自体肿瘤细胞药敏检测指导膀胱癌术后化疗
作者：唐 伟 谯体义 陈在贤 汤为学
单位：重庆医科大学临床学院泌尿外科(唐 伟 谯体义 陈在贤)；重庆医科大学基础医学院病理生理教研室(汤为学)
关键词：膀胱移行细胞癌；肿瘤单细胞悬液；细胞毒试验；MTT法
重庆医学990206
摘 要 为了针对同一病理肿瘤不同个体术后选择性应用最为敏感的化疗药物，我们对1992年1月～1996年12月收治的36例膀胱移行细胞癌患者术中取出的活体标本制成单细胞悬液，对其行化疗药物敏感性检测。结果显示：同一病理级别膀胱癌对各种抗癌药物敏感性不同；单药总体敏感率与病理分级明显相关，二药联合应用随分级增加其敏感性明显高于单药。根据药敏结果进行治疗，37例病人一年复发仅3例。体外药敏实验结果能指导临床用药，而且疗效较满意。
, http://www.100md.com Guiding Postoperative Chemotherapy of Bladder Cancer
With Drug Sensitivity Test of Autologous Tumor Cell
Dept of Urology,The College of Clinical Medicine,Chongqing
University of Medical Sciences,Chongqing 400016
Tang Wer,et al
Abstract:In order to select the most sensitive chemotherapy drugs for posfoperatively treating the same kind of tumor in different individuals,the tumor samples taken from 37 cases of transitional cell carcinoma of bladder treated from January 1992 to December 1996,were investigated with MTT method.The results showed that the drug sensitivity of the same pathological grade of these carcinomas was different;there was significant relation between the total sensitivity of one kind of drug and the pathological grade;a combining use of two drugs showed more sensitive than sing drug along with the increase of tumor grade.37 patients received treatment on the basis of sensitivity test,only 3 of them bad their cancer recurred.We consider that in vitro drug sensitivity test could guide clinical vse of drug to get satisfactory efficacy.
, 百拇医药
Key words: Transitinal cell carcinoma Monocell suspension Cytotoxic test MTT
膀胱移行细胞癌术后化疗药物的选择往往是基于临床医生的经验，因此疗效不一，复发率较高。为了提高化疗效果，延长病人存活时间，我们采用MTT法体外抗癌药物敏感性试验以筛选敏感化疗药物，指导临床用药。现将结果报道如下：
材料与方法
一、材料
1.肿瘤细胞的来源：手术切除的37例膀胱癌病人的肿瘤组织，病理活体组织类型均为膀胱移行细胞癌，浸润深度：均未累及肌层。细胞分级：Ⅰ级20例，Ⅱ级14例，Ⅲ级3例，年龄41～92岁，男性33例，女性4例。
2.培养液：①不完全培养液；②完全培养液。
, http://www.100md.com
3.试剂：MTT(sigma)液，二甲亚砜(DMSO)；抗癌药物：噻替派(CBDCA)，长春新碱(VCR)，丝裂霉素(MMC)，5-氟尿嘧啶(5-Fu)，顺铂(CDDP)，阿霉素(ADM)，放线菌素D(Act-D)，足叶乙甙(VP16)。
4.96孔无菌培养板。
二、方法[1]
1.首先制备肿瘤单细胞悬液，然后按细胞浓度1～5×104个/孔种植于96孔培养板上，每孔体积为200ul。
2.膀胱肿瘤细胞毒性试验：在上述96孔板中实验设试剂对照组(8个平行孔)，肿瘤细胞阴性对照组(8个平行孔)，各种抗癌药物试验组(每种药物有3个平行孔)，每孔加药量为20ul，最终浓度为各抗癌药物血峰浓度的十分之一[2]。在特定条件下培养68个小时，离心，然后每孔加入不完全培养液200ul，MTT(5mg/ml)20ul，继续培养4小时，再离心，每孔加DMSO200ul，振荡5min，用600nm波长在自动酶标读数仪上进行比色，测出每孔光密度值(OD)。
, 百拇医药
三、计算：
肿瘤细胞存活率=(试验组平均OD值)/(肿瘤细胞阴性对照组平均OD值)×100%
四、判断：肿瘤细胞存活率：<30%为敏感药物，30～50%为中度敏感药物，>50%为不敏感药物。
五、给药原则与途径：单一药物给药途径均采用经尿道灌注，两种药物联合应用者分别采用局部灌注+静脉给药；若体外药敏试验显示对多种药物均敏感者，仅选择其中一种药物；单药或双药均敏感者，选择单药治疗。根据肿瘤病理分级：Ⅰ级均采用局部灌注，Ⅱ级分别采用局部或局部+静脉给药，Ⅲ级全部采用局部加静脉给药方式。
结 果
一、八种抗癌药物单用时最敏感的药物是CDDP，总敏感率为59.5%。
二、两药联合用药时对膀胱癌最敏感的药物是CDDP+VP16(64.7%)，CDDP+MMC(48.6%)。
, 百拇医药
三、单药与两药联合用药对膀胱癌总体敏感率与细胞病理分级关系：单药组总体敏感率与病理级别有显著相关性，χ2检验P>0.01；二药联合用药组总体敏感率与病理级别无显著相关性，χ2检验P>0.05。联合用药组总体敏感率明显高于单药组，χ2检验P<0.025。二药联合用药随着细胞分级增加敏感性明显高于单药组。见表1。
四、药敏治疗与疗效关系：见表2。
20例Ⅰ级病例单药治疗仅1例复发占5%；6例Ⅱ级病例单药治疗中2例复发占33.3%；8例Ⅱ级病例及3例Ⅲ级病例联合用药无1例复发。
1年总复发率8.1%(3/37)。
表1 单药与联合用药对膀癌总体敏感率.与细胞分级关系
, http://www.100md.com Ⅰ级(20例)
Ⅱ级(14例)
Ⅲ级(3例)
合计(37例)
单药
15(75%)
7(50%)
1(33.3%)
23(62.2%)
联合
17(95%)
12(85.7%)
, 百拇医药 2(66.6%)
33(89.2)
.注：标本数与总标本数的比值。表2 药敏治疗与疗效关系 药物
Ⅰ级(20例)
Ⅱ级(14例)
Ⅲ级(3例)
敏感例数
治疗
例数
治疗
方式
1年复
, http://www.100md.com
发例数
敏感
例数
治疗
例数
治疗
方式
1年复
发例数
敏感
例数
治疗
例数
治疗
, 百拇医药
方式
1年复
发例数
单药CDDP
12
10
局部
7
2
局部
1
-
CBDCA
1
, 百拇医药
1
局部
1
2
2
局部
2
MMC
6
6
局部
2
2
局部
, 百拇医药
1
-
ADM
3
2
局部
1
-
-
VP16
1
-
2
-
, http://www.100md.com
-
5FU
2
-
-
-
VCR
1
1
局部
-
-
Act-D
1
, 百拇医药
-
2
-
-
联合用药
CDDP+VP16
14
-
8
-
2
-
CDDP+MMC
, 百拇医药
8
-
8
8
局
+
全
2
2
局
+
全
CDDP+CBD
5
, 百拇医药
-
3
-
1
1
局
+
全
CA
讨 论
1983年Mosman首先将MTT法用于细胞毒试验的检测[3]，目前该法广泛用于体外抗癌药物敏感试验。活细胞(红细胞除外)中线粒体脱氢酶对可溶性MTT分解、转化、产生一种兰紫色结晶物-甲FDA1 。甲FDA1溶解于DMSO中变成紫红色溶液，在600nm波长中进行测定，它的颜色与活细胞成正比，因此根据OD值可反映存活细胞变化，从而推算出肿瘤细胞在抗癌药物中的存活率。肿瘤细胞存活率越低，说明此种化疗药物对肿瘤细胞杀伤力越强，即敏感性越高，反之则敏感性越低[4]。1986年Heeg和1987年Carmichael分别就MTT法与其它方法进行了比较，1990年Wislon和1991年Cammpling分别用MTT法对卵巢癌和小细胞性肺癌进行体外药敏试验，得出MTT法具有快速、简便、灵敏性高、其实验结果与临床疗效之间有良好的吻合民性等优点，因而受到重视[5]。
, 百拇医药
从实验结果以及表1不难看出，单一用药，肿瘤细胞对CDDP、MMC最为敏感，总体敏感率分别为54.1与34.3%；联合用药则以CDDP+VP16(64.7%)和CDDP+MMC(48.6%)敏感性最高，其它单药或联合用药敏感例数明显下降。单药组总体敏感率与细胞病理分级显著相关，各级间有显著差异，χ2检测P<0.01；联合用药组总体敏感率明显高于单药组总体敏感率，χ2检测P<0.025；联合用药组总体敏感率在各细胞分级间无显著差别，χ2检测P>0.05，但随着细胞分级增加，联合用药组敏感率明显高于单一用药组。因此从本试验的结果来看，我们认为膀胱肿瘤术后化疗药物的选择应根据其药物敏感试验来进行。本组Ⅱ级以上17例，其中11例采用局部+静脉给药，无1例复发，提示细胞分级较高者，应尽量选择联合用药方式。这无疑也对于那些无条件做药敏地区的医生在术后选择用药上提供一个很好的参考。
本组37例患者术后化疗用药选择均根据药敏试验结果，选其敏感性药物。经近期临床随访统计37例患者1年复发3例，总体复发率为8.1%。有文献报道：随机选择噻替哌膀胱灌注化疗后其复发率为20%[6]。目前临床认为较好的BCG预防膀胱癌术后复发的效果一般也在8%～37%[7]。而本组经敏感试验筛选后针对性用药的病例，其复发率为8.1%，较其它报道低，说明筛选用药有指导作用。
, 百拇医药
日本富田腾郎研究体外药敏试验与体内临床用药，不敏感相符合率为90%[2]；美国Salmon等研究体外药敏试验与体内临床用药不敏感相符合率为90%[8]。说明体外药敏预测为不敏感的药物，体内几乎也是不敏感的，因此，对药敏试验不敏感的抗癌药物不宜选用。
由此看来，化疗药物敏感试验对临床选用化疗药物有指导价值，有助于临床医生合理用药产工有效地发挥化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力，降低肿瘤复发率和延长患者生命。 参考文献
1 汤为学，骆云鹏，王瑞雪.人实体瘤的抗癌药物敏感试验(MTT)法建立.重庆医科大学学报，1992，17(2)：103
2 富田滕郎，下畸英二，屋弘行.Improvement of Human Tumor Clonogenic Assay Using Cell Culture in soft part srarcoma of the Extremity.日本癌治疗会志，1989，24(1)：83-93
, 百拇医药
3 Tin mosmann.Rapid colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival:Application to proliferation and Cytotoxicity Assays.Journal of immunological methods,1983,65(1-2)：55
4 Daniel D.Von Hoff,James Casper,Edward Bradier,et al.Association between numan tumor colony-forming assay results and response of an individual patient's tumor to chemotherapy.Am J Med,1981,70(5):1027
5 Sargent JM,Taylor CG.Appraisal of the MTT assay as a rapid test of chemosensitivity in acnt myeloid leukaemia.Br J Cancer,1989,60(2):206
6 张思孝，杨宇如，刘晓雪等.膀胱肿瘤452例分析.中华泌尿外科杂志，1986，7：25
7 孟荟，唐涌志，张仁国.免疫剂预防表浅膀胱肿瘤的评价.中华泌尿外科杂志，1986，7：32
8 Salmon.S.E,Alberts D.S,May skens F.L,et al.Clinical correlation of in vitro drug sensitivity.In:Cloning of human tumor stem cells.Salmon.S.E,(ed),Alan R,Liss,Inc,1980,pp:233-245, 百拇医药
单位：重庆医科大学临床学院泌尿外科(唐 伟 谯体义 陈在贤)；重庆医科大学基础医学院病理生理教研室(汤为学)
关键词：膀胱移行细胞癌；肿瘤单细胞悬液；细胞毒试验；MTT法
重庆医学990206
摘 要 为了针对同一病理肿瘤不同个体术后选择性应用最为敏感的化疗药物，我们对1992年1月～1996年12月收治的36例膀胱移行细胞癌患者术中取出的活体标本制成单细胞悬液，对其行化疗药物敏感性检测。结果显示：同一病理级别膀胱癌对各种抗癌药物敏感性不同；单药总体敏感率与病理分级明显相关，二药联合应用随分级增加其敏感性明显高于单药。根据药敏结果进行治疗，37例病人一年复发仅3例。体外药敏实验结果能指导临床用药，而且疗效较满意。
, http://www.100md.com Guiding Postoperative Chemotherapy of Bladder Cancer
With Drug Sensitivity Test of Autologous Tumor Cell
Dept of Urology,The College of Clinical Medicine,Chongqing
University of Medical Sciences,Chongqing 400016
Tang Wer,et al
Abstract:In order to select the most sensitive chemotherapy drugs for posfoperatively treating the same kind of tumor in different individuals,the tumor samples taken from 37 cases of transitional cell carcinoma of bladder treated from January 1992 to December 1996,were investigated with MTT method.The results showed that the drug sensitivity of the same pathological grade of these carcinomas was different;there was significant relation between the total sensitivity of one kind of drug and the pathological grade;a combining use of two drugs showed more sensitive than sing drug along with the increase of tumor grade.37 patients received treatment on the basis of sensitivity test,only 3 of them bad their cancer recurred.We consider that in vitro drug sensitivity test could guide clinical vse of drug to get satisfactory efficacy.
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Key words: Transitinal cell carcinoma Monocell suspension Cytotoxic test MTT
膀胱移行细胞癌术后化疗药物的选择往往是基于临床医生的经验，因此疗效不一，复发率较高。为了提高化疗效果，延长病人存活时间，我们采用MTT法体外抗癌药物敏感性试验以筛选敏感化疗药物，指导临床用药。现将结果报道如下：
材料与方法
一、材料
1.肿瘤细胞的来源：手术切除的37例膀胱癌病人的肿瘤组织，病理活体组织类型均为膀胱移行细胞癌，浸润深度：均未累及肌层。细胞分级：Ⅰ级20例，Ⅱ级14例，Ⅲ级3例，年龄41～92岁，男性33例，女性4例。
2.培养液：①不完全培养液；②完全培养液。
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3.试剂：MTT(sigma)液，二甲亚砜(DMSO)；抗癌药物：噻替派(CBDCA)，长春新碱(VCR)，丝裂霉素(MMC)，5-氟尿嘧啶(5-Fu)，顺铂(CDDP)，阿霉素(ADM)，放线菌素D(Act-D)，足叶乙甙(VP16)。
4.96孔无菌培养板。
二、方法[1]
1.首先制备肿瘤单细胞悬液，然后按细胞浓度1～5×104个/孔种植于96孔培养板上，每孔体积为200ul。
2.膀胱肿瘤细胞毒性试验：在上述96孔板中实验设试剂对照组(8个平行孔)，肿瘤细胞阴性对照组(8个平行孔)，各种抗癌药物试验组(每种药物有3个平行孔)，每孔加药量为20ul，最终浓度为各抗癌药物血峰浓度的十分之一[2]。在特定条件下培养68个小时，离心，然后每孔加入不完全培养液200ul，MTT(5mg/ml)20ul，继续培养4小时，再离心，每孔加DMSO200ul，振荡5min，用600nm波长在自动酶标读数仪上进行比色，测出每孔光密度值(OD)。
, 百拇医药
三、计算：
肿瘤细胞存活率=(试验组平均OD值)/(肿瘤细胞阴性对照组平均OD值)×100%
四、判断：肿瘤细胞存活率：<30%为敏感药物，30～50%为中度敏感药物，>50%为不敏感药物。
五、给药原则与途径：单一药物给药途径均采用经尿道灌注，两种药物联合应用者分别采用局部灌注+静脉给药；若体外药敏试验显示对多种药物均敏感者，仅选择其中一种药物；单药或双药均敏感者，选择单药治疗。根据肿瘤病理分级：Ⅰ级均采用局部灌注，Ⅱ级分别采用局部或局部+静脉给药，Ⅲ级全部采用局部加静脉给药方式。
结 果
一、八种抗癌药物单用时最敏感的药物是CDDP，总敏感率为59.5%。
二、两药联合用药时对膀胱癌最敏感的药物是CDDP+VP16(64.7%)，CDDP+MMC(48.6%)。
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三、单药与两药联合用药对膀胱癌总体敏感率与细胞病理分级关系：单药组总体敏感率与病理级别有显著相关性，χ2检验P>0.01；二药联合用药组总体敏感率与病理级别无显著相关性，χ2检验P>0.05。联合用药组总体敏感率明显高于单药组，χ2检验P<0.025。二药联合用药随着细胞分级增加敏感性明显高于单药组。见表1。
四、药敏治疗与疗效关系：见表2。
20例Ⅰ级病例单药治疗仅1例复发占5%；6例Ⅱ级病例单药治疗中2例复发占33.3%；8例Ⅱ级病例及3例Ⅲ级病例联合用药无1例复发。
1年总复发率8.1%(3/37)。
表1 单药与联合用药对膀癌总体敏感率.与细胞分级关系
, http://www.100md.com Ⅰ级(20例)
Ⅱ级(14例)
Ⅲ级(3例)
合计(37例)
单药
15(75%)
7(50%)
1(33.3%)
23(62.2%)
联合
17(95%)
12(85.7%)
, 百拇医药 2(66.6%)
33(89.2)
.注：标本数与总标本数的比值。表2 药敏治疗与疗效关系 药物
Ⅰ级(20例)
Ⅱ级(14例)
Ⅲ级(3例)
敏感例数
治疗
例数
治疗
方式
1年复
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发例数
敏感
例数
治疗
例数
治疗
方式
1年复
发例数
敏感
例数
治疗
例数
治疗
, 百拇医药
方式
1年复
发例数
单药CDDP
12
10
局部
7
2
局部
1
-
CBDCA
1
, 百拇医药
1
局部
1
2
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局部
2
MMC
6
6
局部
2
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局部
, 百拇医药
1
-
ADM
3
2
局部
1
-
-
VP16
1
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5FU
2
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VCR
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局部
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Act-D
1
, 百拇医药
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联合用药
CDDP+VP16
14
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8
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CDDP+MMC
, 百拇医药
8
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局
+
全
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局
+
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CDDP+CBD
5
, 百拇医药
-
3
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1
1
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+
全
CA
讨 论
1983年Mosman首先将MTT法用于细胞毒试验的检测[3]，目前该法广泛用于体外抗癌药物敏感试验。活细胞(红细胞除外)中线粒体脱氢酶对可溶性MTT分解、转化、产生一种兰紫色结晶物-甲FDA1 。甲FDA1溶解于DMSO中变成紫红色溶液，在600nm波长中进行测定，它的颜色与活细胞成正比，因此根据OD值可反映存活细胞变化，从而推算出肿瘤细胞在抗癌药物中的存活率。肿瘤细胞存活率越低，说明此种化疗药物对肿瘤细胞杀伤力越强，即敏感性越高，反之则敏感性越低[4]。1986年Heeg和1987年Carmichael分别就MTT法与其它方法进行了比较，1990年Wislon和1991年Cammpling分别用MTT法对卵巢癌和小细胞性肺癌进行体外药敏试验，得出MTT法具有快速、简便、灵敏性高、其实验结果与临床疗效之间有良好的吻合民性等优点，因而受到重视[5]。
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从实验结果以及表1不难看出，单一用药，肿瘤细胞对CDDP、MMC最为敏感，总体敏感率分别为54.1与34.3%；联合用药则以CDDP+VP16(64.7%)和CDDP+MMC(48.6%)敏感性最高，其它单药或联合用药敏感例数明显下降。单药组总体敏感率与细胞病理分级显著相关，各级间有显著差异，χ2检测P<0.01；联合用药组总体敏感率明显高于单药组总体敏感率，χ2检测P<0.025；联合用药组总体敏感率在各细胞分级间无显著差别，χ2检测P>0.05，但随着细胞分级增加，联合用药组敏感率明显高于单一用药组。因此从本试验的结果来看，我们认为膀胱肿瘤术后化疗药物的选择应根据其药物敏感试验来进行。本组Ⅱ级以上17例，其中11例采用局部+静脉给药，无1例复发，提示细胞分级较高者，应尽量选择联合用药方式。这无疑也对于那些无条件做药敏地区的医生在术后选择用药上提供一个很好的参考。
本组37例患者术后化疗用药选择均根据药敏试验结果，选其敏感性药物。经近期临床随访统计37例患者1年复发3例，总体复发率为8.1%。有文献报道：随机选择噻替哌膀胱灌注化疗后其复发率为20%[6]。目前临床认为较好的BCG预防膀胱癌术后复发的效果一般也在8%～37%[7]。而本组经敏感试验筛选后针对性用药的病例，其复发率为8.1%，较其它报道低，说明筛选用药有指导作用。
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日本富田腾郎研究体外药敏试验与体内临床用药，不敏感相符合率为90%[2]；美国Salmon等研究体外药敏试验与体内临床用药不敏感相符合率为90%[8]。说明体外药敏预测为不敏感的药物，体内几乎也是不敏感的，因此，对药敏试验不敏感的抗癌药物不宜选用。
由此看来，化疗药物敏感试验对临床选用化疗药物有指导价值，有助于临床医生合理用药产工有效地发挥化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力，降低肿瘤复发率和延长患者生命。 参考文献
1 汤为学，骆云鹏，王瑞雪.人实体瘤的抗癌药物敏感试验(MTT)法建立.重庆医科大学学报，1992，17(2)：103
2 富田滕郎，下畸英二，屋弘行.Improvement of Human Tumor Clonogenic Assay Using Cell Culture in soft part srarcoma of the Extremity.日本癌治疗会志，1989，24(1)：83-93
, 百拇医药
3 Tin mosmann.Rapid colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival:Application to proliferation and Cytotoxicity Assays.Journal of immunological methods,1983,65(1-2)：55
4 Daniel D.Von Hoff,James Casper,Edward Bradier,et al.Association between numan tumor colony-forming assay results and response of an individual patient's tumor to chemotherapy.Am J Med,1981,70(5):1027
5 Sargent JM,Taylor CG.Appraisal of the MTT assay as a rapid test of chemosensitivity in acnt myeloid leukaemia.Br J Cancer,1989,60(2):206
6 张思孝，杨宇如，刘晓雪等.膀胱肿瘤452例分析.中华泌尿外科杂志，1986，7：25
7 孟荟，唐涌志，张仁国.免疫剂预防表浅膀胱肿瘤的评价.中华泌尿外科杂志，1986，7：32
8 Salmon.S.E,Alberts D.S,May skens F.L,et al.Clinical correlation of in vitro drug sensitivity.In:Cloning of human tumor stem cells.Salmon.S.E,(ed),Alan R,Liss,Inc,1980,pp:233-245, 百拇医药