固真方对老龄大鼠免疫功能的调节作用1
作者：刘 颖 赵伟康 凌昌全2 黄雪强2 潘瑞萍2
单位：上海中医药大学生化教研室，上海 200032
关键词：固真方；免疫功能；IL-2；mRNA；IL-6；mRNA
990224 摘 要 目的 从基因转录水平与探讨固真方的免疫调节作用。方法 采用Northern Blot和PT-PCR技术。结果 老龄大鼠脾脏细胞IL-2 mRNA含量低于青龄鼠，IL-6 mRNA含量高于青龄鼠，老龄大鼠体内存在着一定程度的免疫功能紊乱情况；固真方能明显提高老龄大鼠脾脏细胞IL-2 mRNA含量，降低IL-6 mRNA含量。结论 固真方能纠正老年机体免疫功能紊乱，增强机体的抗病能力。
The effect of Guzhen Recipe on the modulation
, 百拇医药
of the immune function of senile rats
Liu Ying Zhao Weikang Ling Changquan et al
Dept.Of Biochemistry of Shanghai University of T.C.M,Shanghai 200032
The methods of Northern Blot and Rt-PCR were used to explore the effect of tonifying kidney prescription—Guzhen Recipe on immune function of senile rats of the gene transciption level.The results showed that as compared with young rats,the expression of Il-2 mRNA of senile rats is decreased while that of IL-6 mRNA is elevated,suggesting that the immunodysregulation exists in aged rats.However,Guzhen Recipe could strengthen the defensive ability.
, 百拇医药
Key words Guzhen Recipe Immunodysregulation IL-2 mRNA IL-6 mRNA
(Original paper see page 104)
中医理论认为“肾精”是产生“肾”各种生理功能最基本的物质基础。随着“肾精”虚衰人体逐渐衰老〔1〕，大量的现代研究表明，中医的“肾”包含着神经内分泌和免疫等多种调节功能。有关补肾药对老年机体免疫功能的影响有不少的报道，但主要以研究T细胞功能及IL-2活性为主。本课题是在肯定补肾益精方药固真方能改善老龄大鼠免疫功能的基础上〔2〕，进一步观察该方对老龄大鼠脾脏IL-2、IL-6基因表达的影响，从基因转录水平探讨固真方的免疫调节作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
, 百拇医药
SD雄性大鼠，分为三组。老龄用药组(24月龄)从21月龄起每天自由饮用成人口服剂量20倍的固真方饮料30ml/鼠，每周给药5d，共3个月；老年对照组(24月龄)和青年对照组(4月龄)均自由饮水。
1.2 中药方剂组成
固真方：由首乌，肉苁蓉，复盆子等6味中药组成并制成浸膏(上海中医药大学制药厂提供)，临用前将浸膏用冷开水配成饮料。
1.3 大鼠脾脏IL-2，IL-6的基因表达
检测IL-6基因表达的大鼠处死前3、6 h分别腹腔注射LPS 1 mg/kg体重。无菌杀鼠取脾脏，迅速放入液氮中备用。
用异硫氢酸胍/酚/氯仿一步法抽提大鼠脾脏组织总RNA〔3〕。
, 百拇医药 1.3.1 IL-2的基因表达〔4〕
采用Northern-Blot法。总RNA(40 μg)在甲醛变性胶中电泳2 h(2～4 v/cm)，变性胶置于20×SSC溶液中，总RNA从中洗脱出来聚集于硝酸纤维素滤膜，80 ℃烘膜2 h，放入杂交袋中，加入5 ml预杂交液(50%甲酰胺，6×SSC,2×Denhardts试剂，0.5%SDS，0.1 mg/ml变性的鱼精DNA)于42 ℃振荡4 h；加入〔α-32P〕dCTP标记好的IL-2 cDNA探针，42 ℃杂交18 h，弃杂交液。用2×SSC，0.1%SDS，室温洗膜；再用1×SSC，0.1%SDS，42 ℃洗膜；再用0.1%SDS 42 ℃洗膜，每次20 min，洗好的膜于暗盒中进行放射自显影，48 h后显影，定影。
1.3.2 IL-6基因表达
采用RT-PCR法检测〔5〕。使用1 μg总RNA，10×逆转录缓冲液(100 mM Tris-HCl,500 mM KCl,1%Triton x-100)2 μl，4×dNTPs(10 mM)2 μl，寡聚(dT)15引物(0.5 μg)1 μl，RNA酶抑制剂(20 U)0.5 μl，25 mM MgCl2 2 μl。AMV逆转录酶(12.5 U)0.5 μl，加DEPC水补足20 μl，混匀，42 ℃水浴30 min，95 ℃加热5 min灭活逆转录酶，-20℃保存待用(以上试剂均购自华美公司)，脾脏细胞总RNA逆转录产物0.5 μl(相当于25 ng总RNA)，TaqDNA聚合酶(1.25 U，华美公司)1 μl，上下游引物(各50 pM)2μl，4×dNTPs(各2.5 mM，Promega公司)4 μl，10×扩增缓冲液5 μl，加ddH2O补足50 μl，混匀，加30 μl液体石蜡(Gene公司)，置PCR热循环仪(PE公司)扩增，扩增条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，30个循环，72 ℃延伸3 min取10 μlPCR产物电泳，拍照。
, 百拇医药
表1PCR引物根据已发表的基因库及参考文献设计，由上海医科大学神经生物学国家重点实验室合成。GAPDH(三磷酸甘油醛脱氢酶)作为“看家基因”监控总RNA使用量，以消除不同样本之间的加样误差。
表1 大鼠细胞因子序列扩增与检测所用寡聚核苷酸引物
引物序列
预期长
度(bp)
IL-6〔6〕
上游
下游
TTCCCTACTTCACAAGTC
CTAGGTTTGCCGAGTAGA
, 百拇医药
567
GAPDH〔7〕
上游
下游
GAAGGTCGGTATCAACGGATTTGGC
GATGTGTAGGCCATGAGGTCCACCAC
983
2 结 果
2.1 样品组织总RNA抽提结果
见图1。由图1可见各个样品的电泳条带上均有清晰的28 S和18 S两条带，表明RNA抽提情况良好，基本上无降解，无污染。
, 百拇医药
图1 部分样品组织总RNA抽提结果
2.2 大鼠脾脏细胞IL-2基因表达
见图2。由图2可见青年组杂交带较老年组明显深，而老年用药组杂交带则深于老年组。
图2 固真方对大鼠脾脏细胞IL-2基因表达的影响
2.3 大鼠脾脏细胞IL-6基因表达
M：PCR标志(华美公司)分别为237、377、515、695、994、1 543个碱基对；a，b，c：青年组、老年组、老年用药组LPS腹腔注射3 h后，d，e，f：青年组、老年组、老年用药组LPS腹腔注射后6 h见图3。由图3可见各个样品GAPDH的扩增产物的量基本一致，说明各个样品加样基本无差异，从LPS刺激的不同时间段来看，老年组IL-6的基因扩增产物明显多于青年组，而老年用药组的IL-6基因扩增产物明显少于老年组，有接近青年组的趋势。
, 百拇医药
图3 固真方对大鼠脾脏细胞IL-6基因表达的影响
3 讨 论
老年机体抵抗力下降，易患感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等与衰老时免疫系统功能紊乱有关。衰老时免疫系统功能紊乱主要表现在两个方面：①CD5+/CD5-B细胞亚群比例失调，体内自身抗体比例增加，产生针对外源性的抗原的抗体的能力下降；②TH1/TH2 T细胞亚群比例失调，导致体内淋巴因子比例失调，TH1细胞分泌的淋巴因子如IL-2、IL-3等下降，而TH2细胞分泌的淋巴因子如IL-4、IL-6等增多〔8〕。
淋巴因子在机体的免疫反应过程中占有重要的地位，在维持免疫系统乃至整个机体的生理平衡中起着十分重要的作用。其中IL-2、IL-6是两种活性极强的免疫因子，生物活性极为广泛。两者分别是TH1、TH2细胞分泌的淋巴因子的代表，同时观察IL-2与IL-6的变化可以初步提示老年机体免疫功能衰退的情况。从我们的实验结果来看，老年组IL-2的基因表达比青年组低，IL-6的基因表达比青年组高，提示老龄大鼠体内有一定程度的免疫紊乱情况存在，与文献报导基本一致。
, 百拇医药
对于衰老的机理，祖国医学在长期的延缓衰老的研究中提出了许多学说，其中以肾精虚损最为重要，近年来应用的延缓衰老方剂也以补肾方药居多。有关补肾药改善机体免疫功能的报导很多，但主要以研究T细胞功能及IL-2活性为主。本课题从IL-2和IL-6的老年性变化着手探讨补肾方药对老年机体免疫功能的影响。实验结果提示老龄大鼠在喂饲固真方3个月后，同老年对照组相比，IL-2的基因表达增多；IL-6的基因表达下降，提示老年用药组体内细胞因子之间的比例趋向青年组，可见固真方具有一定程度纠正老年机体免疫功能紊乱的作用。
1 上海市教委科技基金资助项目(NO.96CJ01)
2 上海市长海医院中医科
作者简介：刘 颖，女，28岁，硕士，从事中医药延缓衰老进程的研究
4 参考文献
, http://www.100md.com
1 上海中医学院主编.中医学基础.上海：上海科技出版社，1978：14
2 章育正.固真胶囊对老年大鼠免疫功能的影响.上海中医学院学报，1990；4(1)：52
3 Chomczynski P，Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroforme extraction.Anal Biochem，1987；162：156
4 萨姆布鲁克 J，费里奇EF，曼尼阿蒂斯 T.分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫译.北京：北京科技出版社，1993：362-72
5 Oste C.Polymerase chain reaction.Biotechique，1988；6：162-167
, 百拇医药
6 Murthy PC，Crondin,Tares M.Induction of IL-6 in axotomazed sensory neurons.J Neurosci，1995；15：5 130
7 Tso JY，Sun XH,Reece KS et al.Isolation and characterization of rat and human glyceraldehyde 3-phsphate dehydrogenase cDNAs:genomic complexity and molecular evolution of the gene.Nucl Acids Res，1985；13：2 485
8 Weksler ME.Immune senescence and adrenal steroids:immune dysregulation and action of dehydroepiandrosterone in old animal.Eur J Clin Pharmacol，1993；45(suppl)：s21
〔1998-04-13收稿 1998-09-20修回〕, 百拇医药(刘 颖 赵伟康 凌昌全2 黄雪强2 潘瑞萍2)
单位：上海中医药大学生化教研室，上海 200032
关键词：固真方；免疫功能；IL-2；mRNA；IL-6；mRNA
990224 摘 要 目的 从基因转录水平与探讨固真方的免疫调节作用。方法 采用Northern Blot和PT-PCR技术。结果 老龄大鼠脾脏细胞IL-2 mRNA含量低于青龄鼠，IL-6 mRNA含量高于青龄鼠，老龄大鼠体内存在着一定程度的免疫功能紊乱情况；固真方能明显提高老龄大鼠脾脏细胞IL-2 mRNA含量，降低IL-6 mRNA含量。结论 固真方能纠正老年机体免疫功能紊乱，增强机体的抗病能力。
The effect of Guzhen Recipe on the modulation
, 百拇医药
of the immune function of senile rats
Liu Ying Zhao Weikang Ling Changquan et al
Dept.Of Biochemistry of Shanghai University of T.C.M,Shanghai 200032
The methods of Northern Blot and Rt-PCR were used to explore the effect of tonifying kidney prescription—Guzhen Recipe on immune function of senile rats of the gene transciption level.The results showed that as compared with young rats,the expression of Il-2 mRNA of senile rats is decreased while that of IL-6 mRNA is elevated,suggesting that the immunodysregulation exists in aged rats.However,Guzhen Recipe could strengthen the defensive ability.
, 百拇医药
Key words Guzhen Recipe Immunodysregulation IL-2 mRNA IL-6 mRNA
(Original paper see page 104)
中医理论认为“肾精”是产生“肾”各种生理功能最基本的物质基础。随着“肾精”虚衰人体逐渐衰老〔1〕，大量的现代研究表明，中医的“肾”包含着神经内分泌和免疫等多种调节功能。有关补肾药对老年机体免疫功能的影响有不少的报道，但主要以研究T细胞功能及IL-2活性为主。本课题是在肯定补肾益精方药固真方能改善老龄大鼠免疫功能的基础上〔2〕，进一步观察该方对老龄大鼠脾脏IL-2、IL-6基因表达的影响，从基因转录水平探讨固真方的免疫调节作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
, 百拇医药
SD雄性大鼠，分为三组。老龄用药组(24月龄)从21月龄起每天自由饮用成人口服剂量20倍的固真方饮料30ml/鼠，每周给药5d，共3个月；老年对照组(24月龄)和青年对照组(4月龄)均自由饮水。
1.2 中药方剂组成
固真方：由首乌，肉苁蓉，复盆子等6味中药组成并制成浸膏(上海中医药大学制药厂提供)，临用前将浸膏用冷开水配成饮料。
1.3 大鼠脾脏IL-2，IL-6的基因表达
检测IL-6基因表达的大鼠处死前3、6 h分别腹腔注射LPS 1 mg/kg体重。无菌杀鼠取脾脏，迅速放入液氮中备用。
用异硫氢酸胍/酚/氯仿一步法抽提大鼠脾脏组织总RNA〔3〕。
, 百拇医药 1.3.1 IL-2的基因表达〔4〕
采用Northern-Blot法。总RNA(40 μg)在甲醛变性胶中电泳2 h(2～4 v/cm)，变性胶置于20×SSC溶液中，总RNA从中洗脱出来聚集于硝酸纤维素滤膜，80 ℃烘膜2 h，放入杂交袋中，加入5 ml预杂交液(50%甲酰胺，6×SSC,2×Denhardts试剂，0.5%SDS，0.1 mg/ml变性的鱼精DNA)于42 ℃振荡4 h；加入〔α-32P〕dCTP标记好的IL-2 cDNA探针，42 ℃杂交18 h，弃杂交液。用2×SSC，0.1%SDS，室温洗膜；再用1×SSC，0.1%SDS，42 ℃洗膜；再用0.1%SDS 42 ℃洗膜，每次20 min，洗好的膜于暗盒中进行放射自显影，48 h后显影，定影。
1.3.2 IL-6基因表达
采用RT-PCR法检测〔5〕。使用1 μg总RNA，10×逆转录缓冲液(100 mM Tris-HCl,500 mM KCl,1%Triton x-100)2 μl，4×dNTPs(10 mM)2 μl，寡聚(dT)15引物(0.5 μg)1 μl，RNA酶抑制剂(20 U)0.5 μl，25 mM MgCl2 2 μl。AMV逆转录酶(12.5 U)0.5 μl，加DEPC水补足20 μl，混匀，42 ℃水浴30 min，95 ℃加热5 min灭活逆转录酶，-20℃保存待用(以上试剂均购自华美公司)，脾脏细胞总RNA逆转录产物0.5 μl(相当于25 ng总RNA)，TaqDNA聚合酶(1.25 U，华美公司)1 μl，上下游引物(各50 pM)2μl，4×dNTPs(各2.5 mM，Promega公司)4 μl，10×扩增缓冲液5 μl，加ddH2O补足50 μl，混匀，加30 μl液体石蜡(Gene公司)，置PCR热循环仪(PE公司)扩增，扩增条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，30个循环，72 ℃延伸3 min取10 μlPCR产物电泳，拍照。
, 百拇医药
表1PCR引物根据已发表的基因库及参考文献设计，由上海医科大学神经生物学国家重点实验室合成。GAPDH(三磷酸甘油醛脱氢酶)作为“看家基因”监控总RNA使用量，以消除不同样本之间的加样误差。
表1 大鼠细胞因子序列扩增与检测所用寡聚核苷酸引物
引物序列
预期长
度(bp)
IL-6〔6〕
上游
下游
TTCCCTACTTCACAAGTC
CTAGGTTTGCCGAGTAGA
, 百拇医药
567
GAPDH〔7〕
上游
下游
GAAGGTCGGTATCAACGGATTTGGC
GATGTGTAGGCCATGAGGTCCACCAC
983
2 结 果
2.1 样品组织总RNA抽提结果
见图1。由图1可见各个样品的电泳条带上均有清晰的28 S和18 S两条带，表明RNA抽提情况良好，基本上无降解，无污染。
, 百拇医药
图1 部分样品组织总RNA抽提结果
2.2 大鼠脾脏细胞IL-2基因表达
见图2。由图2可见青年组杂交带较老年组明显深，而老年用药组杂交带则深于老年组。
图2 固真方对大鼠脾脏细胞IL-2基因表达的影响
2.3 大鼠脾脏细胞IL-6基因表达
M：PCR标志(华美公司)分别为237、377、515、695、994、1 543个碱基对；a，b，c：青年组、老年组、老年用药组LPS腹腔注射3 h后，d，e，f：青年组、老年组、老年用药组LPS腹腔注射后6 h见图3。由图3可见各个样品GAPDH的扩增产物的量基本一致，说明各个样品加样基本无差异，从LPS刺激的不同时间段来看，老年组IL-6的基因扩增产物明显多于青年组，而老年用药组的IL-6基因扩增产物明显少于老年组，有接近青年组的趋势。
, 百拇医药
图3 固真方对大鼠脾脏细胞IL-6基因表达的影响
3 讨 论
老年机体抵抗力下降，易患感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等与衰老时免疫系统功能紊乱有关。衰老时免疫系统功能紊乱主要表现在两个方面：①CD5+/CD5-B细胞亚群比例失调，体内自身抗体比例增加，产生针对外源性的抗原的抗体的能力下降；②TH1/TH2 T细胞亚群比例失调，导致体内淋巴因子比例失调，TH1细胞分泌的淋巴因子如IL-2、IL-3等下降，而TH2细胞分泌的淋巴因子如IL-4、IL-6等增多〔8〕。
淋巴因子在机体的免疫反应过程中占有重要的地位，在维持免疫系统乃至整个机体的生理平衡中起着十分重要的作用。其中IL-2、IL-6是两种活性极强的免疫因子，生物活性极为广泛。两者分别是TH1、TH2细胞分泌的淋巴因子的代表，同时观察IL-2与IL-6的变化可以初步提示老年机体免疫功能衰退的情况。从我们的实验结果来看，老年组IL-2的基因表达比青年组低，IL-6的基因表达比青年组高，提示老龄大鼠体内有一定程度的免疫紊乱情况存在，与文献报导基本一致。
, 百拇医药
对于衰老的机理，祖国医学在长期的延缓衰老的研究中提出了许多学说，其中以肾精虚损最为重要，近年来应用的延缓衰老方剂也以补肾方药居多。有关补肾药改善机体免疫功能的报导很多，但主要以研究T细胞功能及IL-2活性为主。本课题从IL-2和IL-6的老年性变化着手探讨补肾方药对老年机体免疫功能的影响。实验结果提示老龄大鼠在喂饲固真方3个月后，同老年对照组相比，IL-2的基因表达增多；IL-6的基因表达下降，提示老年用药组体内细胞因子之间的比例趋向青年组，可见固真方具有一定程度纠正老年机体免疫功能紊乱的作用。
1 上海市教委科技基金资助项目(NO.96CJ01)
2 上海市长海医院中医科
作者简介：刘 颖，女，28岁，硕士，从事中医药延缓衰老进程的研究
4 参考文献
, http://www.100md.com
1 上海中医学院主编.中医学基础.上海：上海科技出版社，1978：14
2 章育正.固真胶囊对老年大鼠免疫功能的影响.上海中医学院学报，1990；4(1)：52
3 Chomczynski P，Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroforme extraction.Anal Biochem，1987；162：156
4 萨姆布鲁克 J，费里奇EF，曼尼阿蒂斯 T.分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫译.北京：北京科技出版社，1993：362-72
5 Oste C.Polymerase chain reaction.Biotechique，1988；6：162-167
, 百拇医药
6 Murthy PC，Crondin,Tares M.Induction of IL-6 in axotomazed sensory neurons.J Neurosci，1995；15：5 130
7 Tso JY，Sun XH,Reece KS et al.Isolation and characterization of rat and human glyceraldehyde 3-phsphate dehydrogenase cDNAs:genomic complexity and molecular evolution of the gene.Nucl Acids Res，1985；13：2 485
8 Weksler ME.Immune senescence and adrenal steroids:immune dysregulation and action of dehydroepiandrosterone in old animal.Eur J Clin Pharmacol，1993；45(suppl)：s21
〔1998-04-13收稿 1998-09-20修回〕, 百拇医药(刘 颖 赵伟康 凌昌全2 黄雪强2 潘瑞萍2)