，按下式计算：放化纯度=沉淀物131Ⅰ含量MBq÷(沉淀物131Ⅰ含量MBq+上清液131Ⅰ含量MBq)×100%。多抗双标记物的抗体活性用双扩散法测定效价，单抗双标记物的抗体活性用ELISA测定滴度。在4℃保存5d和10d时分别测定抗体活性及放化纯度。以观察双标记物的稳定性。
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1.4 双标记物的导向定位作用：裸鼠人肝癌模型由上海医科大学肝癌研究所提供并协助完成放射免疫显像。裸鼠在给药前3天在饮水中加入1%碘化钾，以封闭甲状腺。将裸鼠随机分为多抗双标记物、单抗双标记物及131Ⅰ+多抗、131Ⅰ+单抗等共4组，每组5只。采用单次同131Ⅰ剂量(9.25MBq/只)腹腔内注射给药。于24h、48h、72h、120h和144h进行静态显像观察。
2 结果
2.1 多抗和单抗的双标记物：标记比分别为：131Ⅰ70.3MBq∶多抗mg∶MMC2.2μg和131Ⅰ59.2MBq∶单抗mg∶MMC1.8μg；放化纯度分别为98%和97%；131Ⅰ利用率分别为83%和88%；抗体回收率分别为62%和74%；抗体活性标记后与标记前相比，均无明显降低。
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2.2 双标记物的稳定性：多抗双标记物和单抗双标记物置4℃保存5d和10d时，抗体活性均不受影响。放化纯度，多抗双标记物分别降为95%和91%；单抗双标记物分别降为92%和88%。
2.3 在裸鼠人肝癌模型放射免疫显像结果：给药后72h时即见肿瘤区有放射性浓集，至120h时显像最清晰。两组动物显像大致相同。多抗或单抗与131Ⅰ混合组均无放射性浓集、显像。
3 讨论
近20年来，应用于免疫导向治疗肝癌实验与临床研究的药物“生物导弹”较多(4)。但多为单一核素或单一化疗药的单弹头导向药物。因弹头单一，其杀伤力有限，从而影响了免疫导向治疗的效果。故此，研制更具杀伤力的双弹头或多弹头的新型免疫导向治疗药物，已成为肝癌导向治疗研究的新热点之一。现已有：陈晓星等(5)，制备了结合131Ⅰ和MMC的明胶微球和随延仿等(6)，采用氯胺T和间接交联法制备131Ⅰ及阿霉素肝癌“双弹头”组合单抗导向药物。并已应用于实验研究，均获得了较好疗效。我们采用氯胺T改良法和过碘酸钠氧化法，直接将131Ⅰ和MMC双标记抗AFP多抗和单抗。使这一双标记物既保持了抗AFP抗体的导向定位性能，又集放射性核素与抗癌药物于一体，使其具备了放射性直接杀伤和抗癌药物直接抑制癌细胞的双重疗效，更具杀伤力。而且无中间载体，使其分子量不至于过大，更易进入靶细胞内。自1992年至今，我们已成功地制备了多抗双标记物和单抗双标记物，并已应用131Ⅰ-抗AFP Ab-MMC和131Ⅰ-抗AFP McAb MMC分别进行了实验与临床研究，均取得了较好的效果(7，8)。初步显示了这一制剂-抗AFP多抗双标物和单抗双标记物的应用前景。
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据上述结果表明：抗AFP多抗或单抗的双标记物，其抗体活性良好、能导向定位于裸鼠人肝癌模型的靶细胞上。经置4℃保存5d和10d观察测定，其生物及理化性质较稳定。是一种集内放疗和化疗于一体的新型免疫导向治疗肝癌药物。本制备方法简便、快速，能直接进行双标记131Ⅰ放射性核素和MMC，使双标记物的分子量不至过大而更易导向定位于靶细胞上。用γ计数仪与紫外分光光度计同步监测过Sephadex-G50柱分离、收集双标记物，使这一过程更直观化，收集双标记物更准确。更有利于辐射有效防护及大剂量的制备。
参考文献
[1]刘康达，汤钊猷，陆继珍，等.肝癌导向治疗疗效评估.中华肿瘤杂志 1992；14(6)：430
[2]周德南，甘友全，班克臣，等.用广西矮马制备马抗人AFP血清.广西医学院学报 1992；9(3)：49
, 百拇医药
[3]贺海平，田春林，周德南，等.大鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体的制备和鉴定.单克隆抗体通讯 1993；9：54
[4]汤钊猷，刘康达，陆继珍，等.肝癌导向治疗研究12年(1983～1995)总结.上海医科大学学报 1995；22(增刊)：1
[5]陈晓星，钟大昌，李 林，等.结合131Ⅰ和丝裂霉素C的明胶微球瘤内注射小鼠实验性肝癌的治疗效果.癌症 1992；11(5)：338
[6]隋延仿，刘 利，王文亮，等.肝癌“双弹头”组合单抗导向治疗的实验研究.肿瘤 1995；15(3)：258
[7]李志革，吴英德，周德南，等.131Ⅰ-抗AFP McAb-MMC“双弹头”免疫导向治疗原发性肝癌的临床观察.中华肿瘤杂志 1996；18(5)：368
[8]吴英德，周德南，甘友全，等.肝癌131Ⅰ-抗AFP抗体-MMC“双弹头”免疫导向治疗的研究.中国癌症杂志 1997，7(3)：184, http://www.100md.com